Zastosowanie modelu hydraulicznego do badania zależności między pozorną objętością dystrybucji, klirensem i biologicznym okresem półtrwania

Transkrypt

1 Ćwiczenie 2. Zastosowanie modelu hydraulicznego do badania zależności między pozorną objętością dystrybucji, klirensem i biologicznym okresem półtrwania Celem ćwiczenia jest zbadanie w warunkach in vitro zależności między podstawowymi parametrami farmakokinetycznymi, stosując model hydrauliczny, obrazujący otwarty model jednokompartmentowy, z uwzględnieniem jednorazowej dawki dożylnej leku. Wprowadzenie. Po podaniu określonej dawki leku jego stężenie we krwi (płynach biologicznych) zależy od następujących procesów: wchłaniania leku z miejsca podania i transportu do krążenia ogólnego, dystrybucji leku, tzn. jego rozmieszczenia w płynach i tkankach ustroju, eliminacji leku na drodze jego metabolizmu i (lub) wydalania. Każdy z wymienionych procesów przebiega z pewną szybkością oraz wydajnością, zaś obserwowane zmiany stężenia leku we krwi i w okolicy receptora (miejsca działania leku) stanowią wypadkową tych procesów. Wchłanianie, dystrybucja oraz eliminacja leków z organizmu stanowią zespól złożonych procesów fizykochemicznych, biochemicznych i fizjologicznych. Procesy te można opisać ilościowo za pomocą równań matematycznych, które z kolei pozwolą na wyznaczenie podstawowych parametrów farmakokinetycznych, a mianowicie: dostępności biologicznej leku, objętości dystrybucji, klirensu oraz biologicznego okresu półtrwania. Poznanie tych parametrów i ustalenie zależności między nimi pozwoli na wytyczenie podstaw skutecznego i bezpiecznego dawkowania leku poprzez właściwy dobór drogi jego podania, wielkości dawki oraz częstotliwości dawkowania. Dostępność biologiczna, F. Jest to ułamek (procent) dawki leku wchłoniętego do krążenia ogólnego po pozanaczyniowym (doustnym, domięśniowym, doodbytniczym, na skórę itp.) podaniu leku. Wartość tego ułamka jest bliska jedności w przypadku leków wchłaniających się całkowicie z miejsca podania i pokonujących swobodnie drogę do krążenia ogólnego. Natomiast w przypadku leków nie wchłaniających się jest ona bliska zeru. Przyczyną małej dostępności biologicznej leku może być tzw. efekt pierwszego przejścia. Lek, zanim dotrze do krążenia ogólnego, jest metabolizowany w przewodzie pokarmowym, w ścianach jelita oraz w wątrobie, gdzie dociera żyłą wrotną. Efekt pierwszego przejścia może

2 w znacznym stopniu wpłynąć na biodostępność niektórych leków. Przykładem jest nitrogliceryna, wchłaniana prawie w 100% w przewodzie pokarmowym, której do krążenia dostaje się jedynie 10% podanej dawki. Pozostała jej część (90%) ulega metabolizmowi w procesie pierwszego przejścia przez wątrobę, stąd w celu zwiększenia biodostępności tego leku podaje się go podjęzykowo. Krew ze splotów podjęzykowych omija wątrobę i przedostaje się bezpośrednio do krążenia ogólnego. Musimy jednakże pamiętać, że zmniejszona, wskutek efektu pierwszego przejścia, biodostępność leku nie będzie miała znaczenia, gdy za farmakologiczne działanie odpowiedzialny jest metabolit a nie macierzysty lek. Objętość dystrybucji V d. Działanie farmakologiczne leku jest wynikiem jego oddziaływania z receptorem, który zazwyczaj występuje w tkankach. Lek musi więc przeniknąć z krwi do przestrzeni międzykomórkowej a następnie do komórek, pokonując szereg barier fizjologicznych. Proces dystrybucji leku w tkankach i narządach zależy od szybkości transportu leku przez błony biologiczne, szybkości przepływu krwi przez poszczególne tkanki i narządy, jak również od stopnia wiązania z białkami krwi i tkanek. Ponadto istotną rolę w rozmieszczenia leku w organizmie odgrywają specyficzne bariery, takie jak: krew mózg, krew płyn mózgowordzeniowy lub bariera łożyskowa. Parametrem farmakokinetycznym, który obrazuje proces dystrybucji leku jest objętość dystrybucji (równanie 1.5). Nierównomierne rozmieszczenie leku w organizmie powoduje, że stężenie leku we krwi jest zazwyczaj znacznie niższe niż w tkankach. W konsekwencji objętość dystrybucji nie zawsze może być utożsamiana z rzeczywistą objętością płynów fizjologicznych i dla różnych leków waha się od kilku litrów do kilku tysięcy litrów. Stąd parametr ten określa się jako pozorną objętość dystrybucji. Pozorna objętość dystrybucji wyraża hipotetyczną objętość płynów ustrojowych, w których lek, po homogenicznym rozprzestrzenieniu, miałby takie same stężenie jak we krwi. Liczbowa wartość tego parametru daje wyobrażanie o rozmieszczeniu leku w organizmie. Jeżeli objętość dystrybucji danego leku u dorosłego człowieka wynosi 3,5-7 l, oznacza to, że lek pozostaje w łożysku naczyniowym nie przenikając do płynów pozanaczyniowych. Objętość dystrybucji od 10 do 20 l świadczy o przenikaniu leku do przestrzeni pozanaczyniowej i o jego rozmieszczeniu w płynach pozakomórkowych. Gdy parametr ten osiąga wielkość około 40 l (60-70% masy ciała) można stwierdzić, że lek ulega dystrybucji we wszystkich płynach ustrojowych włączając płyn wewnątrzkomórkowy. W przypadku, gdy objętość dystrybucji przekracza 100% masy ciała osiągając wartości rzędu kilkuset litrów można sądzić, że lek silnie wiąże się i kumuluje w

3 tkankach (równanie 6.6). Objętość dystrybucji w znacznym stopniu zależy od masy ciała, stąd często podaje się tzw. względną objętość dystrybucji, gdzie: BW masa ciała (Body Weight). Obliczanie objętości dystrybucji. Objętość dystrybucji pozwala obliczyć stężenie leku w osoczu w przypadku, gdy znana jest jego ilość w ustroju (dawka) lub odwrotnie obliczyć dawkę leku jaką należy podać, aby osiągnąć wymagane stężenie terapeutyczne leku w osoczu. Niezbędnym warunkiem jaki musi być spełniony jest ustalenie się stanu równowagi dystrybucyjnej między stężeniem leku w tkankach i we krwi. Zakładając, że mamy do czynienia z modelem jednokompartmentowym, można wymienić następujące metody wyznaczania objętości dystrybucji: 1) mierząc zmiany stężenia leku we krwi po dożylnym podaniu leku i wyznaczając, przez ekstrapolację, stężenie leku w czasie t=0; D dawka leku. 2) Obliczając pole powierzchni pod krzywą stężenie leku czas, AUC; K - stała szybkości eliminacji. Jest to najbardziej dokładna metoda wyznaczania objętości dystrybucji. Nie ogranicza się do dożylnego podania leku. W przypadku, gdy lek podany jest doustnie należy uwzględnić biodostępność leku F;

4 Tak obliczona objętość dystrybucji, ze względu na sposób jej wyznaczania, określana jest jako V d area. 3) Znając stężenie stacjonarne leku C ss, jakie ustali się podczas długotrwałego wlewu dożylnego, można wyznaczyć objętość dystrybucji korzystając z zależności: gdzie: k 0 szybkość wlewu dożylnego. Obliczanie objętości dystrybucji komplikuje się w przypadku, gdy mamy do czynienia z modelem dwukompartmentowym. Mówimy wówczas o różnych rodzajach objętości dystrybucji, a mianowicie: objętości dystrybucji kompartmentu centralnego (krew i silnie ukrwione tkanki np. wątroba, mózg), kompartmentu tkankowego oraz objętości dystrybucji w stanie równowagi dystrybucyjnej. Zmiany stężenia leku we krwi w modelu dwukompartmentowym, po podaniu jednorazowej dawki dożylnej, opisuje równanie (wyprowadzenie wg [6]): gdzie: są odpowiednio hybrydami stałych szybkości szybkiej i wolnej fazy dyspozycji leku, A i B - wartości przecięcia z osią y prostych obrazujących fazę 2.1). (Ryc.

5 Ryc Stężenie leku w osoczu po jednorazowej dawce dożylnej w modelu dwukompartmentowym w skali półlogarytmicznej jako funkcja czasu. Rozwiązując to równanie można obliczyć objętość kompartmentu centralnego V c korzystając z zależności: ponieważ: A + B = C 0. Innym sposobem obliczania objętości dystrybucji jest, podobnie jak w przypadku modelu jednokompartmentowego, obliczenie wartości AUC, a następnie: Wartością równoważną do jest wielkość, objętość dystrybucji podczas fazy eliminacji leku:

6 lub gdzie: k 10 stała szybkości eliminacji leku z kompartmentu centralnego. Niezmiernie ważną wielkością jest objętość dystrybucji w stanie stacjonarnym, którą można obliczyć z zależności: oraz k + k k Vdss = V (2.13) c gdzie: k 12 i k 21 są odpowiednio stałymi szybkości dystrybucji z kompartmentu centralnego do tkankowego i z tkankowego do centralnego. 21 Objętość dystrybucji w stanie stacjonarnym można obliczyć, podobnie jak w przypadku modelu jednokompartmentowego, podając lek ze stałą szybkością we wlewie dożylnym. Wówczas: V T : Znając wartość V dss można obliczyć objętość dystrybucji kompartmentu tkankowego

7 Powstaje pytanie, która z wyżej wymienionych objętości dystrybucji najpełniej oddaje zależność między stężeniem leku w osoczu (krwi) a ilością leku w ustroju w tym samym czasie. Nie ma takiej uniwersalnej wielkości. Jeśli chcemy obliczyć ilość leku w ustroju w czasie fazy eliminacji leku, wyborem będzie V d lub V d area. W przypadku, gdy chcemy obliczyć dawkę i przedział dawkowania leku, decyzją z wyboru będzie wyznaczenie V d ss. Szeregując ww. objętości dystrybucji według wielkości otrzymujemy zależność: (2.16) gdzie: jest objętością dystrybucji otrzymaną metodą ekstrapolacji Mimo, iż jest wielkością zawyżoną w stosunku do wartości rzeczywistej, jest ona często stosowana ze względu na szybki i prosty sposób jej obliczeń. Klirens, Cl. Eliminacja leku z organizmu jest procesem złożonym, gdyż składa się na nią zarówno metabolizm leku, w wyniku którego cząsteczka leku ulega daleko idącym zmianom do aktywnych i nieaktywnych metabolitów, jak i usuwanie leku drogą wydalania, między innymi, do moczu, żółci, śliny i potu. Szybkość procesu eliminacji określają dwa podstawowe parametry farmakokinetyczne: klirens leku oraz biologiczny okres półtrwania. Klirens posiada największe potencjalne znaczenie kliniczne. Matematycznie, klirens jest to współczynnik proporcjonalności między szybkością eliminacji leku v a jego stężeniem w osoczu C. (2.18)

8 Klirens można również określić jako hipotetyczną objętość dystrybucji, która ulega oczyszczeniu leku w jednostce czasu. Tak zdefiniowany klirens jest tzw. klirensem całkowitym lub ogólnoustrojowym Cl s. Jest on wielkością addytywną, czyli sumą klirensów związanych z różnymi drogami eliminacji leku, a mianowicie: gdzie: Cl H jest klirensem wątrobowym, Cl r klirensem nerkowym, a Cl nr klirensem związanym z innymi drogami eliminacji leku (płuca, skóra, ślina, pot, mleko itd.). Metody obliczania klirensu. 1. Szybkość eliminacji leku v jest równa: ponieważ. Łącząc równanie 2.18 i 2.20 otrzymujemy: Wiedząc, że biologiczny okres półtrwania, otrzymujemy zależność: Jest to ważna zależność łączącą trzy podstawowe parametry farmakokinetyczne. 2. Inny sposób obliczania klirensu oparty jest na wyznaczaniu AUC. Wiemy, że V = dx/dt, zatem równanie 2.18 można przedstawić: (2.23)

9 dx jest ilością eliminowanego leku w małym przedziale czasowym dt, stąd iloczyn C dt jest odpowiednio małą powierzchnią pod krzywą stężenie leku czas. Całkowita ilość leku jaka zostałaby wyeliminowana, a która przy dożylnie podanym leku będzie równa dawce, jest sumą ilości leku eliminowanych w każdym przedziale czasowym lub czyli AUC. Klirens będzie więc równy: W metodzie tej nie musimy znać biologicznego okresu półtrwania ani objętości dystrybucji, aby obliczyć klirens. Równocześnie ten sposób obliczania klirensu nie zależy od rodzaju (modelu farmakokinetycznego) krzywej stężenie czas. Łącząc równanie 2.21 oraz 2.24 otrzymujemy zależność 2.3 i można w porosty sposób obliczyć objętość dystrybucji. 3. Klirens można obliczyć podając lek we wlewie dożylnym. W stanie stacjonarnym szybkość eliminacji leku jest równa szybkości wlewu, a zatem: 4. Gdy lek jest podawany wielokrotnie w dawce doustnej, wówczas uwzględniając przedział dawkowania oraz biodostępność leku F, klirens można obliczyć z zależności: gdzie: - średnie stężenie leku w stanie stacjonarnym. Jak wynika z przedstawionych zależności, całkowity klirens wyznacza się na podstawie oznaczeń leku we krwi. Powyższe zależności (2.25 i 2.26) pozwalają na wyznaczenie klirensu w oparciu o pobraną, jedną próbkę krwi pacjenta. Ma to istotne znaczenie w warunkach klinicznych. Oznaczenia leku we krwi na ogół dotyczą osocza lub surowicy, stąd obliczony klirens będzie właściwie klirensem ogólnoustrojowym osocza (surowicy) Cl s osocze. Wartość klirensu pełnej krwi można obliczyć z zależności:

10 gdzie: H hematokryt. Klirens wątrobowy. Jest on najbardziej bezpośrednim ilościowym miernikiem zdolności wątroby do eliminacji leku. W skład klirensu wątrobowego wchodzi klirens wydalania leku z żółcią oraz klirens metaboliczny. Lek z krwi, po uwolnieniu się z połączenia z białkami osocza oraz z komórkami krwi (erytrocytami), przenika do komórek wątroby (hepatocytów), gdzie jest metabolizowany przez enzymy i/lub wydalany do żółci (Ryc. 2.2). Ryc Eliminacja leku przez wątrobę; a naczynie krwionośne (żyła wrotna, tętnica wątrobowa), b hepatocyt. Klirens wątrobowy jest równy: (2.28) gdzie: - szybkość przepływu krwi przez wątrobę (1,3 l/min), która jest sumą szybkości przepływu krwi przez żyłę wrotną (1 l/min) oraz tętnicę wątrobową (0,3 l/min), ER współczynnik ekstrakcji wątrobowej przyjmujący wartości od 0 do 1. Klirens wątrobowy leków charakteryzujących się dużym współczynnikiem ekstrakcji wątrobowej 0,7 wzrasta wraz ze wzrostem szybkości przepływu krwi przez wątrobę, natomiast wartość współczynnika ekstrakcji pozostaje niezmieniona i niezależna od stopnia wiązania leku z białkami. W przypadku leków o małym współczynniku ekstrakcji 0,3 zmiana szybkości przepływu krwi przez wątrobę nie wpływa na wartość klirensu, natomiast jej wzrost

11 powoduje zmniejszenie się współczynnika ekstrakcji i odwrotnie. W przypadku tych leków zmiana stopnia wiązania z białkami będzie miała istotny wpływ na wartość klirensu. Klirens nerkowy. W eliminacji leku przez nerki biorą udział następujące procesy: filtracji kłębkowej i sekrecji kanalikowej, w wyniku których lek wydalany jest do światła nefronu oraz resorpcji kanalikowej powodującej wchłanianie zwrotne leku w kanalikach nerkowych do krwi (Ryc. 2.3). Ryc Budowa nefronu podstawowej anatomicznej jednostki nerek (wg [9]). Proces filtracji kłębkowej jest procesem biernym, którego szybkość zależy od stężenia leku we krwi, natomiast sekrecja kanalikowa jest procesem aktywnym, wysycalnym, charakteryzującym się ograniczoną pojemnością. Resorpcja kanalikowa może być zarówno procesem biernym, jak i aktywnym. Klirens nerkowy będzie wiec wypadkową wszystkich tych procesów a jego wartość jest równa: (2.29) gdzie: jest klirensem związanym z filtracją kłębkową i jest równy iloczynowi klirensu kreatyniny i ułamka leku wolnego we krwi f B, - klirens związany z sekrecją kanalikową leku, FR ułamek leku wydalonego, który ulega wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Powyższy wzór można również przedstawić w następujący sposób:

12 ( ) gdzie: jest szybkością przepływu krwi przez nerki, ER współczynnik ekstrakcji nerkowej, wewnętrznym klirensem nerkowym a GFR szybkością filtracji kłębkowej. Lewy człon równania w nawiasie odpowiada klirensowi związanemu z filtracją kłębkową, a prawy z sekrecją kanalikową. Jedną z częstszych metod wyznaczania klirensu nerkowego jest pomiar stężenia leku w moczu C u oraz w osoczu C, przy czym próbka krwi pobierana jest w środkowym okresie zbierania moczu, stąd: gdzie: v jest szybkością tworzenia się moczu w ml/min. Inną metodą jest wyznaczenie całkowitej ilości leku eliminowanego z moczem, a następnie obliczenie klirensu nerkowego z wzoru Przy tego rodzaju obliczeniu należy uwzględnić odpowiedni czas, w którym mocz jest zbierany. Na ogół jest to czas odpowiadający 5-6 czasom t 0,5 dla danego leku. Biologiczny okres półtrwania t 0,5. Jest drugim ważnym parametrem farmakokinetycznym określającym szybkość eliminacji leku z ustroju. Jest to czas, w którym stężenie leku we krwi, w osoczu lub surowicy zmniejsza się o połowę w terminalnej fazie eliminacji leku. Biologiczny okres półtrwania określa eliminację leku z organizmu wszystkimi możliwymi drogami, a mianowicie poprzez metabolizm, wydalanie przez nerki oraz eliminację leku innymi drogami, np. przez skórę, płuca itd. Jak wiadomo, wartość t 0,5 w modelu jednokompartmentowy można obliczyć z wzoru (1.8) lub w modelach wielokompartmentowych z następującej zależności:

13 leku we krwi. gdzie: jest nachyleniem terminalnego odcinka krzywej obrazującej zmiany stężenia Wpływ wieku i stanu zdrowia chorego na parametry farmakokinetyczne Parametry farmakokinetyczne wielu leków charakteryzują się międzyosobniczą zmiennością, a także zależnością od wieku, masy ciała oraz stanu zdrowia chorego. Wiek pacjenta ma istotny wpływ na parametry farmakokinetyczne. Wraz z wiekiem wzrasta ph soku żołądkowego, jak również zmniejsza się perystaltyka jelit. Oba te czynniki mogą wpływać na zmianę wchłaniania leku u ludzi starszych, a tym samym na jego biodostępność. Całkowite stężenie białek surowicy zmienia się nieznacznie wraz z wiekiem, natomiast w sposób istotny, u osób starszych, obniża się poziom albumin a także zmniejsza się objętość płynów ustrojowych. Oba te parametry wpływają na objętość dystrybucji leku. Wiek ma niewątpliwy wpływ na klirens leku. U ludzi starszych obserwuje się spadek szybkości przepływu krwi przez nerki, jak również maleje szybkość filtracji kłębkowej. Wpływa to w istotny sposób na zmniejszenie się klirensu nerkowego w tej grupie chorych, podczas gdy klirens wątrobowy pozostaje na ogół stały. Obniżenie klirensu u osób starszych wiąże się z wydłużeniem biologicznego okresu półtrwania leku, w tej grupie chorych, zgodnie z równaniem Istotny wpływ na parametry farmakokinetyczne będzie miał stan zdrowia chorego. Dysfunkcja nerek w sposób istotny może zmienić klirens leku oraz, wpływając na wiązanie leku z białkami (zmiana stężenia albumin), objętość dystrybucji leku. Nawet jeśli lek nie jest eliminowany przez nerki, nieprawidłowa czynność nerek może prowadzić do kumulacji w organizmie jego toksycznych metabolitów. Równie znaczący wpływ na parametry farmakokinetyczne mogą mieć schorzenia wątroby, wpływające na zmiany klirensu ogólnoustrojowego, którego ważnym składnikiem w przypadku niektórych leków jest klirens wątrobowy, związany z metabolizmem leku. Wątroba jest głównym miejscem syntezy albumin i kwasowej 1 -glikoproteiny, z tego powodu wraz ze zmianą czynności wątroby zmienia się ułamek leku wolnego w osoczu, wpływając tym samym na objętość dystrybucji leku. Zmieniona wskutek choroby aktywność metaboliczna wątroby wpłynie z kolei na biologiczny okres półtrwania oraz biodostępność leku.

14 Aparatura: spektrofotometr (SP-830 PLUS Metertech, Taiwan), mieszadło magnetyczne typ MM-5 (Polska), pompa perystaltyczna PA-SF (Kika Labortechnik Staufen, Niemcy). Odczynniki i roztwory: 1% błękit anilinowy. Szkło i materiały laboratoryjne: kolby Büchnera o poj. 250 i 500 ml, pipeta poj. 2 ml, pipeta o poj. 5 ml, stoper. Wykonanie ćwiczenia 1. Do kolby Büchnera o poj. 250 ml nalać wody i zainstalować mieszadło magnetyczne. Uruchomić mieszadło. Tłoczyć wodę za pomocą pompy perystaltycznej ze stałą szybkością (podaną przez asystenta). Woda powinna wolno wypływać z bocznego wylotu kolby (ryc.2.4). Ryc Model hydrauliczny; 1 kolba Buchnera, 2 roztwór błękitu anilinowego, 3 mieszadło magnetyczne, 4 napływ wody tłoczonej z pompy, 5 pobieranie próbek błękitu anilinowego, 6 wpływ (eliminacja) roztworu błękitu anilinowego, 7 odbieralnik (wg [3]). 2. Wprowadzić do środka kolby 1,8 ml roztworu błękitu anilinowego. Włączyć stoper. Po upływie 1, 2, 5 i 10 min. pobierać każdorazowo około 3 ml roztworu z kolby do kuwety pomiarowej. Zmierzyć absorbancję pobranych próbek przy długości fali λ = 610 nm. 3. Doświadczenie powtórzyć, zwiększając dwukrotnie szybkość przepływu wody i dalej postępować tak jak podano w pkt. 3.

15 4. Doświadczenia powtórzyć, używając kolby o dwukrotnie większej objętości (500 ml) i postępować tak jak podano w pkt Wyniki przedstawić w tabeli zawartej w protokole do ćwiczenia 2. Wykorzystując arkusz programu Excel przedstawić otrzymane wyniki jako półlogarytmiczne zależności absorbancji A od czasu t i obliczyć równania prostych zgodnie z zależnością: gdzie: wartość przecięcia z osią y, b= ln A 0, a współczynnik kierunkowy prostej a = - K, czyli stała szybkości eliminacji. 6. Wyznaczyć wartość stężenia C 0 w czasie t = 0, korzystając z zależności: gdzie: jest absorbancją właściwą wyznaczoną z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej dla błękitu anilinowego, równą 247,5 cm -1 g -1 ml. 7. Obliczyć objętość dystrybucji V d i klirens Cl korzystając z wzorów 2.2 i 2.21; gdzie: D dożylnie podana dawka leku, w przedstawionym modelu in vitro, oznacza ilość błękitu anilinowego, w gramach, dodanego do kolby. Pytania 1. Jak zmieni się biologiczny okres półtrwania i klirens, gdy dwukrotnie wzrośnie szybkość przepływu wody przez kolbę (objętość kolby jest stała)? 2. Jak zmiana objętości kolby wpłynie na pozostałe parametry przy stałej szybkości przepływu wody? 3. Spróbuj przedstawiony model in vitro odnieść do organizmu żywego.

16 4. Klirens nerkowy leku wynosi 500 ml/min. O czym świadczy ta wartość? Czy można stwierdzić, że badany lek w małym stopniu wiąże się z białkami osocza? 5. Wskutek schorzenia wątroby klirens ogólnoustrojowy pacjenta obniżył się z 10 do 8 l. Równocześnie wskutek obniżenia się poziomu albumin wzrosła objętość dystrybucji leku z 400 do 600 l. Jak zmieni się biologiczny okres półtrwania?