prof. dr hab. Dariusz Bartosik Zakład Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1 02-096 Warszawa Warszawa, 22.06.2017 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Kingi Bondarczuk pt. Opornośd na antybiotyki beta-laktamowe u bakterii bytujących w oczyszczalni ścieków w Żywcu i Jeziorze Żywieckim" wykonanej w Katedrze Mikrobiologii, Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach pod kierunkiem prof. dr hab. Zofii Piotrowskiej-Seget Zastosowanie antybiotyków w terapii medycznej oraz w rolnictwie pozwoliło, przez dziesiątki lat, nie tylko na skuteczną walkę z bakteriami patogennymi, lecz także na zwiększanie biomasy roślin i zwierząt hodowlanych. Produkcja antybiotyków na skalę przemysłową i ich niekontrolowane stosowanie, spowodowało akumulację tych związków (i produktów ich przemian) w różnych środowiskach. W dużej mierze wynika to z dynamicznego rozwoju medycyny, weterynarii i metod hodowli roślin i zwierząt. Przekonują o tym m.in. dane European Medicines Agency, według których jedynie w 2014 roku sprzedano w Polsce aż 578 ton antybiotyków, z przeznaczeniem do hodowli zwierząt. Jako główne przyczyny powstawania i rozprzestrzeniania oporności bakterii na antybiotyki, wymienia się: (i) nadmierne i niewłaściwe stosowanie tych leków, które dokonują selekcji klonów opornych, pojawiających się w sposób naturalny w ich populacjach, (ii) przenoszenie genów opornościowych między różnym gospodarzami bakteryjnymi, drogą horyzontalnego transferu genów (HGT; ang. horizontal gene transfer) oraz (iii) rozprzestrzenianie się drobnoustrojów opornych za sprawą m.in. mobilności ludzi i zwierząt. Opornośd na antybiotyki, kojarzona wcześniej jedynie z izolatami klinicznymi bakterii, jest zatem zjawiskiem bardziej powszechnym. Postuluje się, że bakterie bytujące w środowiskach naturalnych stanowią bogaty rezerwuar genów oporności, które mogą byd przekazywane bakteriom patogennym w wyniku HGT, co stanowi poważny problem natury klinicznej. W efekcie, leczenie zakażeo i chorób infekcyjnych staje się coraz trudniejsze, coraz więcej mikroorganizmów dysponuje znanymi od dawna determinantami oporności, coraz szybciej pojawiają się także nowe warianty genów opornościowych, stanowiące skuteczną odpowiedź drobnoustrojów na wprowadzane do użytku środki terapeutyczne najnowszych generacji. Problem ten przestaje byd wyłącznie przedmiotem zainteresowao środowisk naukowych, bowiem, ze względu na zakres obserwowanego zjawiska, zyskuje wymiar globalny. 1
Swoistym tyglem, będącym bogatym rezerwuarem genów oporności, są oczyszczalnie ścieków, w których występują drobnoustroje oporne na niemal wszystkie stosowane w lecznictwie antybiotyki i związki o działaniu antybakteryjnym. Należy podkreślid, że liczne determinanty oporności, często sprzężone są z ruchomymi elementami genetycznymi, m.in. plazmidami i transpozonami. Transfer tych elementów do innych gospodarzy, w połączeniu z silną presją antropogeniczną, umożliwia generowanie i selekcję szczepów wieloopornych, które trafiają, wraz z oczyszczonymi ściekami, do naturalnych środowisk wodnych. Zagadnieniem niezwykle ważnym, lecz wciąż w niedostatecznym stopniu poznanym, jest określenie rzeczywistego wpływu mikroorganizmów wprowadzanych z oczyszczalni ścieków do wód powierzchniowych, na strukturę i właściwości konsorcjów bakterii bytujących w środowiskach naturalnych. Recenzowana rozprawa doktorska wpisuje się w ten nurt tematyczny. Jej zasadniczym celem było monitorowanie mikrobiomu i rezystomu bakterii na różnych etapach procesów przeprowadzanych w Żywieckiej Oczyszczalni Ścieków, a także w wodach Jeziora Żywieckiego, które są odbiornikiem ścieków z tego Zakładu. Należy podkreślid, że Oczyszczalnia ta jest odbiorcą ścieków z terenów objętych szczególną ochroną, jakimi są tereny Żywieckiego Parku Krajobrazowego, a wody Jeziora Żywieckiego zasilają również położony niżej zbiornik w Czaocu, który jest miejscem poboru wody dla aglomeracji Śląskiej. Główne zadania badawcze rozprawy obejmowały (i) określenie liczebności hodowalanych frakcji mikroorganizmów w badanych środowiskach, (ii) poznanie bioróżnorodności zespołów bakterii oraz genów warunkujących antybiotykoopornośd w metagenomach badanych środowisk, a także (iii) identyfikację plazmidów (naturalnych, mobilnych nośników genetycznych), odpowiedzialnych za rozprzestrzenianie oporności na antybiotyki β-laktamowe. Właśnie tej grupie antybiotyków Doktorantka poświęciła w pracy szczególną uwagę, co jest w pełni zrozumiałe, biorąc pod uwagę fakt, że β-laktamy stanowią najczęściej wykorzystywaną w praktyce grupę terapeutyków, co, niestety, pociąga za sobą narastająca opornośd na te związki. Mając na względzie wagę zagadnienia antybiotykooporności bakterii oraz znikomy stan wiedzy na temat zakresu tego zjawiska w środowiskach naturalnych naszego kraju, uważam że podjęcie tej tematyki w ocenianej rozprawie było w pełni zasadne. Ocena układu pracy Przedstawiona do oceny rozprawa została napisana w języku polskim i ma w zasadzie układ typowy dla większości prac eksperymentalnych, a przygotowując ją zachowano zrównoważone proporcje w objętości poszczególnych rozdziałów. Praca liczy łącznie 109 stron i zawiera 20 ilustracji oraz 11 tabel. Została ona przygotowana starannie pod względem językowym i edytorskim. W początkowej części pracy wyróżniono dwa równocenne rozdziały - jednostronicowy Wstęp oraz 16 stronicowy Przegląd literatury, który stanowi zasadnicze wprowadzenie do tematyki badao. Rozdzielenie tych treści na dwa niezależne rozdziały nie wydaje mi się celowe. 2
W rozprawie zamieszczono także, oprócz opisu części metodycznej, Wyników i Dyskusji, (i) Wykaz stosowanych skrótów, (ii) rozdział Wnioski, punktujący najważniejsze osiągnięcia pracy, (ii) Streszczenie, w języku polskim angielskim i oraz (iii) Aneks, w którym zestawiono częśd wyników analiz metagenomicznych. Ocena poszczególnych części pracy Rozdział Przegląd literatury składa się z 5 równocennych części. W pierwszej opisano problem antybiotykooporności u bakterii, zwracając uwagę na przyczynę tego zjawiska, ewolucyjne pochodzenie determinantów oporności oraz dużą różnorodnośd mechanizmów warunkujących opornośd. W dwóch kolejnych częściach scharakteryzowano antybiotyki β-laktamowe oraz mechanizmy oporności na te związki. W czwartej części opisano rolę oczyszczalni ścieków w rozprzestrzenianiu antybiotykooporności, a w ostatniej - metody stosowane w badaniach antybiotykooporności, z podziałem na metody hodowlane i niehodowlane. Mam kilka drobnych uwag do tej części pracy. Po pierwsze, nie zgodzę się ze sformułowaniem, że "...nastanie tzw. ery antybiotyków doprowadziło do przyspieszenia procesu przenoszenia ARGs z genomów bakterii środowiskowych do szczepów chorobotwórczych oraz nabywania oporności przez patogeny na drodze mutacji" (str. 5). Obecnośd antybiotyku nie wpływa bowiem na przyspieszenie tempa pojawiania się mutacji determinujących opornośd, lecz stanowi czynnik selekcjonujący te zdarzenia i prowadzący do naturalnej amplifikacji szczepów opornych. Po drugie, na str. 16 Doktorantka zalicza integrony do grupy ruchomych elementów genetycznych, chociaż same integrony nie są mobilne, w przeciwieostwie do występujących w nich kaset genowych. Z obowiązku recenzenta wspomnę również o nielicznych błędach interpunkcyjnych i językowych, które jednak nie wpływają na pozytywny odbiór tej części pracy. Uważam, że rozdział Przegląd literatury jest w całości spójny, został napisany przejrzyście i zawiera informacje niezbędne do interpretacji wyników przedstawionych w dalszych rozdziałach pracy. Materiały i Metody przedstawiono w rozprawie w jednym rozdziale. W badaniach zastosowano różnorodne metody (genetyczne, mikrobiologiczne, bioinformatyczne), a ich opisy przedstawiono na tyle precyzyjnie, aby możliwe było powtórzenie przeprowadzonych eksperymentów w innych warunkach laboratoryjnych. W podrozdziale, w którym powinny byd zgrupowane Materiały wykorzystane w badaniach, czytelnik znajduje jedynie opis Jeziora Żywieckiego oraz informacje metodyczne, dotyczące sposobu poboru prób. Uważam, że treści te powinny zostad umieszczone w innych częściach rozprawy. W omawianym podrozdziale brakuje natomiast informacji przedstawianych standardowo w innych rozprawach, m.in. na temat źródeł i charakterystyki wykorzystanych w badaniach szczepów bakteryjnych, plazmidów i starterów, a także stosowanych podłoży i ich suplementów. Co prawda, większośd tych danych można odnaleźd w opisach części metodycznej, są one jednak rozproszone, a czytelnik nie jest na nie bezpośrednio nakierowany. 3
Rozdział Wyniki stanowi zasadniczą częśd rozprawy. W badaniach wykorzystano próby pochodzące ze ścieków surowych, osadu czynnego i ścieków oczyszczonych z oczyszczalni ścieków w Żywcu oraz wód i osadów z jeziora Żywieckiego. Chociaż analiza wymienionych prób byłaby wystarczająca do realizacji postawionego celu badawczego, Doktorantka włączyła także do badao, jako kontrolę, próby pochodzące z rzeki Soły. W pierwszym etapie prac określiła ogólną liczbę bakterii hodowalnych występujących w analizowanych próbach, a także bakterii opornych na amplicylinę. Badania te uzupełniła, oznaczając liczbę kopii genu 16S rrna w metagenomowym DNA, izolowanym z poszczególnych prób. Te wstępne badania przyniosły obserwacje, świadczące o tym, że podczas procesu oczyszczania ścieków dochodzi do istotnego statystycznie spadku liczebności bakterii heterotroficznych, a także bakterii opornych na ampicylinę. Zgromadzone dane sugerują również, że bakterie niosące geny warunkujące antybiotykoopornośd są kumulowane w populacjach mikroorganizmów zasiedlających osady denne Jeziora Żywieckiego i Soły. Należy zaznaczyd, że Doktorantka pobierała próby w dwóch kolejnych latach (2014 i 2015), co pozwoliło na zestawienie uzyskanych danych i wyciągnięcie wniosków na temat fluktuacji liczby analizowanej części mikrobiomu i rezystomu w badanych środowiskach. Efektem tych prac było również zgromadzenie bogatej kolekcji ampicylinoopornych szczepów bakterii, która może stanowid punkt wyjścia do bardziej szczegółowych analiz genetycznych. W kolejnym etapie, Doktorantka przeprowadziła analizę danych, uzyskanych w wyniku wysokoprzepustowego sekwencjonowania metagonomowego DNA, wyizolowanego z prób wód Jeziora Żywieckiego, Soły oraz ścieków opuszczających oczyszczalnię (były to pojedyncze próby, nie podano jednak, w którym roku zostały one pobrane; uwaga ta dotyczy także dalszych części rozdziału Wyniki). Analizy te pozwoliły na zbadanie stopnia zróżnicowania taksonomicznego zespołów bakterii bytujących w poszczególnych środowiskach oraz określenie in silico potencjalnego rezystomu tych bakterii. Zgodnie z oczekiwaniami, największy udział różnorodnych genów warunkujących antybiotykoopornośd, a także integraz integronów klasy 1, z którymi często sprzężony jest fenotyp wielooporności, stwierdzono w ściekach oczyszczonych, wprowadzanych bezpośrednio do Jeziora Żywieckiego. Zestawienie wyników z trzech analizowanych metagenomów sugeruje jednak, że uwalniane ścieki nie wpływają znacząco na rozprzestrzenienie antybiotykooporności wśród zespołów bakterii zasiedlających wody jeziora. Aby uzyskad pełniejszy obraz, korzystne byłoby włączenie do analiz metagenomicznych prób osadów dennych tego zbiornika. Zastosowanie podejścia metagenomicznego przyniosło bardzo dużą ilośd danych, które przedstawiono w rozprawie w sposób syntetyczny i przemyślany. Należy podkreślid, że analiza sekwencji metagenomów nie jest łatwa, jednak Doktorantka doskonale poradziła sobie z tym wyzwaniem, co świadczy o dobrze opanowanym prze nią warsztacie bioinformatycznym. Ostatnia częśd pracy koncentruje się na identyfikacji i analizie plazmidów niosących geny oporności na antybiotyki -laktamowe. Aby osiągnąd ten cel, zastosowano egzogenną izolację plazmidów, która przebiega z pominięciem etapu charakteryzowania pierwotnego gospodarza tych replkonów. Uważam, że wybór tej strategii, mimo pewnych jej ograniczeo, był trafnym rozwiązaniem. Po pierwsze, egzogenna izolacja eliminuje problematyczny etap rozróżniania 4
właściwej oporności (wynikającej np. z wytwarzania enzymów inaktywujących antybiotyk) od naturalnej niewrażliwości spowodowanej, na przykład, strukturą osłon komórkowych. Po drugie, stosując tę strategię możliwa jest także identyfikacja plazmidów występujących w bakteriach niehodowalnych oraz niosących geny oporności nieulegające ekspresji w pierwotnych gospodarzach. Uzyskaną pulę plazmidów Doktorantka wstępnie pogrupowała na podstawie zróżnicowania ich profili restrykcyjnych oraz typowania grup niezgodności metodą multiplex PCR. Kolejne etapy charakterystyki obejmowały określenie profilu oporności poszczególnych plazmidów oraz ich zdolności do transferu koniugacyjnego i mobilizacji. Analizę mobilizowalności plazmidów przeprowadzono z wykorzystaniem pomocniczego systemu transferu plazmidu RK2. Przy opisie tego podejścia podano informację, że system ten umożliwia mobilizację plazmidów zawierających origin transferu koniugacyjnego. Należy dodad, że w typowych plazmidowych modułach MOB wymagana jest również obecnośd genu relaksazy, białka oddziałującego specyficznie z orit. Jest to istotne, bowiem warunkiem mobilizacji są interakcje relaksazy z białkiem łącznikowym pomocniczego systemu transferu. Doktorantka podjęła także próbę określenia zakresu gospodarzy plazmidów koniugacyjnych oraz identyfikacji in vivo transpozonów opornościowych, potencjalnie sprzężonych z genomami analizowanych plazmidów. Uzyskane wyniki wykazy, że większośd analizowanych plazmidów to replikony koniugacyjne lub mobilizowalne, co podkreśla ich potencjał w rozprzestrzenianiu fenotypów oporności. Zaobserwowano także duże zróżnicowanie ich systemów replikacyjnych, których, w większości, nie udało się przypisad do żadnej z 18 testowanych grup niezgodności. Poznanie sekwencji nukleotydowych tych replikonów niewątpliwie byłoby interesującym dopełnieniem tej części rozprawy. Cieszy jednak fakt, że zadanie to zostało ujęte, w przedstawionych w rozprawie, dalszych planach badawczych Doktorantki. Wyniki uzyskane w trakcie badao zostały rzeczowo omówione w rozdziale Dyskusja. Lektura tego rozdziału przekonuje mnie, że Doktorantka jest w pełni dojrzałym badaczem, zdolnym nie tylko do przeprowadzenia ciągu analiz eksperymentalnych i bioinformatycznych, lecz również do właściwej interpretacji uzyskanych wyników, a także przedstawienia ich na tle aktualnej wiedzy z omawianej dziedziny (w pracy zacytowano łącznie 97 pozycji literaturowych oraz 8 źródeł internetowych). W podsumowaniu stwierdzam, że przedstawiona do oceny rozprawa stanowi oryginalne rozwiązanie problemu naukowego, wykazuje ogólną wiedzę Doktorantki oraz umiejętnośd samodzielnego prowadzenia przez nią badao naukowych. Dzięki logicznie zaprojektowanym eksperymentom i wnikliwej analizie uzyskanych danych, Doktorantka poczyniła wiele wartościowych obserwacji, istotnych zarówno z poznawczego, jak i praktycznego punktu widzenia. Uzyskane wyniki przyniosły informacje na temat struktury mikrobiomu oraz skali problemu antybiotykooporności w analizowanych środowiskach. Dowiodły także, że geny oporności mogą stanowid marker, pomocny w ocenie stanu czystości środowisk wodnych oraz w 5
oszacowaniu wpływu presji antropogenicznej. Uważam, że badania tego typu powinny byd prowadzane cyklicznie w ramach monitoringu naturalnych środowisk wodnych, zwłaszcza tych do których odprowadzone są ścieki, będące rezerwuarem bakterii opornych i potencjalnie patogennych. Na koniec chciałbym podkreślid, że wyniki przedstawione w rozprawie są efektem realizacji grantu NCN, kierowanego przez Doktorantkę, co podkreśla również autorski charakter prowadzonych prac. Uważam, że oceniana praca w pełni spełnia warunki stawiane rozprawom doktorskim. Wnoszę więc do Rady Naukowej Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach o dopuszczenie Pani mgr Kingi Bandarczuk do dalszych etapów przewodu doktorskiego. prof. dr hab. Dariusz Bartosik 6