Endonukleazy restrykcyjne molekularne nożyczki
Inżynieria genetyczna nauka o technikach (narzędziach) biologii molekularnej pozwalających na świadomą i zamierzoną ingerencję w materiał genetyczny organizmów w celu wyizolowania i charakterystyki określonych fragmentów DNA (np. genów) oraz zmiany ich właściwości dziedzicznych Dzięki technikom inżynierii genetycznej możemy : izolować z komórki fragmenty materiału genetycznego (geny) powielać geny (klonowanie molekularne) i całe organizmy wprowadzać zmiany do informacji genetycznej przenosić fragmenty DNA (geny) do komórek innego organizmu
Nie należy utożsamiać inżynierii genetycznej z biotechnologią Biotechnologia to pojęcie szersze, obejmujące wszelkie manipulacje żywymi organizmami (zwłaszcza mikroorganizmami) w celu osiągnięcia określonych korzyści. Inżynieria genetyczna istnieje od ok. 40 lat, biotechnologia od niepamiętnych czasów Współczesna biotechnologia opiera się w dużej mierze na technikach inżynierii genetycznej. Dzięki nim możliwa jest: heterologiczna ekspresja genów kodujących określone białka zmiana (optymalizowanie) poziomu ekspresji konkretnego genu wprowadzanie celowych zmian sekwencji nukleotydowych powodujących zmiany aminokwasów a co za tym idzie modyfikacje właściwości białka, często ulepszenie funkcjonowania transgeneza bakterii, roślin i zwierząt organizmy genetycznie zmodyfikowane (GMO) terapia genowej
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja rekombinowanej insuliny w bakteriach Ekspresja ludzkiej insuliny w bakteriach Enzym restrykcyjny ludzkie cdna linker Zrekombinowane DNA plazmidowe Wektor plazmidowy Klonowanie molekularne bakteria chromosom Tranfsormacja rekombinowana insulina rekombinowana insulina
Aby manipulować materiałem genetycznym (np. genami) niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce). Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne, ligazy, wektory Wszelkie zabiegi na materiale genetycznym muszą rozpocząć się od jego wyizolowania z komórki. Cząsteczki DNA są następnie dzielone na mniejsze odcinki za pomocą enzymów restrykcyjnych w celu pozyskania konkretnych fragmentów DNA
1869 Odkrycie DNA (Miescher). 1944 Funkcja DNA: przechowywanie informacji genetycznej (Avery) 1953 Podwójna helisa - odkrycie struktury DNA (Crick, Watson) 1955 Arthur Kornberg wyizolował polimerazę DNA 1966 Odczytanie kodu genetycznego (Khorana, Nirenberg i in.) 1966 Weiss i Richardson wyizolowali ligazę DNA 1974 Początek inżynierii genetycznej: przeniesienie genu do bakterii (Boyer i in.)
Odkrycie enzymów restrykcyjnych 1962 r. Arber i Dussoix wyjaśnili zjawisko restrykcji ograniczenia rozwoju fagów w E. coli. Zidentyfikowali endonukleazę, która trawiła niechroniony ( o innym wzorcu metylacji) DNA. Metylacja charakterystyczna dla gospodarza bakteryjnego chroniła DNA przed restrykcją (trawieniem) 1968 r. Arber i Linn oczyścili enzym EcoB i wykazali jego działanie in vitro. Enzym ten trawił DNA E.coli K ale nie trawil E.coli B. 1968 r. Smith, Wilcox, Kelly (John Hopkins Univeristy) wyizolowali pierwszy enzym II klasy i określili charakterystykę miejsca rozpoznania dla Hind II 1972 r. Enzym ten został użyty do sporządzenia pierwszej mapy restrykcyjnej wirusa SV40 prez D. Nathansa 1978 r. Nagroda Nobla dla Arbera, Smitha i Wilcoxa za odkrycie enzymów restrykcyjnych
Enzymy restrykcyjne jako narzędzie w inżynierii genetycznej i biologii molekularnej Podstawowe zastosowanie enzymów restrykcyjnych w inżynierii genetycznej 1. Izolacja (pozyskiwanie) fragmentów DNA (liniowych cząsteczek) do rekombinacji in vitro i klonowania molekularnego 2. Mapowanie fizyczne genomów 3. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np. ustalanie pokrewieństwa)
Enzymy restrykcyjne (restryktazy) (ER) pod względem biochemicznym to endonukleazy przecinają szkielet cukierfosforan w DNA Restryktazy działają na określone sekwencje w DNA: żeby strawić DNA enzym restrykcyjny musi zobaczyć określony ciąg nukleotydów (miejsce rozpoznania) Nazewnictwo enzymów (Smith i Nathans) Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują liczby rzymskie Enzym Pochodzenie Miejsce trawienia 5' -->3' Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C Mbo I Moraxella bovis *G A T C Mbo I Moraxella bovis *G A T C Pst I Providencia stuartii C T G C A * G Sma I Serratia marcescens C C C * G G G SstI Streptomyces stanford G A G C T * C Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G
Podział systemów restrykcyjnych na klasy I, II i III Główne różnice pomiędzy klasami systemów restrykcyjnych dotyczą: 1) wzajemnej lokalizacji aktywności restryktazy i metylazy DNA W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych podjednostek, w klasie II są rozdzielone na dwa odrębne białka 2) lokalizacji miejsca trawienia względem miejsca rozpoznania DNA 3) Enzymy poszczególnych klas różnią się także wymaganiami co do kofaktorów potrzebnych do ich aktywności in vitro
Endonukleazy restrykcyjne I klasy Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku Substratem jest dwuniciowy DNA (dsdna) zawierający określoną sekwencję miejsce rozpoznania Enzymy klasy I rozpoznają taką sekwencję Przykłady enzymów I klasy: CfrA1 EcoAI EcoBI EcoKI GCANNNNNNNNGTGG GAGNNNNNNNGTCA TGANNNNNNNNTGCT AACNNNNNNGTGC Ogólnie: 3 nt/6-8 N/4-5 nt - sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna przecinają obydwie nici w pewnej odległości (kilkadziesiąt-kilkaset pz) od rozpoznanej sekwencji Do swojej aktywności wymagają S-adenozylo-metioniny (SAM), Mg +2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne III klasy Substratem jest dsdna Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku Rozpoznają asymetryczne miejsca 5-7 nukleotydowe: EcoP I AGACC EcoP 15I CAGCAG Hinf III CGAAT przecinają DNA w odległości 24-26 nt od miejsca rozpoznania Wymagają do działania jonów Mg +2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne II klasy Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy (dwa odrębne białka), ich geny zwykle sąsiadują w genomie Enzymy typu II trawią obydwa pasma DNA w obrębie miejsca rozpoznania - krótkiej sekwencji zazwyczaj 4-8 nt (niekiedy 12 nt) Substratem jest dwuniciowe DNA - dsdna (nieliczne enzymy mogą przecinać określone sekwencje w jednoniciowym ssdna). Większość enzymów restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego DNA na jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpoznania, choć nieliczne wymagają metylacji do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jedynie jonów Mg
Właściwości miejsca rozpoznania ER klasy II Większość miejsc rozpoznania jest ścisłym palindromem z symetrią rotacyjną ma długość najczęściej 4, 5, 6, 7, 8 nt Niekiedy palindrom może być przerwany przez serię 1-9 dowolnych nt np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje częstość trawienia DNA np.: (zakładając że G+C = 50%) enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok. 65 kpz (służą np. do konstrukcji bibliotek genomowych) z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (4 6 ) (wygodne do izolowania odcinków DNA obejmujących pojedyczne geny) 4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 256 bp (4 4 ) (tworzenie tzw. odcisków palca DNA fingerpinting)
Enzymy rzadkotnące: Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.: SapI 5 - GCTCTTC -3 Sgf1 5 - GCGATCGC -3 Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT SmaI rozpoznaje 5 CCCGGG -3, trawi co 78 kb; NotI rozpoznaje 5 GCGGCCGC 3, trawi co 10 MB.
Większość enzymów restrykcyjnych wiąże się do sekwencji palindromowych jako dimer BamHI plus DNA (TATGGATCCATA) W przypadku działania enzymu restrykcyjnego na dsdna przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznawanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie, lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych. Stosując odpowiednio niskie stężenia enzymów w stosunku do DNA można uzyskać cząsteczki z jedną tylko przeciętą nicią.
Niektóre enzymy pochodzące z różnych bakterii rozpoznają identyczne sekwencje, są to tzw. izoschizomery i mogą przecinać te sekwencje w dokładnie taki sam sposób Neoizoschizomery enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale przecinające ją w inny sposób. Przykłady: SmaI XmaI 5 CCC GGG 3 5 C CCGGG 3
Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy wolne końce DNA Lepkie końce mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale mogą być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5 lub 3, w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego. Mogą też tworzyć tępe końce Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5 - fosforanem lub 3 OH (wyjątek np. Nci I tworzy końce: 3 -fosforan i 5 -OH)
Jeśli lepkie końce są komplementarne, ligaza może je bardzo łatwo połączyć niezależnie od pochodzenia DNA, tworząc formy rekombinacyjne Możemy łączyć ze sobą również końce tępe ale jest to trochę trudniejsze zrekombinowane DNA
Czynniki wpływające na aktywność enzymów restrykcyjnych Skład buforu: Enzymy mają różne preferencje jeśli chodzi o siłę jonową (stęż. soli) i kationy (Na lub K). Zwykle pracują w ph 8.0. Bufory są zwykle dostarczane razem z enzymem przez producenta. Źle dobrany bufor powoduje albo brak trawienia albo tzw. częściowe trawienie. można trawić równocześnie kilkoma enzymami dobierając pośrednie warunki reakcji Bufor do przechowywania: Tris-EDTA, EDTA jest inhibitorem działania enzymów restrykcyjnych, ale nie w stężeniach poniżej 0,05 mm Temperatura inkubacji; Większość enzymów pracuje w 37 C. Enzymy izolowane z termofilnych bakterii tną DNA w temp. 50 65 C, inne z bakterii psychrofilnych, ze względu na krótki okres półtrwania, w temp. 25 C. Jednostka aktywności Ilość enzymu potrzebna to strawienia 1μg DNA faga w 60 min, w odpowiedniej temp., w objętości 50 μl
Na wydajność trawienia duży wpływ ma czystość DNA: kontaminacje solami (np. z innych buforów ważne przy wielokrotnych trawieniach), inhibitory, nukleazy mogą powodować trawienie częściowe lub jego kompletny brak DNA Rodzaj użytego DNA Oligonukleotydy i produkty PCR Plazmidowe i fagowe DNA Genomowe DNA (w roztworze) Genomowe DNA w postaci bloczków agarozowych (więcej enzymu, dłuższa inkubacja)
Aktywność gwiaździsta (star activity, relaxation of specificity) Enzym w niestandardowych warunkach trawi DNA w miejscach innych niż miejsce rozpoznania, np. BamHI (GGATCC) może trawić sekwencje: NGATCC, GPuATCC, GGNTCC Niestandardowe warunki to np.: zbyt długa inkubacja bardzo wysokie stęż. enzymu wysokie ph lub niska siła jonowa, za wysokie stęż. glicerolu, obecność rozpuszczalników organicznych w reakcji (etanol, DMSO) zastąpienie jonów Mg innymi dwuwartościowymi kationami jak Mn lub Co 1 - Lambda DNA; 2-0.15u of EcoRI, 1 hour incubation (incomplete cleavage); 3-0.4u of EcoRI, 1 hour incubation (incomplete cleavage); 4-1.0u of EcoRI, 1 hour incubation (complete digestion); 5-40.0u of EcoRI, 16 hours incubation (star activity); 6-70.0u of EcoRI, 16 hours incubation (star activity).
Inne zastosowania enzymów restrykcyjnych klasy II Mapowanie restrykcyjne Mapa restrykcyjna zawiera dokładną lokalizację miejsc restrykcyjnych w obrębie fragmentu (cząsteczki) DNA. Najprostszą metodą jest trawienie próbek DNA pojedynczymi enzymami, a następnie parami tych enzymów. Produkty trawienia są rozdzielane w żelu agarozowym dla określenia wielkości fragmentów, a następnie odtwarza się kolejność ułożenia enzymów danym fragmencie lub cząsteczce. Pojedyncze trawienie zwykle mówi ile jest fragmentów restrykcyjnych w badanym DNA, a podwójne trawienie mówi o kolejności i orientacji fragmentów. Mapy restrykcyjne konstruuje się wtedy, gdy nie znamy sekwencji DNA. Jeśli sekwencja jest znana wystarczy wstawić tę sekwencję do programu komputerowego i uzyska się b. dokładną mapę restrykcyjną
Zastosowanie enzymów w analizie polimorfizmu DNA zróżnicowania genetycznego RFLP restriction fragment length polymorphism (różnice w długości fragmentów restrykcyjnych tworzonych po cięciu DNA restryktazami II typu. Wykrywa się głównie przez trawienie DNA amplifikowanego w reakcji PCR i elektroforezę agarozową produktów reakcji (PCR-RLFP). Polimorfizm restrykcyjny może być stosowany do oznaczania ojcostwa
Zastosowanie enzymów w diagnostyce chorób genetycznych: Wykrywanie mutacji przy pomocy enzymów restrykcyjnych np.: anemia sierpowata Normalny gen globiny CTGAG GACTC Zmutowany gen globiny CTGTG GACAC Trawienie enzymem Dde I Elektroforeza agarozowa Dwa fragmenty o dłg: 201 i 175 bp Jeden fragment o dłg. 376 bp