Imię i nazwisko zaliczenie Nr albumu data podpis asystenta ĆWICZENIE 1 OZNACZANIE STĘŻENIA LEKU W SUROWICY KRWI TECHNIKĄ HPLC Losy leku w organizmie człowieka Wstęp merytoryczny Zespół procesów, jakim podlega lek w organizmie człowieka składa się z następujących etapów: uwalnianie substancji czynnej z leku wchłanianie leku dystrybucja metabolizm (biotransformacja) wydalanie Metabolizm leku Metabolizmem leku nazwać można takie przemiany enzymatyczne, w wyniku, których substancja lecznicza ulega przekształceniu w nieaktywny farmakologicznie związek lub w aktywny metabolit bądź też związek toksyczny dla organizmu. Głównym celem metabolizmu są procesy prowadzące do uzyskania ze związków lipofilnych polarnych związków rozpuszczalnych w wodzie. Metabolizm zachodzi głównie w wątrobie oraz w jelitach, płucach, nerkach, śledzionie, skórze i mięśniach prążkowanych. Proces metabolizmu możemy podzielić na dwie fazy. Do reakcji I fazy rozpoczynających metabolizm leku należą: - utlenianie - redukcja - hydroliza Są to reakcje zachodzące w siateczce endoplazmatycznej hepatocytów i katalizowane przez enzymy frakcji mikrosomalnej wątroby przy udziale cytochromu P-450. Reakcje te aktywują lub inaktywują wprowadzoną do organizmu substancję leczniczą. Wynikiem reakcji I fazy ma być zmiana struktury chemicznej związku na tyle, by mogły zajść reakcje II fazy. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1
Do reakcji II fazy należą: - sprzęganie z glukuronianem, siarczanem, kwasem octowym, glutationem, aminokwasami - metylacja W II fazie biotransformacji, zmodyfikowane podczas reakcji utleniania, redukcji lub hydrolizy leki zostają sprzężone z niektórymi reaktywnymi metabolitami ustrojowymi, stając się przez to lepiej rozpuszczalnymi w wodnym środowisku płynów ustrojowych i w konsekwencji łatwiej wydalanymi z moczem. Reakcje sprzęgania zachodzące w II fazie biotransformacji katalizują głównie enzymy klasy transferaz. Metabolizm benzodiazepin Pochodne benzodiazepiny są grupą leków o szerokim zastosowaniu, wykazują one działanie: przeciwlękowe, uspokajające, nasenne, rozluźniające mięśnie, przeciwdrgawkowe i osłabiające reakcje emocjonalne. Działanie przeciwdrgawkowe benzodiazepin znalazło zastosowanie w leczeniu uogólnionych drgawek tonicznoklonicznych, zwłaszcza w stanie padaczkowym, drgawek gorączkowych u dzieci, drgawek w abstynencyjnym zespole alkoholowym. Pochodne benzodiazepiny mogą również nasilać działanie innych substancji wpływających depresyjnie na ośrodkowy układ nerwowy. Obecnie należą one do jednej z najbardziej rozpowszechnionych grup leków. Leki z tej grupy należą do pochodnych 1,4-benzodiazepiny, która zawiera skondensowany układ 1,4-diazepiny z pierścieniem benzenowym. Na aktywność tej grupy związków ma wpływ rodzaj podstawników w pozycjach 1, 2, 3, 5 i 7. Aktywne farmakologicznie są związki zawierające np. chlorowiec w pozycji 7 (diazepam). Ten podstawnik gwarantuje działanie anksjolityczne leku. Niezbędny do aktywności farmakologicznej jest pierścień fenylowy w pozycji 5, aktywność leku wzrasta, jeśli pierścień, fenylowy podstawiony jest chlorowcem w pozycji 2 lub 6. Obecność grupy metylowej w położeniu 1 powoduje wzrost działania (diazepam). Diazepam wchłania się dobrze z przewodu pokarmowego w postaci niezmienionej. Dawka dobowa diazepamu wynosi 5-20 mg. Uzyskuje maksymalne stężenie we krwi w ciągu 1h, jego okres półtrwania wynosi około 48h. Po podaniu doodbytniczym czas kiedy lek uzyskuje maksymalne stężenie we krwi może ulec skróceniu do 15min. Szybko ulega dystrybucji do tkanek i stosunkowo łatwo przechodzi do mleka, łożyska oraz płynu mózgowordzeniowego, gdzie osiąga stężenie równe stężeniu w surowicy krwi. Diazepam ulega w wątrobie procesowi biotransformacji. Przy użyciu mikrosomalnego systemu monooksygenazy (oksydoreduktaza NADPH:cytochrom P450) diazepam ulega metabolizmowi do aktywnego metabolitu jakim jest desmetylodiazepam. Powstanie desmetylodiazepamu odbywa się w wyniku reakcji N 1 -demetylacji (jest to główny tor przemian diazepamu). Dizepam może również ulegać C 3 -hydroksylacji, w wyniku tej reakcji powstaje temazepam (aktywny metabolit). Zarówno desmetylodiazepam jak i temazepam ulegają przemianie do kolejnego aktywnego metabolitu, jakim jest oksazepam. Proces ten zachodzi w wyniku odpowiednio C 3 -hydroksylacji i N 1 -demetylacji. Oksazepam z kolei ulega przemianie do nieaktywnego metabolitu 4-hydroksyoksazepamu (4'-hydroksylacja pierścienia aromatycznego). Zatem farmakologiczne działanie diazepamu zależy zarówno od stężenia samego diazepamu jak i stężenia poszczególnych jego aktywnych metabolitów. Efekt przeciwdrgawkowy wynika z sumy działania diazepamu, desmetylodiazepamu i oksazepamu, działanie przeciwagresywne wynika głównie z działania desmetylodiazepamu, z kumulacją oksazepamu w mózgu związane jest długotrwałe działanie farmakologiczne diazepamu. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 2
Ryc. Zarys metabolizmu diazepamu Farmakoterapia monitorowana stężeniem leku we krwi Ze względu na międzyosobnicze różnice w szybkości metabolizmu benzoazepin, a także możliwość przedawkowania, leki z tej grupy oraz ich metabolity w osoczu krwi są monitorowane. Terapia monitorowana stężenia leku (TML lub z ang. TDM - Terapeutic Drug Monitoring) to sposób prowadzenia terapii z równoczesnym pomiarem stężenia leku w płynach biologicznych. TML definiuje się jako monitorowanie stężenia leków we krwi oraz innych płynach ustrojowych celem tworzenia i realizacji bezpiecznych i skutecznych schematów farmakoterapii u indywidualnych pacjentów. Terapia monitorowana stężeniem leków (TML) w płynach ustrojowych stanowi w rękach analityka klinicznego narzędzie, dzięki któremu możliwe jest zapewnienie nie tylko skutecznej, ale przede wszystkim bezpiecznej farmakoterapii dla indywidualnych pacjentów. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 3
Cel: Doświadczenie 1 Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką ekstrakcji oznaczanego leku z surowicy krwi (przygotowaniem próbki do oznaczenia) jak również zapoznanie się z techniką oznaczania stężenia leku przy zastosowaniu HPLC. Zadania będą realizowane poprzez: a) Przygotowanie krzywych wzorcowych dla diazepamu i jego metabolitu desmetylodiazepamu. b) Ekstrakcja leku i jego metabolitu z surowicy krwi pacjenta, któremu podawano diazepam. c) Oznaczenie stężenia diazepamu i desmetylodiazepamu techniką HPLC. d) Obliczenie podstawowych parametrów farmakokinetycznych: C max, T max, AUC dla badanych leków. Zasada metody: Skrót HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) oznacza cieczową wysokociśnieniową chromatografię kolumnową. Analizę mieszanin przy pomocy cieczowej chromatografii kolumnowej wykonuje się przy użyciu chromatografów cieczowych. Zasada działania chromatografu cieczowego jest następująca: ze zbiornika pompą zasysa się fazę ruchomą, która poprzez dozownik jest tłoczona do kolumny chromatograficznej. Za pomocą dozownika do strumienia cieczy podaje się próbkę, której składniki rozdzielają się w kolumnie i na wyjściu z niej są wykrywane przez detektor. Sygnał elektryczny z detektora po wzmocnieniu jest zapisywany i mierzony przy pomocy komputera. Postępowanie: Przygotowanie materiału do badań Materiałem do badań są surowice ludzkie otrzymane od pacjentów leczonych diazepamem. Przygotowanie odczynników Acetonitryl Metanol Dichlorometan Bufor boranowy: nasycony roztwór czteroboranu sodowego ph 12 Eluent: acetonitryl: metanol: woda, w stosunku 2:3:5 Roztwory wzorcowe diazepamu i desmetylodiazepamu o stężeniu 1mg/ml metanolu. Metodyka Pomiar wykonaj na chromatografie firmy Shimadzu, wyposażonym w pompę LC-10AS, detektor SPD-10AV oraz integrator komputerowy z oprogramowaniem Chromax. Zastosuj kolumnę Waters Symmetry C8 3,9 150 mm (szybkość przepływu 2,0 ml/min.). Pomiar przeprowadź przy długości fali 228 nm. Wyznaczanie krzywych wzorcowych Korzystając z wzorców diazepamu i desmetylodiazepamu o stężeniu 1 mg/ml przygotuj próby wzorcowe o następujących stężeniach: 50, 100, 200, 500, 1000 ng/ml oddzielnie dla diazepamu i desmetylodiazepamu i uzupełnij serostandardem do 500l, następnie poddaj je ekstrakcji według schematu opisanego poniżej. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 4
Ekstrakcja leku z wzorców (lub surowicy) 500 l odpowiedniego wzorca (lub surowicy) dodanie 200 l buforu boranowego dodanie 6ml CH 2 Cl 2 wytrząsanie przez 5min wymrażanie przez 10 min dekantacja warstwy organicznej odparowanie w strumieniu azotu rozpuszczenie pozostałości w 500 l eluentu naniesienie na kolumnę HPLC 100 l roztworu Obserwacje: Wyniki uzyskane w czasie wykonywania krzywej wzorcowej dla diazepamu: 50 ng/ml 100 ng/ml 200 ng/ml 500 ng/ml 1000 ng/ml wysokość piku (V) pole powierzchni pod pikiem (V/100min) Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 5
Wyniki uzyskane dla krzywej wzorcowej dla desmetylodiazepamu 50 ng/ml 100 ng/ml 200 ng/ml 500 ng/ml 1000 ng/ml wysokość piku (V) pole powierzchni pod pikiem (V/100min) Przedstaw na wykresach zależność wysokości piku od stężenia diazepamu oraz zależność pola powierzchni piku od stężenia diazepamu. Odpowiednie wykresy sporządź również dla desmetylodiazepamu. Oblicz współczynniki korelacji dla poszczególnych krzywych. Obliczenia: Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 6
Oznaczanie stężenia leku w surowicy Doświadczenie 2 Oznaczenie stężenia leku - diazepamu i jego metabolitu - desmetylodiazepamu w surowicy krwi pacjenta po obciążeniu doustnym diazepamem w dawce 20 mg po czasie: 0.5, 1.5, 4, 8, 24 godzinach. Surowicę krwi pacjenta poddaj ekstrakcji według schematu opisanego powyżej. Na kolumnę chromatografu nanieś 100 l roztworu po ekstrakcji leku z surowicy. Z krzywych wzorcowych dla diazepamu i desmetylodiazepamu odczytaj stężenie leku i jego metabolitu w badanej próbce surowicy krwi pacjenta. Przedstaw obliczone stężenia diazepamu i jego metabolitu na wykresie zależności stężenia leku od czasu jego pobrania po obciążeniu dawką 20 mg diazepamu. Oblicz podstawowe parametry farmakokinetyczne: C max, T max, AUC. Obserwacje: Wyniki uzyskane dla badanej surowicy. Przedstaw obliczone stężenia diazepamu i jego metabolitu desmetylodiazepamu w postaci zależności stężenia leku w surowicy krwi od czasu jego pobrania po obciążeniu pacjenta dawką 20 mg diazepamu. AUC wylicz z wzoru: AUC = t[c (i-1) +c i ]/2 Przedstaw obliczone stężenia diazepamu i jego metabolitu w surowicy krwi na wykresie zależności stężenia leku od czasu jego pobrania po obciążeniu dawką 20 mg diazepamu. Czas od obciążenia doustnego lekiem do pobrania krwi (h) 0,5 Stężenie diazepamu (ng/ml) Stężenie desmetylodiazepamu (ng/ml) AUC diazepam AUC desmetylodiazepu 1,5 4,0 8,0 24,0 Obliczenia: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 7
Wnioski: Wypisz podstawowe parametry farmakokinetyczne: C max, T max, AUC dla diazepamu. Oceń otrzymane wyniki na podstawie farmakokinetyki badanego leku. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 8