Wstęp teoretyczny Asymetryczna dystrybucja uszkodzeń komórkowych może być jedną z strategii zapobiegających starzeniu się linii komórkowych powodując tym samym proces starzenia chronologicznego pojedynczych komórek. Dzięki akumulacji uszkodzeń w jednej z komórek potomnych możliwe jest odmłodzenie drugiej. Z tego powodu w hodowli degenerują komórki starzejące się - mające większą ilość uszkodzeń ale cała hodowla jest utrzymana przez komórki odmładzane, które nie otrzymują uszkodzonych elementów. Przykłady tego zjawiska można zobaczyć u wielu organizmów jednokomórkowych ale także w niektórych komórkach organizmów wielokomórkowych. Czy nieśmiertelność linii komórek nowotworowych jest możliwa dzięki temu procesowi? Przykłady procesów związanych z asymetryczną dystrybucją składników kom.(w tym uszkodzeń): Bakterie: - E. coli dzieląc się tworzą stary i nowy biegun. Obie komórki potomne wyglądają identycznie, jednak śledząc losy bakterii dziedziczących stary biegun obserwuje się zmniejszoną liczbę ich podziałów, zwiększenie czasu między podziałami oraz ich zwiększoną śmiertelność [Stewart, 2005] - Agregaty uszkodzonych białek wybarwione za pomocą przyłączonego do nich, wyznakowanego białka opiekuńczego (IbpA), dziedziczą się asymetrycznie, a komórki dziedziczące agregaty starzeją się w taki sam sposób jak zostało to zaobserwowane przez Stewarta i wsp. [Lindner, 2008] (rys. 1) - Rozbudowa ściany bakteryjnej zachodzi głównie na 1 biegunie bakterii [Brown i wsp., 2011] Rysunek Starzenie i asymetryczna dystrybucja uszkodzeń u E.coli [Linder 2008] Drożdże: - S. cerevisiae dzieląc się asymetrycznie przez pączkowanie nie przekazują pączkom pozachromosomalnych kolistych cząsteczek rybosomanlego DNA (Extrachromosomal ribosomal DNA circles - ERC), co umożliwia odnowienie limitu replikacyjnego. Brak białek
odpowiedzialnych za ten proces (Sir2) powoduje symetryczny podział ERC, przez co kolejne pączki pochodzące z danej komórki-matki żyją coraz krócej [Sinclair i Guarente, 1997] - Kompleksy porów jądrowych z komórki-matki u S. cerevisiae nie przedostają się do pączków. W każdym pączku 80% kompleksów jest syntetyzowana de novo i wbudowywana w błonę jądrową [Shcheprova i wsp., 2008] - Agregaty białkowe w komórce-matce S. cerevisiae analogicznie nie przechodzą do pączka [Aguilaniu i wsp., 2003] Komórki macierzyste: - nieodpowiednio sfałdowane białka są nierównomiernie dziedziczone przez neuroblasty D. melanogaster oraz przez komórki mysich krypt jelitowych, gdy po asymetrycznym podziale komórki macierzystej komórka dalej różnicująca dziedziczy agresom (opisane później) [Rujano, 2006]. Podczas starzenia się komórki akumulują uszkodzone i niepoprawnie sfałdowane białka, które mogą tworzyć agregaty białkowe i uniknąć degradacji. Akumulacja białek w postaci agregatów jest najbardziej widoczna w komórkach postmitotycznych, stanowiąc przyczynę licznych patologii (chorób neurodegeneracyjnych). Jest więc możliwe, że zdolność komórek do podziału jest związana z usuwaniem agregatów białkowych. Agregaty białkowe mogą mieć postać drobnych inkluzji lub agresomów. Agresom jest definiowany jako pericentriolarna, cytoplazmatyczna inkluzja, która zawiera ubikwitynowane, nieodpowiednio sfałdowane i uszkodzone białka otoczona filamentami wimentynowymi. Powstaje on z mniejszych agregatów, które są transportowane w wzdłuż mikrotubul w sposób zależny od dyneiny (rys. 2). Wykazano akumulację licznych białek w agresomach, które są charakterystyczne dla patologii: CFTR (mukowiscydoza) [Johnston, 1998], białko PrP (choroby prionowe) [Beaudoin, 2008] czy Huntingtyna [Waelter, 2001; Rujano, 2006] w wielu liniach komórek normalnych i nowotworowych.
Rysunek Model formowania się agresomu [Garcia-Mata, 2002] Odkryto asymetryczną dystrybucję agresomów w komórkach macierzystych i linii HEK [Rujano, 2006]. Występowanie asymetrycznego przekazania agresomu nie zostało jednak sprawdzone w innych liniach komórkowych, w tym w liniach komórek nowotworowych. Podczas gdy asymetryczna dystrybucja agregatów białkowych wpływa na różnice w szybkości wzrostu i śmiertelności bakterii [Linder, 2008], wpływ ten nie został zbadany u wyższych eukariota. W komórkach nowotworowych wiele białek jest nadekspresjonowanych lub zmienionych strukturalnie ze względu na liczne mutacje. Białka te mogą pojawiać się w komórkach nowotworowych w postaci agregatów [Huo, 2010]. Nie został jednak poznany wpływ asymetrii dystrybucji agregatów(w postaci agresomów lub mniejszych inkluzji) na śmiertelność komórek nowotworowych. Nadekspresja cytoplazmatycznej formy białka PrP (CyPrP) może prowadzić do powstania agresomu lub mniejszych, drobnych inkluzji w zależności od linii komórkowej a także czasu transfekcji plazmidem kodującym CyPrP (rys. 3) [Beaudoin, 2008]. Komórki nowotworowe podobnie jak komórki macierzyste mają bardzo wysoki limit podziałowy a niektóre ich rodzaje przypuszczalnie nie mają go w ogóle (ESC, nowotworowe komórki macierzyste). Zakładając, że postępująca z czasem akumulacja w postaci agregatów uszkodzonych i nieprawidłowo sfałdowanych białkek ma znaczący wpływ na ich żywotność, komórki te mogą na dwa sposoby radzić sobie z agregatami umożliwiając nieśmiertelność linii komórkowych: 1. Pozbywając się agregatów na drodze autofagii 2. Asymetrycznie przekazując agregaty, tak jak niektóre uszkodzenia są asymetryczne przekazywanie w E.coli, S. cerevisiae czy komórkach macierzystych.
Rysunek Charakterystyka dwóch typów agregatów CyPrP w różnych komórkach. (A) Formacja agresomów (pierwsze zdjęcie po lewej) lub ciałek inkluzyjnych (reszta zdjęć) wywołana transfekcją plazmidem kodującym CyPrP w zależności od linii komórkowej. (B) Czasu transfekcji także wpływa na procent komórek u których zaobserwowano agresomy lub rozproszone agregaty: N2a (czarne kolumny), Hela (białe kolumny) [Beaudoin, 2008]. Nie wykazano dotychczas związku między nieśmiertelnością linii komórek nowotworowych a asymetryczną dystrybucją potencjalnie szkodliwych elementów. Podstawowe cele projektu: 1) Potwierdzenie pojawiania się agresomów lub mniejszych ciałek inkluzyjnych w zależności od czasu transfekcji i rodzaju linii komórkowej. 2) Potwierdzenie asymetrycznej dystrybucji agresomu w komórkach normalnych oraz sprawdzenie czy proces ten dotyczy także komórek nowotworowych 3) Zbadanie symetrii dystrybucji mniejszych ciałek inkluzyjnych w komórkach normalnych i nowotworowych 4) Sprawdzenie wpływu obecności agresomu/mniejszych ciałek inkluzyjnych na przeżywalność komórek normalnych i nowotworowych 5) Sprawdzenie wpływu cytotoksyn/szkodliwych warunków fizykochemicznych na komórki dziedziczące agresom/mniejsze ciałka inkluzyjne Cele dodatkowe: 1) Zbadanie wpływu inhibicji tworzenia agresomu na komórki 2) Zbadanie wpływu inhibicji autofagii na komórki
Plan projektu: 1. Hodowla komórkowa Hodowane linie komórkowe HEK i Hela (+ być może inne linie nowotworowe). 2. Namnożenie i wyizolowanie otrzymanych plazmidów ekspresyjnych z hodowli bakteryjnej. 3. Testy cytotoksycznego wpływu MG132, nokodazolu i paklitakselu na linie komórkowe HEK i HeLa. 4. Ocena wpływu MG132 i nokodazolu na zdolność do agregacji i tworzenia agresomów 5. Ilościowa ocena wydajności ekspresji poszczególnych plazmidów i zmiany pod wpływem paklitakselu i różnych warunków fizyko-chemicznych. 6. Transfekcja przejściowa komórek plazmidem. Planuje się przeprowadzenie transfekcj przy użyciu TrasnlT -2020 (i/lub GeneJuice) zgodnie z instrukcja producenta. Stosując różne czasy transfekcji prawdopodobnie możliwe będzie utrzymanie rozproszonych inkluzji lub agresomów [Beaudoin, 2008] 7. Obserwacja symetrii dystrybucji agregatów Prawdopodobnie niezbędne będzie zablokowanie aktywności proteasomów. Planuje się wykorzystanie MG132 [Beaudoin, 2008]. Sprawdzanie symetrii dystrybucji inkluzji poprzez liczenie foci (rys. 1) uszkodzeń przed i po podziale w każdej komórce i/lub agresomów przez ustalenie jego lokalizacji po podziale przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z wykorzystaniem techniki time-lapse. 8. Obserwacja losów komórek po asymetrycznym odziedziczeniu większej liczby/całości uszkodzeń. 1) Sprawdzenie, czy te komórki charakteryzują się zmniejszoną zdolnością do podziałów lub większą umieralnością z wykorzystaniem techniki time-lapse, być może podobnie jak w przypadku bakterii [Linder, 2008]. 2) To samo, tylko po zmianie warunków fizykochemicznych (np. zmiana temperatury) oraz potraktowaniu komórek cytotoksynami (cis-platyna, paclitaksel)
9. Obserwacja powstawania agregatów i ewentualnej symetrii ich dystrybucji po zahamowaniu tworzenia agresomów lub inhibicji autofagii W celu inhibicji autofagii planuje się wykorzystanie 3-metyloadenin. Sposób inhibicji tworzenia agresomów pozostał jeszcze do ustalenia. 10. *Ustalenie mechanizmu powstawania agresomów poprzez badania oddziaływania badanych białek i ich agregatów z białkami specyficznymi dla agresomów za pomocą techniki BiCF. Dodatkowo rozważane jest: Zastosowanie przeciwciał aby możliwe było pokazanie, że dany agregat stanowi agresom: wykorzystanie przeciwciał przeciw ubikwitynie, mikrotubulom lub wimentynie. Wykorzystanie techniki Bimolecular fluorescence complementation [Fang, 2004] Bibliografia: Aguilaniu H, Gustafsson L, Rigoulet M, Nystrom T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science, 2003 Beaudoin S, Goggin K, Bissonnette C, Grenier C, Roucou T. Aggresomes do not represent a general cellular response to protein misfolding in mammalian cells. BCM Cell Biology, 2008 Browna P.J. B., de Pedro M., Kyselac D., Van der Henst C., Kima J., De Bollec X., Fuquaa C., Brun Y. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2011 Fang U, Kerppola T. Ubiquitin-mediated fluorescence complementation reveals that Jun ubiquitinated by Itch/AIP4 is localized to lysosomes. PNAS, 2004 Garcia-Mata R, Ya-Sheng Gao, Sztul E. Hassles with taking out the garbage: aggravating aggresomes. Traffic, 2002 Huo Q. Protein complexes/aggregates as potential cancer biomarkers revealed by a nanoparticle aggregation immunoassay. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010 Johnston JA, Ward CW, Kopito RR. Aggresomes: A cellular response to misfolded proteins. J Cell Biol. 1998 Lark, K. G., Consigli, R. A. & Minocha, H. C. Segregation of sister chromatids in mammalian cells. Science 1966 Lindner A.B., Madden R., Demarez A., Stewart E.J., Taddei F.:Asymmetric segregation of protein aggregates is associated with cellular aging and rejuvenation. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2008 Rujano MA, Bosveld F, Salomons FA, Dijk F, van Waarde MA, van der Want JJ, de Vos RA, Brunt ER, Sibon OC, Kampinga HH. Polarised asymmetric inheritance of accumulated protein damage in higher eukaryotes. PLoS Biol, 2006 Shcheprova Z, Baldi S, Frei SB, Gonnet G, Barral Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast
budding. Nature, 2008 Sinclair DA, Guarente L. Extrachromosomal rdna circles - A cause of aging in yeast. Cell, 1997 Steinhauser M.L., P. Bailey, Samuel E. Senyo,, Christelle Guillermier, Todd S. Perlstein, Alex P. Gould Richard T. Lee1, Claude P. Lechene. Multi-isotope imaging mass spectrometry quantifiesstem cell division and metabolism. Nature, 2011 Stewart EJ, Madden R, Paul G, Taddei F. Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division. PLoS Biol, 2005 Waelter S, Boeddrich A, Lurz R, Scherzinger E, Lueder G, et al. Accumulation of mutant huntingtin fragments in aggresome-like inclusion bodies as a result of insufficient protein degradation. Mol Biol Cell, 2001.