Roczniki Akademii Rolniczej w Poznaniu CCCLXXXIII (2007) MAŁGORZATA KORBIN, SYLWIA KELLER-PRZYBYŁKOWICZ, EDWARD ŻURAWICZ WYSTĘPOWANIE WYBRANYCH GENÓW ODPORNOŚCI NA PARCH JABŁONI U ODMIAN I GATUNKÓW DZIKICH UŻYWANYCH W PROGRAMACH HODOWLANYCH JABŁONI Z Zakładu Hodowli Roślin Sadowniczych Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach ABSTRACT. Screening of cultivars from apple breeding programme for the presence of genes coding resistance to apple scab was conducted in the Research Institute of Pomology and Floriculture in Skierniewice. The Vbj-gene (source: resistant Malus baccata jackii) was identified in all plants independently on the level of tolerance/susceptibility to this disease. The Vf-related fragment (source: M. floribunda 821) was also recognized in majority of tested plants, and only three cvs ( Antonówka Zwykła, Red Rome and Rome Spur ) do not seem to be the donors of this gene. Key words: apple, apple scab, resistance genes, screening Wstęp Parch jabłoni, powodowany przez Venturia inaequalis, jest jedną z najgroźniejszych chorób jabłoni. Patogen osłabia siłę wzrostu rośliny oraz poważnie uszkadza owoce, zmniejszając tym samym plon. Niemal wszystkie odmiany jabłoni uprawiane dla potrzeb komercyjnych na świecie są podatne na tę chorobę. Program ochrony jabłoni przed parchem obejmuje 12-15 oprysków pestycydami rocznie, co znacząco podnosi koszty produkcji. Alternatywą jest wprowadzanie do uprawy nowych odmian, charakteryzujących się odpornością na V. inaequalis, ale zastosowanie takiej strategii wymaga znacznej wiedzy na temat donorów cechy odporności na tego patogena i mechanizmu tego procesu. Analiza odmian jabłoni pod kątem obecności wszystkich genów, znanych jako warunkujące odporność na parch jabłoni, prowadzona w Instytucie Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach, ma na celu wyodrębnienie genotypów będących potencjalnie najlepszymi formami wyjściowymi dla hodowli odpornościowej. W niniejszej pracy przedstawiamy dane dotyczące screeningu na obecność dwóch genów typowych dla gatunków dzikich, tj. genu Vf i Vbj. Rocz. AR Pozn. CCCLXXXIII, Ogrodn. 41: 321-325 Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań 2007 PL ISSN 0137-1738
322 M. Korbin, S. Keller-Przybyłkowicz, E. Żurawicz Materiał i metody Materiał roślinny stanowiły rośliny odmiany McIntosh znanej z bardzo dużej podatności na zakażenie przez parcha jabłoni, rośliny 13 odmian mniej wrażliwych na tę chorobę ( Retina, Rubinola, Ariwa, J-79, Rajka, Melfree, Early Freegold, Free Redstar, Topaz, Gold Rush, Antonówka Zwykła, Red Rome i Rome Spur ) oraz rośliny odpornych gatunków dzikich Malus floribunda 821 i M. baccata jackii (jedna roślina karłowa K). Rośliny odmian uprawnych i M. floribunda 821 pochodziły w kolekcji ISK. Rośliny M. baccata rosły na trawnikach w dwóch rejonach Skierniewic. Z każdego z wytypowanych genotypów pobrano po 2 próby (2 g świeżych liści), z których izolowano materiał genetyczny (DNA). DNA izolowano metodą Aldricha i Cullisa (1993). Czystość uzyskanych preparatów DNA oceniano spektrofotometrycznie i na żelu agarozowym. Wyizolowany DNA służył jako matryca w PCR. Startery SCAR do PCR zsyntetyzowano na podstawie sekwencji genów Vf i Vbj oznaczonych na mapie genomu jabłoni (Patocci i in. 1999, Xu i Korban 2000, Gygax i in. 2004, Huaracha i in. 2004). Do amplifikacji genu Vf zastosowano startery: a) ACS-3 (taagaccccacttgtttttggcatg/gaattcagagtttagtctttcaatt), b) ACS-7 (gtgccaatgtaatcagagtgacgtg/atgtaggtggtgatgtatctggatt), c) ACS-9 (acatggaagatgaaggagaaggag/gataaattgagtgactgcaaagcg). Do amplifikacji genu Vbj użyto starterów: a) K08 (gaacactgggcaaaggaaac/taaaagccacgttctctcgc), b) T06 (cgttcaactcataagtggtcc/aagggcagaatgataaaagcc), c) Z13 (ccctagcatgccataaaacc/cccagtggaatatttcgagg). Reakcję amplifikacji przeprowadzono w termocyklerze PTC-200 MJ Research (35 cykli). Mieszanina reakcyjna (13 μl) zawierała 3 ng genomowego DNA, 5U Taq Polimerazy Platinium w 10x PCR-buforze z 10 mm MgCl 2 (Invitrogen) i 5 mm każdego startera. Profile termiczne PCR różniły się w zależności od zastosowanych starterów: dla starterów ACS 94 C przez 30 s, 65 C przez 30 s i 72 C przez 60 s, dla starterów K08 i Z13 94 C przez 30 s, 67 C przez 30 s, 72 C przez 60 s, dla starterów T06 94 C przez 30 s, 60 C przez 30 s i 72 C przez 60 s. Produkty PCR były rozdzielane w 1-procentowym żelu agarozowym, wybarwiane bromkiem etydyny i wizualizowane w świetle UV. Wielkość produktów oceniano przez porównanie z DNA faga λ trawionego enzymami restrykcyjnymi EcoR I i Hind III (Frementas). Wyniki i dyskusja W wyniku reakcji ze starterami SCAR, zsyntetyzowanymi na podstawie sekwencji genu Vbj z mapy genomu jabłoni, uzyskano produkty PCR o spodziewanej długości 743 (K0-8) i 773 pz (Z-13) (ryc. 1 a, b). Produkt o długości około 740 pz był obserwowany w próbkach DNA roślin M. baccata jackii, będącej donorem genu Vbj, oraz w DNA roślin Retina, Ariwa, J-79, Melfree, Early Freegold, Free Redstar, Gold Rush, Antonówka Zwykła, Red Rome i Rome Spur, znanych jako względnie tolerancyjne na parch jabłoni. Jednocześnie fragment DNA o tej samej długości wykryto w roślinie M. floribunda 821, będącej donorem genu Vf oraz w bardzo wrażliwej na porażenie przez V. inaequalis odmiany McIntosh.
Występowanie wybranych genów odporności... 323 a) 900pz 831pz 743pz b) 870pz 773 c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 118pz d) 118pz e) Ryc. 1. Elektroforogram produktów uzyskanych w reakcjach PCR ze starterami: a K-08, b Z-13, c ACS-03, d ACS-07, e ACS-09. Próbki: 1 Retina, 2 Rubinola, 3 Ariwa, 4 J-79, 5 Rajka, 6 Melfree, 7 Early Freegold, 8 Free Redstar, 9 Topaz, 10 Gold Rush, 11 Antonówka Zwykła, 12 Red Rome, 13 Rome Spur, 14 Malus floribunda 821, 15 McIntosh, 16 M. baccata jackii K, 17 M. baccata jackii Fig. 1. Electrophorogram of products generated in PCR with primers: a K-08, b Z-13, c ACS-03, d ACS-07, e ACS-09. Lines: 1 Retina, 2 Rubinola, 3 Ariwa, 4 J-79, 5 Rajka, 6 Melfree, 7 Early Freegold, 8 Free Redstar, 9 Topaz, 10 Gold Rush, 11 Antonowka Zwykła, 12 Red Rome, 13 Rome Spur, 14 Malus floribunda 821, 15 McIntosh, 16 M. baccata jackii K, 17 M. baccata jackii
324 M. Korbin, S. Keller-Przybyłkowicz, E. Żurawicz Produktu 743 pz nie obserwowano w reakcjach przeprowadzonych na matrycy DNA roślin Rubinola, Rajka i Topaz. W reakcji z tym samym starterem uzyskano natomiast (także dla roślin Retina, Ariwa, Early Freegold, Free Redstar, Gold Rush ) produkt o długości 900 pz., prawdopodobnie zamplifikowany drugi locus genu Vbj (Gygax i in. 2004). Podobnie w reakcji ze starterem Z-13 produkt o oczekiwanej długości 773 pz obserwowano dla próbek z DNA roślin Early Freegold, Topaz, Gold Rush, Red Rome, Rome Spur, McIntosh oraz M. floribunda 821, podczas gdy drugi produkt (drugi locus) o długości 870 pz był widoczny dla próbek Ariwa, Rajka, Melfree, Topaz, Gold Rush, M. floribunda 821 oraz karłowej odmiany M. baccata K. Uzyskane wyniki wskazują, iż wszystkie z wymienionych roślin są donorami fragmentu odpowiadającego sekwencji Vbj, ale nie we wszystkich roślinach obserwuje się jego ekspresję. W reakcjach ze starterami SCAR specyficznymi dla dominującego genu Vf produktów PCR nie obserwowano w ogóle na matrycy DNA z roślin Antonówka Zwykła, Red Rome i Rome Spur. Dla bardzo podatnej na parch jabłoni odmiany McIntosh nie stwierdzono produktów w reakcji ze starterami ACS-03 i ACS-09, natomiast w reakcji ze starterem ACS-07 widoczny był produkt o spodziewanej długości około 260 pz (ryc. 1 c, d, e). Z badanych genotypów tylko trzy odmiany Antonówka Zwykła, Red Rome i Rome Spur wydają się, mimo ich względnej tolerancji na parch w warunkach polowych, nie być nośnikami genu Vf. Obecność obydwu genów odporności Vf i Vbj w obu odpornych gatunkach dzikich jak też w odmianach wykazujących różny stopień tolerancji bądź nawet podatność ( McIntosh ) na parch jabłoni potwierdza złożony charakter zjawiska odporności na tę chorobę. Jak dotychczas wykryto już 6 różnych fragmentów DNA sprzężonych z odpornością na zakażenie przez V. inaequalis (Gygax i in. 2004). Wskazuje to, wbrew pierwszym doniesieniom (Hough i in. 1953), na poligeniczność cechy i co za tym idzie, korelację między ekspresją wszystkich genów w całym układzie a rzeczywistą reakcją polową roślin. Literatura Aldrich J., Cullis C.A. (1993): RAPD analysis in flax. optimization of yield and reproducibility using Klen Taq 1 DNA polymerase, Chelex 100 and gel purification of genomic DNA. Plant Mol. Biol. Rep. 11: 128-141. Gygax M., Gianfranceschi L., Liebhard R., Kellerhaus M., Gessler C., Patocci A. (2004): Molecular markers linked to the apple scab resistance gene Vbj derived from Malus baccata jackii. Theor. Appl. Genet. 109: 1702-1709. Huaracha E., Xu M., Korban S. (2004): Narrowing down the region of the Vf locus for scab resistance in apple using AFLP-derived SCARS. Theor. Appl. Genet. 108: 274-279. Hough L.F., Williams E.B., Dayton D.F. (1953): Apple scab resistance from Malus floribunda Sieb. Am. Soc. Hort. Sci. 62: 341-347. Patocci A., Gianfranceschi L., Gesler C. (1999): Towards the map-based cloning of Vf fine and physical mapping of Vf region. Theor. Appl. Genet. 99: 1012-1017. Xu M.L., Korban S. (2000): Saturation mapping of the apple scab resistance gene Vf using AFLP markers. Theor. Appl. Genet. 101: 844-851.
Występowanie wybranych genów odporności... 325 THE OCCURRENCE OF SELECTED GENES CODING RESISTANCE TO APPLE SCAB IN POPULATION OF CULTIVATED VARIETIES AND WILD SPECIES USED IN APPLE BREEDING PROGRAMME Summary Thirteen cultivars with partial tolerance to apple scab, susceptible McIntosh and two wild, resistant species Malus floribunda 821 and Malus baccata jackii were analysed for the presence of genes coding resistance to Venturia inaequalis. Six primers were selected for isolation of DNA fragments connected with Vf and Vbj resistance genes. DNA fragments with expected size for the Vbj-gene were identified in all plants, meanwhile only genome of 3 cvs did not contain the Vf. The obtained results allowed to recognize donors of the analysed genes and confirm polygenic character of resistance to apple scab.