Płynna biopsja jako nowa metoda diagnostyczna w chorobach wątroby Dr. Marcin Krawczyk 1 Laboratorium Chorób Metabolicznych Wątroby, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, Saarland University, Homburg, Germany
Mikrocząsteczki komórkowe - ang. extracellular vesicles (EVs) Opisane po raz pierwszy w roku 1967 przez Wolf et al jako platelet dust, zanieczyszczenie Analizy przy pomocy FACS i proteomiki pozwoliły w ostatnich latach na dokładną charakterystykę EVs EVs są uwalnianymi przez komórki nośnikami bioaktywnych czynników (np. białek, kwasy nukleinowe, mirna) Możliwość zastosowania jako nieinwazyjnych biomarkerów w onkologii tzw. liquid biopsy Julich et al., Front. in Immunology 2016
Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe 100-1000 nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013
Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe 100-1000 nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Eksosomy: <100 nm Uwalniane z wnętrza komórek Analiza: proteomika Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013
Rak wątrobowokomórkowy - HCC Najczęstszy nowotwór wątroby, stanowi 90% pierwotnych nowotworów wątroby. HCC stanowi 7% wszystkich nowotworów złośliwych Rocznie na świecie rozpoznaje się ok. 750 tysięcy nowych zachorowań na HCC. Liczba rozpoznań HCC i zgonów związanych z tym nowotworem wyniosła w 2008 r. w Europie odpowiednio 65 tysięcy i 60 tysięcy. EASL 2012
Cholangiocarcinoma (CCC) Drugi najczęstszy nowotwór pierwotny wątroby Rosnąca liczba zachorowań Banales JM, et al. Nature Reviews G&H 2016
Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe 100-1000 nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013
1. Czy istnieje panel mikrocząsteczek komórkowych charakterystyczny dla nowotworów wątroby? 2. Czy mikrocząsteczki mogą być użyte do monitorowania efektów leczenia onkologicznego?
Metodyka: rok 2016, panel mirocząsteczek rak jelita grubego 3-4 ml blood 1 ml serum ultracentrifugation and enrichment for MPs EpCAM+ tamps CD147+ tamps EpCAM+CD147+ tamps Minimal invasive sampling MP preparation MP profiling Willms / Kornek Oncorarget 2016
W poszukiwaniu nowych antygenów: CD133 and ASGPR1
EpCAM + ASGPR1 + CD133 + tamps
Porównanie marskość vs. nowotwory wątroby
Potencjalne zastosowanie EVs w klinice Julich-Haertel*, Urban*, Krawczyk*, et al. J Hepatol. 2017
Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe 100-1000 nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Eksosomy: <100 nm Uwalniane z wnętrza komórek Analiza: proteomika Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013
Rola mikrocząsteczek komórkowych (eksosomów) w diagnostyce CCA Arbelaiz, Azkargorta, Krawczyk, et al. Hepatologyl. in press
Hipoteza Eksosomy mogą zawierać w sobie markery PSC, CCA i HCC Mikrocząsteczki związene z CCA mogą zawierać w sobie proteiny związane z progresją guza Electron microscopy (TEM) 100 nm
Proteomika Ctrl Ctrl 126 PSC CCA HCC 41 132 9 40 10 38 37 8 276 33 13 9 47 3 Group # proteins (EV) Healthy controls 541 PSC 427 CCA 574 HCC 399
Porównanie eksosomów: CCC vs. kontrole Control (n=43) CCA (n= 32) CCA (n=43) vs Control (n=32) CCA I-II (n=13) vs Control (n=22) Protein SEN SPE AUC p value Protein SEN SPE AUC p value AMPN 90.7 65.6 0.878 <0.001 VNN1 72.1 87.5 0.876 <0.001 PIGR 83.7 71.8 0.844 <0.001 IGHA1 81.4 75.0 0.820 <0.001 CRP 79.1 68.7 0.808 <0.001 GGT1 72.1 87.5 0.786 <0.001 IGHA2 72.1 78.1 0.775 <0.001 FIBG 79.1 75.0 0.767 <0.001 NEP 65.1 81.2 0.761 <0.001 GPC5C 65.1 75.0 0.741 <0.001 CA19-9 81.4 100 0.907 <0.001 PIGR 75.0 95.4 0.905 <0.001 AMPN 91.7 72.7 0.833 <0.01 FIBG 100 68.1 0.833 <0.01 IGHG4 66.7 96.4 0.818 <0.01 IGHA1 91.7 59.0 0.814 <0.01 LG3BP 75.0 77.2 0.807 <0.01 HV102 91.7 63.6 0.803 <0.01 A1AT 83.3 72.7 0.788 <0.01 IGHA2 83.3 72.7 0.788 <0.01 SAMP 75.0 86.3 0.784 <0.01 CA19-9 81.8 100 0.916 <0.001 Fold change
Porównanie eksosomów: PSC vs. kontrole Control n=43 PSC n=30 PSC (n=30) vs Control (n=32) Protein SEN SPE AUC p value AMPN 83.3 62.5 0.789 <0.001 FCN1 76.7 68.7 0.771 <0.001 NEP 63.3 90.6 0.761 <0.001 PIGR 76.7 71.8 0.742 0.001 VNN1 76.7 59.3 0.741 0.001 GPC5C 63.3 75.0 0.733 <0.01 IGHM 86.7 62.5 0.732 <0.01 KV301 79.8 87.5 0.708 <0.01 A2MG 66.7 71.8 0.699 <0.01 Fold change BAIP2 66.7 62.5 0.696 <0.01
Porównanie eksosomów: PSC vs. CCC PSC n=30 CCA n= 32 Protein CCA (n=43) vs PSC (n=30) SEN SPE AUC p value Protein CCA I-II (n=13) vs PSC (n=30) SEN SPE AUC p value Fold change FIBG 88.4 63.3 0.796 <0.001 A1AG1 76.7 70.0 0.794 <0.001 S10A8 69.8 66.6 0.759 <0.001 S10A9 74.4 60.0 0.746 <0.001 SAMP 79.1 57.6 0.740 0.001 FIBB 74.4 66.0 0.740 0.001 GGT1 74.4 63.3 0.720 <0.01 CRP 67.4 66.7 0.711 <0.01 FCN2 65.1 70.0 0.706 <0.01 IGHA1 74.4 70.1 0.701 <0.01 CA19-9 81.4 86.6 0.819 <0.001 FCN2 100 80.9 0.956 <0.001 ITIH4 91.7 80.9 0.881 <0.001 FIBG 91.7 80.9 0.881 <0.001 IC1 75.0 80.9 0.821 <0.01 SAMP 75.0 80.9 0.821 <0.01 LBP 83.3 76.1 0.813 <0.01 CO3 58.3 95.2 0.798 <0.01 LRP1 75.0 66.7 0.786 <0.01 MASP1 58.3 85.7 0.786 <0.01 PROS 75.0 71.4 0.778 <0.01 CA19-9 75.0 86.6 0.736 <0.05
Porównanie eksosomów: HCC vs. kontrole Control n=43 HCC (n=29) HCC (n=29) vs Control (n=32) icca (n=12) vs HCC (n=29) Protein SEN SPE AUC p value Protein SEN SPE AUC p value Fold change LG3BP 96.6 71.8 0.904 <0.001 PIGR 82.8 71.8 0.837 <0.001 A2MG 92.9 56.2 0.796 <0.001 IGHG3 62.1 84.3 0.767 <0.001 FIBG 78.6 75.0 0.756 0.001 HV103 89.7 50.0 0.727 <0.01 SPTB1 65.5 75.5 0.719 <0.01 LV001 60.7 81.2 0.709 <0.01 APOE 60.7 68.7 0.706 <0.01 AMPN 72.4 71.8 0,704 <0.01 AFP 82.1 64.0 0.802 <0.001 FIBG 83.3 89.6 0.894 <0.001 A1AG1 83.3 82.1 0.845 0.001 VTDB 75.0 89.2 0.823 0.001 CRP 75.0 79.3 0.807 <0.01 VNN1 83.3 68.9 0.802 <0.01 A1BG 83.3 68.9 0.799 <0.01 FIBB 100 67.8 0.795 <0.01 CO9 75.0 71.4 0.753 <0.05 GPC5C 75.0 62.0 0.747 <0.05 CA19-9 75.0 91.3 0.801 <0.01 *AFP 71.4 75.0 0.753 <0.05
Proteomika Nowe markery mogą być wykryte w serum Control PSC CCA EV Total serum EV Total serum EV Total serum PIGR AMPN CRP
Analiza eksosomów vs. MRT MRI Initial timepoint 1 month 2 months Human proteins in serum EV Alpha-2-macroglobulin Galectin-3-binding protein Fibronectin Complement C3 Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase Pyruvate kinase PKM Clusterin Alpha-enolase Annexin A1
Podsumowanie 1. Mikrocząsteczki komórkowe stanowią nowe markery w nowotworach wątroby. 2. Eksosomy zawierają w sobie proteiny która są związane z progresją nowotworów wątroby. Dodatkowe badania są potrzebne w celu określenia ich roli w terapii nowotworów. 3. Płynna biopsja pozwala na dokładną diagnostykę oraz monitorowanie terapii.
San Sebastian and Homburg
Dziękuję za uwagę! Piotr Milkiewicz Marek Krawczyk Beata Kruk Frank Lammert marcin.krawczyk@uks.eu