Ćwiczenie 31 Metodyka poprawnych i dokładnych pomiarów widm absorbancji w zakresie UV-VIS. Wpływ monochromatyczności promieniowania i innych parametrów pomiarowych na kształt widm absorpcji i wartości absorbancji oraz na błąd ich wyznaczenia. Zagadnienia: spektroskopia absorpcyjna, prawa absorpcji, budowa i działanie spektrofotometru, czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wyznaczane wartości absorbancji, dobór warunków dla pomiaru widm absorpcji i wyznaczania poprawnych wartości absorbancji, błędy przypadkowe i systematyczne w pomiarach absorbancji. Wstęp Praktycznie wszystkie związki chemiczne niezależnie w jakiej postaci występują (monomerów M, dimerów DM, większych agregatów, czy też kompleksów) absorbują w zakresie UV, λ=185-220 nm. Ogromna większość związków absorbuje także w zakresie długofalowym, 300>λ>220 nm, zaś bardzo wiele związków także w zakresie widzialnym λ 350 nm. Obok spektroskopii emisyjnej i spektrometrii mas spektroskopia UV-VIS należy do najczulszych eksperymentalnych metod. Dlatego też spektroskopia UV-VIS jest bardzo powszechnie wykorzystywana w badaniach podstawowych oraz licznych zastosowaniach analitycznych w tym praktycznych, tak w badaniach jakościowych jak i ilościowych. W tym celu stosuje się spektrofotometry pracujące najczęściej w zakresie spektralnym λ=200-800 nm (ν=50000-12500 cm -1 ). Korzystając z nich można wykonywać także pomiary w zakresie ultrafioletu próżniowego, =175-200 nm, (ν-57140-50000 cm -1 ) przedmuchując komorę, w której znajdują się kuwety z próbkami gazowym azotem. Możliwe są też pomiary w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR) do 4000 nm (ν-2500 cm -1 ), sięgającym aż do zakresu spektralnego, w którym stosuje się spektrometry IR i Ramana. Ze względu na przywołane wyżej niezwykle cenne zalety spektroskopia UV-VIS jest ona zdecydowanie najczęściej stosowana spośród wszystkich istniejących metod do detekcji w metodzie HPLC, niezastąpionej metodzie analitycznej i badawczej. Praktycznie wszystkie 1
chromatografy cieczowe tak HPLC jak i UPLC stosują fotodiodowe spektrometry UV-VIS jako podstawowe, a nierzadko jedyne detektory. Część teoretyczna. bsorbancję próbki, w której absorbuje jeden związek opisuje ilościowo prawo Lamberta- Beera (1): absorbancja skolimowanej wiązki monochromatycznego promieniowania w jednorodnym, izotropowym ośrodku jest proporcjonalna do wartości molowego współczynnika absorpcji (mol -1. cm -1. dm 3 ) i do stężenia c (mol. dm -3 ) badanego związku oraz do długości drogi optycznej (l), na której zachodzi absorpcja. Molowy współczynnik absorpcji (ε), który zależy od długości fali charakteryzuje własności absorpcyjne każdego związku. Ta zależność jest faktycznie widmem absorpcji. Wartość molowego współczynnika absorpcji w zależności od typu przejścia ( *, n *, *, itp.) może zmieniać się w bardzo szerokim zakresie od wartości niewiele większych od zera (np. ε = 10-2 mol -1 dm 3 cm -1, na długofalowym ogonie pasma absorpcji), aż do wartości ~ 10 6 mol -1 dm 3 cm -1, dla przejść w pełni dozwolonych. Jeśli w badanej próbce obecne jest tylko jedno indywiduum (tj. najczęściej pojedyncze cząsteczki badanego związku), to wartość ε nie zależy od stężenia. bsorbancję próbki, w której absorbuje więcej niż jeden związek opisuje prawo addytywności absorbancji (2). c l (1) 1 2 3 i (2) Eksperymentalnie wartość absorbancji zgodnie z równaniem (3) jest wyznaczana w oparciu o pomiar intensywności światła przepuszczonego (transmitowanego) przez kuwetę z badanym roztworem, I T, które dotarło do detektora, a którym jest najczęściej fotopowielacz. I o log logt (3) I T gdzie I 0 - intensywność światła padającego na próbkę 2
Niezależnie od tego czy pomiar absorbancji odbywa się w spektrofotometrze dwuwiązkowym (jednoczesny pomiar dla próbki i dla odnośnika) czy też jednowiązkowym (kolejno pomiar dla próbki i dla odnośnika) przyjmuje się, że w pomiarach absorpcji spełnione jest równanie 4 IT I 0 I abs (4) zaś I I (1 10 wzb ) (5) abs 0 I abs -liczba kwantów zaabsorbowanych przez badany związek wyznaczona z równania 5 lub z pomiarów aktynometrycznych, Wpływ na wartość I T obok absorpcji promieniowania przez próbkę mają także: odbicie światła (I odb ) na przedniej i tylnej ścianie kuwety z badanym roztworem, absorpcja tego światła przez samą kuwetę (I a-k ), rozpraszanie światła w rozworze (I rozp ) a także absorpcja światła przez rozpuszczalnik (I a-r ) i ewentualne zanieczyszczenia w nim obecne (I a-z ). Tak więc, w rzeczywistych pomiarach absorpcyjnych wartość I T opisuje równanie 6. I T = I 0 -I abs -(I odb +I rozp +I a-k +I a-r +I a-z ) (6) by równanie 4 było spełnione wszystkie wartości w równaniu 6 oprócz I abs muszą być takie same dla próbki i dla odnośnika. Tylko w takich warunkach spełnione jest równanie Lamberta-Beera, a zmierzone wartości ( ) zależą wyłącznie od absorpcji badanego związku. Różnica jakiejkolwiek innej wartości w równaniu 6 dla próbki i odnośnika powoduje systematyczne błędy w pomiarach absorbancji. Wyznaczanie błędu pomiaru absorbacji za pomocą spektrofotometru UV-VIS. Proste spektrofotometry UV-VIS mierzą najczęściej W z błędem Δ=±1x10-3. Dobrej klasy spektrofotometry, np. stosowane do wykonywania tego ćwiczenia z błędem Δ =±1x10-4, zaś spektrometry fotodiodowe stosowane jako detektory w aparatch HPLC i UHPLC z bardzo małym błędem Δ=±(1-2)x10-5. 3
Wartości Δ dla każdego spektrofotometru wyznacza się korzystając z wyniku pomiaru linii zerowej spektrofotometru (w komorze pomiarowej nie ma kuwet). Na odpowiednio małym zakresie (najczęściej 1x10-2 ) linia zerowa spektrofotometru ma odpowiednio dużą grubość. Dzięki temu wprost można wyznaczyć wartość Δ (błąd pomiaru dla pojedynczego pomiaru) w całym zakresie długości fali, w którym można mierzyć W. Najmniejsze wartości dla badanej próbki, które można mierzyć na danym spektrofotometrze muszą być co najmniej 2 razy większe od wartości Δ, tj. /Δ 2 (ogólnie S/N 2, gdzie S-wielkość sygnału (signal), N-wielkość szumów (noise). Korzystając z dobrej klasy spektrofotometrów UV-VIS, dla których Δ=±1x10-4 można mierzyć W i (λ) dla próbek, których absorbancja jest bardzo mała. Gdy mierzona (λ)=1x10-3 to błąd wyznaczonej absorbancji wynikający wprost z Δ danego aparatu wynosi Δ/=0.1, tj. 10%; gdy (λ)=1x10-2 a Δ=±1x10-4, to błąd pomiaru wynosi zaledwie 1%. Poprawny pomiar absorbancji () ma bezpośredni wpływ na błąd wyznaczanych wartości molowego współczynnika absorpcji (równanie 7) i stężenia badanego związku w próbce c (równanie 2), wydajność kwantową jego emisji E (równanie 9) i zaniku fotochemicznego, FOT (równanie 10). c l (7) c (8) l Dokładny pomiar absorbancji. W wymienionych wyżej zastosowaniach spektroskopii absorpcyjnej UV-VIS, a także szeregu innych jej zastosowaniach, konieczny jest bardzo dokładny pomiar wartości. Często są to małe absorbancje, <0.1, a nawet 10-2. Ilościowe pomiary widm absorbcji w szerokim zakresie stężeń, a więc i wartości, (w tym w zakresie małych wartości ) są wykorzystywane także do badania tworzenia dimerów i wyższych merów, oraz kompleksów z rozpuszczalnikiem, czy też z odpowiednio dobranym związkiem (wygaszaczem, sensybilizatorem, surfaktantem, cyklodekstryną, itp.). Liczne są zastosowania badawcze i 4
analityczne spektroskopii UV-VIS, w których mierzone są bardzo małe wartości. Nierzadko przyczyną tego mogą być małe wartości molowego współczynnika absorpcji, konieczność użycia małych stężeń, (ze względu na łatwość tworzenia dimerów, a nawet oligomerów, np. dla porfiryn i barwników oraz ich pochodnych), słaba rozpuszczalność badanych związków, a także ich wysoki koszt. Wiarygodny i powtarzalny pomiar małych wartości z błędem poniżej 10% (a nawet 5%) jest możliwy. Wymaga on jednak poznania rzeczywistych możliwości pomiarowych stosowanego spektrofotometru i jego kalibracji, a także wyboru właściwych parametrów pomiaru. Koniecznym warunkiem aby można mierzyć wiarygodne W dla próbek o bardzo małych wartościach (λ) jest także dobre zrozumienie metodyki ilościowych pomiarów absorbancji, czynników które obok rzeczywistej absorbcji mogą istotnie wpływać na mierzoną wartość (patrz równanie 1), jak również stosowania specjalnej procedury pomiarowej. Dzięki temu, że możliwe są poprawne i dokładne pomiary bardzo małych wartości absorbancji, ~ 10-2, można wyznaczać bardzo małe stężenia badanych związków. Dla związku dla którego ε(λ max )=5x10 4 mol -1 dm 3 cm -1, a użyta kuweta (4) ma l=5cm to wartość (λ) max ~10-2 otrzyma się gdy jego stężenie jest bardzo małe i wynosi c=1x10-4 /5x10 4 x5=4x10-8 mol//dm 3. Cele ćwiczenia Ćwiczenie ma charakter metodyczny. Jego celem jest zbadanie jak warunki pomiaru, w szczególności szerokość spektralna (monochromatyczność) promieniowania wpływa na mierzone W, w tym na wartości absorbancji w maksimum pasm ( max ), w minimum pasm ( min ) ich położenie ( max ) i szerokość w połowie wysokości ( 1/2 ), a także na błędy wyznaczonych wartości max. Pomiary będą wykonane dla związków istotnie różniących się kształtem widm, szerokością pasm absorpcji i obecnością w nich struktury oscylacyjnej. Celem ćwiczenia będzie także zbadanie jaki wpływ na dokładność i precyzję pomiaru W oraz na błąd wartości absorbancji, mają czas pomiaru (czas integracji) dla danej długości fali, oraz odległość między najbliższymi długościami fali, dla których mierzy się wartość (λ) (krok pomiaru). Badania wpływu monochromatyczności (szerokości szczeliny monochromatora) oraz czasu pomiaru wartości dla danej długości fali i odległości (kroku) między punktami pomiarowymi będą wykonywane dla roztworu antracenu w cykloheksanie 5
ponadto badania wpływu monochromatyczności promieniowania na W będą prowadzone dla roztworu benzofenonu w wodzie. Pasmo w widmie absorpcji tego związku jest szerokie i nie zawiera struktury oscylacyjnej. Do pomiaru W stosowane będą kuwetki o grubości 1cm. Należy podkreślić, że aby wyznaczyć poprawne i dokładne W i wartości (λ) konieczne jest zarówno wyeliminowanie wpływu innych zjawisk niż absorpcja światła na wartość absorbancji (Ćwiczenie 30), jak i dobranie odpowiednich parametrów pomiaru W (Ćwiczenie 31) na stosowanych w ćwiczeniach spektrofotometrach. Część eksperymentalna Pomiary widm absorpcji będą wykonane na spektrofotometrze V-550 (JSCO). Schemat optyczny spektrofotometru V-550 podany jest na Rys. 1. Rys.1 Schemat dwuwiązkowego spektrofotometru UV-VIS na przykładzie V-550 (Jasco). Wartości dla wszystkich zmierzonych W będą wyznaczane dla następujących długości fali : -w maksimach pasm absorpcji, -dla kilku długości fali, dla których wartości wyraźnie się różnią, (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie), w tym dla długości fali, dla której ~10-2, -w zakresie długofalowym, w którym nie absorbuje badany związek (2-3 długości fali). 6
Dobór warunków pomiaru W, (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie), należy określić korzystając z załączonych W badanych związków (pkt. 3) wykonanych w warunkach standardowych: szczelina 1,2-1nm, krok pomiarowy 1nm, czas pomiaru 0.25 s, (fast). nalogicznie, jak w ćwiczeniu 30 w celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników pomiarów oraz W, które nie są zniekształcone należy brać pod uwagę kształt W, wyznaczone wartości oraz przebieg linii zerowej w zakresie długofalowym gdzie nie absorbuje badany związek. W wyborze optymalnych parametrów pomiarowych dla V-550 (Jasco) należy kierować się danymi zawartymi w Tabeli na stronie 5 Metodyki pomiarów W. Wykonanie ćwiczenia W ramach ćwiczenia należy zmierzyć kolejno: 1. linię zerową spektrofotometru, 2. W rozpuszczalnika w kuwecie próbki względem pustej kuwety odnośnika, 3. W rozpuszczalnika w kuwecie próbki względem rozpuszczalnika w kuwecie odnośnika, 4. W roztworu badanego związku względem rozpuszczalnika w kuwecie odniesienia, 5. powtórzyć pomiar 4, 6. powtórzyć pomiar 1, 7. powtórzyć pomiar 4. by można określić wpływ poszczególnych parametrów spektrofotometru na mierzone W oraz wyznaczane wartości max, max, wykonać dla poniżej podanych warunków. 1/2 i błędy pomiarów, należy powyższe pomiary antracen w cykloheksanie widmo w czas pomiaru szybkość szczelina krok pomiar zakresie dla jednego pomiaru (nm) (nm) (nm) (s) (nm/min) 1, 2, 6 300-450 1 1 0.25 (fast) 200 3-5, 7 300-450 0.5, 1, 2, 5, 10 1 0.25 200 7
3-5 370-400 0.5 0.2, 0.5, 1, 2 0.25 40 benzofenon w wodzie pomiar widmo w szybkość szczelina krok czas pomiaru dla zakresie pomiaru (nm) (nm) jednego (s) (nm) (nm/min) 1, 2, 6 200-400 1 1 0.25 200 3, 4, 7 200-400 1, 5, 10 1 0.25 200 3, 4 200-400 2 2 0.03 (quick), 0.25 (fast) 1 (medium), 4 (slow) 200 Opracowanie wyników W oparciu o przeprowadzone pomiary absorpcyjne dla antracenu i benzofenonu, dla których kształt i szerokość spektralna pasm w W znacznie różnią się, należy wyznaczyć wpływ: szerokości spektralnej promieniowania ( odległości ( ) między długościami fali, dla których mierzy się wartości, 1/2 ), czasu pomiaru (t) wartości dla danej długości fali na: - mierzone wartości max λ, max, min, 1/2 ν, dla 4 pasm wibracyjnych (0,0), (0,1), (0,2) i (0,3) w widmie absorpcji S 0 S 1 antracenu w cykloheksanie, - mierzone wartości dla kilku długości fali (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie) dla benzofenonu w wodzie. W celu wyznaczenia poprawnej wartości absorbancji dla antracenu i benzofenonu, dla wybranych długości fali należy wyznaczyć dodatkowo wartości absorbancji ( lz ) dla dwóch długości fali, dla których antracen i benzofenon nie absorbują promieniowania, tzn. wyznaczyć położenie linii zerowej w danym pomiarze W. Dla obu związków może to być 8
-400 nm i -430. W obliczeniach poprawnych wartości uwzględnić także mierzone wartości absorbancji dla samego rozpuszczalnika ( R ), (pomiar 3), wynikające z nieidentycznych parametrów stosowanych kuwet. Wyznaczyć średnie wartości śr z pomiarów 4, 5 i 7 i wartości błędu maksymalnego ( max ) korzystając z równań: śr = śr (exp) ( lz + R ) max max śr śr śr śr min max Literatura: [1]-Materiały dotyczące spektroskopii absorpcyjnej dostępne w Internecie na stronie http://www.staff.amu.edu.pl/~iwonam/student.htm, [2]-Zbigniew Kęcki, Podstawy spektroskopii molekularnej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998, [3]-Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997, [4]-P. W. tkins, Podstawy chemii fizycznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999, 9