Ćwiczenie 10. A. Oznaczanie stężenia bilirubiny całkowitej w surowicy krwi. Wymagane zagadnienia teoretyczne 1. Biosynteza hemu - metabolity pośrednie syntezy hemu. 2. Katabolizm hemu - powstawanie barwników żółciowych. 3. Formy występowania bilirubiny. 4. Metabolizm bilirubiny w komórkach wątroby. 5. Zaburzenia metabolizmu i wydzielania bilirubiny - żółtaczki. 6. Przemiany metaboliczne w wątrobie. 7. Specyficzne funkcje wątroby. 8. Rola detoksykacyjna wątroby-detoksykacja związków egzo- i endogennych (enzymy fazy I i II). Zasada oznaczenia: Bilirubina oraz glukuronian bilirubiny ulegają sprzęgnięciu z dwuazoniową solą kwasu sulfanilowego tworząc barwną pochodną azobilirubinę. Rozpuszczalny w wodzie glukuronian bilirubiny wchodzi w reakcję bezpośrednio, natomiast bilirubina połączona z albuminą (bilirubina pośrednia) wymaga wcześniejszej hydrolizy pod wpływem detergentów. Natężenie zabarwienia powstałej azobilirubiny jest proporcjonalne do stężenia bilirubiny całkowitej. Aparatura i sprzęt laboratoryjny: spektrofotometr probówki Eppendorf pipety automatyczne o pojemności 1 cm3, 0,1 cm3 Materiał badany i odczynniki: surowica N lub P wzorzec bilirubiny odczynniki do oznaczania bilirubiny całkowitej (zestaw Liquick Cor-BIL TOTAL) Wykonanie: Odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów jak podano w poniższej tabeli: 1-BIL TOTAL MALLOY- EVELYN Próba badana (PB) Próba kontrolna (PK) Próba wzorcowa (PW) Próba kontrolna wzorca (PKW) 1000 l 1000 l Roztwór roboczy 1000 l 1000 l Ogrzać do temperatury 37 C około 2 minut i następnie dodać Surowica badana 50 l 50 l Kalibrator 50 l 50 l Dokładnie wymieszać. Po 5 minutach odczytać absorbancję próby badanej (PB) wobec próby kontrolnej (PK) oraz absorbancję próby wzorcowej (PW) wobec próby kontrolnej wzorca (PKW) przy długości fali ( -530 nm). Zabarwienie jest stabilne przez 30 min. Obliczenie wyników: PB Stężenie bilirubiny całkowitej [mg/dl] = PW X stężenie kalibratora Wartości prawidłowe Surowica (dorośli) 0,3 1,2 mg/dl 5 21 μmol/l
B. Rozdział elektroforetyczny białek osocza/surowicy krwi w żelu poliakrylamidowym Jednym ze sposobów rozdziału białek osocza krwi jest elektroforeza. Uzyskane tą drogą frakcje stanowią podstawę ogólnie przyjętego podziału białek na albuminy, α1-globuliny, α2-globuliny, β-globuliny, γ-globuliny oraz fibrynogen. Wzajemne relacje ilościowe pomiędzy poszczególnymi frakcjami białek osocza człowieka zdrowego są dość stałe. Białka osocza (lub surowicy) umieszczone w polu elektrycznym wędrują do anody lub do katody w zależności od ph środowiska. 1.1 Przygotowanie żelu poliakrylamidowego. Rozdział elektroforetyczny białek osocza/surowicy krwi jest przeprowadzony przy zastosowaniu żelu poliakrylamidowego bez dodatku czynników denaturujących (PAGE). Przygotowanie żelu poliakrylamidowego polega na polimeryzacji monomerów akryloamidu z tworzącym wiązania krzyżowe N,N-metylenobisakryloamidem zmieszanych ze sobą w odpowiednich proporcjach w obecności nadsiarczanu amonowego i czterymetyloetylodwuaminy (Temed) jako katalizatorów w buforze o odpowiednim ph. 1.2 Elektroforeza białek na żelu poliakrylamidowym. W celu przeprowadzenia elektroforezy aparat do elektroforezy należy wypełnić buforem elektrodowym Tris-glicyna o ph = 8,3 i umieścić w nim płytki z żelem. Do studzienek żelu (8,75%) wprowadzić ostrożnie odpowiednią pipetą po 5 μl badanego, odpowiednio przygotowanego materiału. Elektroforezę należy prowadzić przy napięciu 120 V i natężeniu 20 ma przez 2 3 godziny. Po dojściu barwnika do końca żelu wyłączyć zasilanie prostownika i wyjąć płytki z aparatu. 1.3 Barwienie żeli. Wyjąć żel i ostrożnie przenieść go do kuwety z roztworem barwnika Commassie S, pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zlać barwnik do butelki, a żel przepłukać wodą, po czym umieścić go w odbarwiaczu (10% kwas octowy + 30% mentol), ciągle mieszając. Po 30 minutach zmienić odbarwiacz na nową porcję i czynności te powtarzać aż do uzyskania bezbarwnego tła żelu. Żel po odbarwieniu przechowywać w 5% roztworze kwasu octowego. Studenci otrzymują do analizy elektroforegramy białek osocza (surowicy) krwi rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym. Należy zidentyfikować frakcje białkowe proteinogramu, porównać profile elektroforetyczne białek surowicy krwi w niektórych przypadkach klinicznych. C. Równowaga Gibbsa-Donnana Wykonanie: a. Przygotowanie roztworu dializacyjnego Przygotować 2 zlewki na 150 ml Do jednej zlewki wlać 100 ml wody destylowanej i 10 ml 0,04% błękitu bromofenolowego a następnie dodawać kroplami 0,1 n HCl do momentu uzyskania barwy czerwonej z zieloną fluorescencją. Połowę tak przygotowanego roztworu przelać do drugiej zlewki. (płyn w jednej zlewce to wyjściowa kontrola barwy dla roztworu dializacyjnego, a w drugiej będzie umieszczony worek dializacyjny zawierający białko). b. Przygotowanie roztworu białka do badania. Do zlewki na 100 ml wlać 10 ml roztworu białka (albumina jaja w 0,9% NaCl), 9 ml wody destylowanej i 1 ml 0,04% błękitu bromofenolowego. Następnie dodawać kroplami, stale mieszając, 1 n HCl do momentu uzyskania barwy niebiesko-zielonej. 15 ml tak przygotowanego roztworu albuminy przenieść do worka dializacyjnego (worek celofanowy jako błona półprzepuszczalna). Pozostały roztwór białka pozostawić jako kontrolę dla porównania barwy roztworu w worku dializacyjnym po upływie 1 godziny. Worek dializacyjny umieścić w zlewce zawierającej płyn dializacyjny przygotowany w punkcie a. Po upływie około 1 godziny obserwuje się zmianę zabarwienia obu roztworów - w płynie dializacyjnym i w worku dializacyjnym zawierającym roztwór białka. Płyn dializacyjny, w którym umieszczono worek ma kolor żółty, a płyn w worku dializacyjnym, w którym umieszczono roztwór albuminy ma kolor fiołkowo-czerwony.
Wyjaśnienie: Półprzepuszczalna błona komórkowa oprócz cząsteczek wody przepuszcza także niektóre substancje w niej rozpuszczalne np. niskocząsteczkowe substancje nieorganiczne i organiczne (selektywna półprzepuszczalność). Równowaga Gibbsa-Donnana oznacza, że po stronie błony gdzie są jony koloidalne niezdolne do przechodzenia przez błonę, stężenie jonów zdolnych do przechodzenia przez błonę posiadających ten sam ładunek co koloid jest mniejsze a stężenie jonów przeciwnego ładunku większe - nierównomierne rozmieszczenie jonów. Po ustaleniu równowagi w myśl prawa Donnana muszą być ustalone dwa warunki: Z każdej strony błony suma kationów i anionów musi być sobie równa. Iloczyny stężeń jonów dyfundujących muszą być równe po obu stronach błony. W momencie równowagi: [H + ] z x [Cl ] z = [H + ] w x [Cl ] w W warunkach przeprowadzanego doświadczenia w płynie wewnętrznym (worek dializacyjny) jon Cl występuje zarówno jako B + Cl jak i H + Cl, a w płynie dializacyjnym (na zewnątrz worka dializacyjnego) tylko jako H + Cl. Kationy białczanowe będą wypychać na zewnątrz worka dializacyjnego równoimienne jony, dlatego [H + ] w < [Cl ] w. Natomiast w płynie zewnętrznym (dializacyjnym) znajduje się tylko H + Cl i dlatego [H + ] z = [Cl ] z Stężenie jonów wodorowych w płynie zewnętrznym jest większe niż wewnątrz worka dializacyjnego, ([H + ] w < [H + ] z ) a więc roztwór wewnątrz worka dializacyjnego jest mniej kwaśny. Im więcej białka znajduje się po jednej stronie błony półprzepuszczalnej tym większa wytworzy się różnica w rozmieszczeniu jonów. Zjawisko to ma duże znaczenie w regulacji ciśnienia osmotycznego, a także w regulacji ph środowiska wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego.
BIOCHEMIA Imię i Nazwisko GS... Data... A. Oznaczanie stężenia bilirubiny całkowitej w surowicy krwi. Zasada metody:........ Wykonanie :....... Obliczenia: Absorbancja próby badanej : Absorbancja próby wzorcowej: Stężenie bilirubiny całkowitej w badanej próbie:..... Wniosek końcowy:...... B. Rozdział elektroforetyczny białek osocza/surowicy krwi na żelu poliakrylamidowym: Interpretacja proteinogramu:.
C. Równowaga Gibbsa-Donnana Interpretacja wyniku:................ Wniosek końcowy:........... Umiejętności: Kompetencje: zaliczono nie zaliczono ocena pozytywna ocena negatywna Data i podpis prowadzącego