(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 207303 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 372398 (22) Data zgłoszenia: 13.03.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.03.2003, PCT/EP03/050061 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 02.10.2003, WO03/080104 (51) Int.Cl. A61K 38/17 (2006.01) A61K 38/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) A61P 9/10 (2006.01) A61P 9/00 (2006.01) A61P 7/02 (2006.01) A61P 21/00 (2006.01) A61P 17/02 (2006.01) (54) Zastosowanie inhibitora IL-18 do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych i zastosowanie wektorów ekspresyjnych (30) Pierwszeństwo: 22.03.2002, EP, 02100290.2 (73) Uprawniony z patentu: LABORATOIRES SERONO SA, Coinsins, CH INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE, Paryż, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: 25.07.2005 BUP 15/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2010 WUP 11/10 (72) Twórca(y) wynalazku: YOLANDE CHVATCHKO, Confignon, CH ALAIN TEDGUI, Paryż, FR ZIAD MALLAT, Herbeville, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Jolanta Mitura PL 207303 B1

2 PL 207 303 B1 Opis wynalazku DZIEDZINA WYNALAZKU Wynalazek niniejszy dotyczy dziedziny chorób naczyniowych. Konkretniej, dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych. W szczególności, wynalazek niniejszy dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 w zapobieganiu amputacjom. Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowania wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, jak również zastosowania wektora ekspresyjnego do indukowania i/lub nasilania endogennej produkcji inhibitora IL-18, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych kończyn. TŁO WYNALAZKU Cytokina, interleukina 18 (IL-18), została pierwotnie opisana jako czynnik indukujący interferon γ (IFN-γ) (Nakamura i in., 1989). Jest ona wczesnym sygnałem w rozwoju odpowiedzi limfocytów T pomocniczych typu 1 (TH1). IL-18 działa razem z IL-12, IL-2, antygenami, mitogenami i innymi możliwymi czynnikami, indukując produkcję IFN-γ. IL-18 wzmaga również produkcję GM-CSF i IL-2, nasila proliferację limfocytów T indukowaną przez anty-cd3 oraz zwiększa zabijanie za pośrednictwem Fas komórek naturalnych zabójców. Dojrzała IL-18 jest produkowana z prekursorów przez enzym konwertujący IL-1β (ICE, kaspaza-1). Receptor IL-18 składa się przynajmniej z dwóch składników, IL-18R alfa i IL-18R beta, współdziałających przy wiązaniu liganda. Znaleziono miejsca wiążące IL-18 z dużym lub małym powinowactwem w mysich limfocytach T stymulowanych przez IL-12 (Yoshimoto i in., 1998), co sugeruje istnienie wielołańcuchowego kompleksu receptorowego. Do tej pory zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należące do rodziny receptora IL-1 (Parnet i in., 1996; Kim i in., 2001). Transdukcja sygnału IL-18 obejmuje aktywację NF-κB (DiDonato i in., 1997). Kompleks receptorowy dla IL-18 składa się z dwóch łańcuchów: łańcucha wiążącego ligand określanego jako łańcuch IL-18Rα oraz łańcucha przekazującego sygnał określanego jako łańcuch IL-18Rβ. Pierwotnie wyizolowano łańcuch IL-18R alfa jako białko powierzchniowe komórki wiążące znakowaną radioaktywnie IL-18; białko to oczyszczono, a jego sekwencja aminokwasowa wykazała identyczność z opisanym uprzednio receptorem sierocym określanym jako białko pokrewne IL-1R (IL-1Rrp) (Torigoe i in., 1997). Ostatnio z moczu ludzkiego wyizolowano rozpuszczalne białko o wysokim powinowactwie do IL-18 oraz sklonowano ludzkie i mysie cdna, jak również gen ludzki (Novick i in.,1999; WO 99/09063). Białko to oznaczono jako białko wiążące IL-18 (IL-18BP). IL-18BP nie jest domeną zewnątrz komórkową żadnego ze znanych receptorów IL-18, ale wydzielanym, naturalnie krążącym białkiem. Należy ono do nowej rodziny białek wydzielanych, obejmującej ponadto kilka białek kodowanych przez Poxvirusa (Novick i in., 1999). Moczowa jak i rekombinantowa IL-18BP wiążą się specyficznie z dużym powinowactwem z IL-18 i modulują biologiczne powinowactwo IL-18. Gen IL-18BP zlokalizowano na ludzkim chromosomie 11q13 i nie znaleziono żadnego egzonu kodującego domenę śródbłonową w sekwencji genomowej o długości 8,3 kb. Jak do tej pory znaleziono u ludzi 4 warianty splicingu lub izoformy IL-18BP wytworzone przez alternatywny splicing mrna. Oznaczono je jako IL-18BP a, b, c i d i wszystkie z nich mają taki sam N-koniec, a różnią się C-końcem (Novick i in., 1999). Te izoformy różnią się zdolnością do wiązania IL-18. Spośród czterech izoform hil-18bp, formy a i c są znane ze zdolności do neutralizowania IL-18. Ludzka izoforma IL-18BP wiąże mysią IL-18. Obwodowe zaburzenia naczyniowe mogą być tętnicze (okluzyjne lub funkcjonalne), żylne, mieszane tętniczo-żylne (np. przetoka tętniczo-żylna) lub limfatyczne. Choroby okluzyjne tętnic obejmują obwodową okluzję tętnicy i chorobę Buerger'a, zwaną również zakrzepowo-zarostowym zapaleniem tętnic. Zaburzeniem funkcjonalnym tętnic może być skurcz naczyń (objaw i choroba Raynauda, sinica kończyn) lub rozkurcz (czerwienica bolesna kończyn). Mogą one być wtórne w stosunku do miejscowych zaburzeń naczyniowych lub do w stosunku do zaburzeń aktywności układu współczulnego lub mogą towarzyszyć organicznym chorobom naczyń. Choroby żylne obejmują zakrzep żylny i żylaki, mieszane zaburzenia tętniczo-żylne obejmują przetokę tętniczo-żylną, a zaburzenia limfatyczne obejmują obrzęk limfatyczny i lipedemę. Okluzja tętnicy obwodowej odnosi się do zamknięcia dopływu krwi do kończyn, na ogół przez płytki miażdżycowe (ogniska), zakrzep lub zator.

PL 207 303 B1 3 Okluzja tętnicy obwodowej może spowodować niedokrwienie ostre lub przewlekłe. Ostre niedokrwienie jest spowodowane przez pękniętą proksymalną płytkę miażdżycową, przez ostrą zakrzepicę lub przez obecną wcześniej miażdżycową chorobę tętnic, zatoru serca, aorty lub innych naczyń dużych lub tętniak rozwarstwiony. Przewlekłe niedokrwienie jest następstwem stopniowego powiększania się płytki miażdżycowej. Utrzymujący się wzrost homocysteiny we krwi przez uszkodzenie komórek śródbłonka przyczynia się do przedwczesnego rozwoju miażdżycy aorty i jej gałęzi, tętnic połączeniu z innymi czynnikami ryzyka, można je zmodyfikować dietą i uzupełnieniem witaminy B. Kliniczne zespoły okluzji tętnic zależą od rodzaju zajętych naczyń, stopnia zamknięcia, szybkości narastania okluzji i tego czy przepływ oboczny jest wystarczający. Ostra okluzja ma przebieg obejmujący nagłe wystąpienie silnego bólu, oziębienia, zdrętwienia i zblednięcia kończyny. Kończyna jest zimna i blada, a puls jest nieobecny dystalnie do miejsca zamknięcia. Ostra okluzja może spowodować ciężkie niedokrwienie objawiające się utratą czucia i ruchu i ewentualnie (po 6 do 8 godzinach) tkliwym stwardnieniem mięśni podczas palpacji. W przewlekłej okluzji objawy zależą od podstępnego rozwoju niedokrwienia tkanek. Wstępnym objawem jest chromanie przestankowe. Objawami chromania są ból, tępy ból, kurcze lub poczucie zmęczenia występujące podczas chodzenia. Te objawy są bardzo częste w łydce, ale mogą wystąpić w stopie, udzie, biodrze lub pośladkach. Ból niedokrwienny może ostatecznie pojawić się w spoczynku, poczynając od najbardziej dystalnych części kończyny, jako ostry, nieustępujący ból, nasilający się po podniesieniu i często uniemożliwiający sen. Poziom okluzji tętnicy i lokalizacja chromania przestankowego pozostają w ścisłej korelacji, np. zwężenie rozwidlenia aorty powoduje chromanie w pośladkach, udach i łydkach, a tętno udowe jest zmniejszone lub nieobecne. W zwężeniu tętnicy udowo-podkolanowej chromanie występuje typowo w łydkach i nie wyczuwa się tętna poniżej tętnicy udowej. U pacjentów z chorobą małych naczyń (np. zarostowo-zakrzepowe zapalenie naczyń, cukrzyca), tętno podkolanowe może być wyczuwalne, ale tętno na stopie nie będzie obecne. Bladość zajętej stopy po 1 do 2 minutach uniesienia, z następującym zaczerwienieniem po opuszczeniu, pomaga potwierdzić niewydolność tętniczą. Czas napływu żylnego po opuszczeniu jest przedłużony ponad 15-sekundową normę. Jeżeli objawy chromania występują z prawidłowym tętnem obwodowym, należy wziąć pod uwagę zwężenie kanału kręgowego. Stopa w stanie ciężkiego niedokrwienia jest bolesna, zimna i często zdrętwiała. W przypadkach przewlekłych skóra może być sucha i łuszcząca ze słabym przyrostem paznokci i włosów. W miarę postępu niedokrwienia, może wystąpić owrzodzenie (typowo na palcach lub pięcie, sporadycznie na udzie), szczególnie po miejscowym urazie. Obrzęk jest zwykle nieobecny chyba, że pacjent trzymał nogę w pozycji zmniejszającej ból, a ciężko niedokrwiona kończyna może wykazywać zanik tkanek. Bardziej rozległa okluzja może upośledzić tkanki, prowadząc do martwicy lub zgorzeli. Niedokrwienie z zaczerwienieniem, bólem i obrzękiem opuszczonej stopy może naśladować cellulitis lub niewydolność żylną. Nieinwazyjne badania tętnic mogą uściślić diagnozę. Spośród chorób naczyń obwodowych, choroba Buerger'a (zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń) jest chorobą zarostową naczyń, charakteryzującą się zmianami zapalnymi w tętnicach małych i średnich oraz w żyłach. Choroba Buerger'a występuje u palaczy papierosów, głównie u mężczyzn w wieku od 20 do 40 lat. U kobiet występuje jedynie w około 5% przypadków. Częstość jej diagnozy znacznie zmniejszyła się w ostatnich latach, z uwagi na lepsze zrozumienie cech klinicznych i angiograficznych tej choroby w porównaniu z miażdżycą zarostową. Chociaż przyczyna jest nieznana, choroby Buerger'a nieudokumentowano u niepalących, z czego wynika, że palenie stanowi pierwotny czynnik etiologiczny, prawdopodobnie poprzez reakcję nadwrażliwości typu późnego lub toksyczne zapalenie naczyń. Zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń może być reakcją na tytoń u ludzi z określonym fenotypem, ponieważ u osób cierpiących z powodu tej choroby częściej występują antygeny tkankowe HLA-A9 I HLA-B5; lub może być zaburzeniem autoimmunizacyjnym z nadwrażliwością typu komórkowego na ludzki kolagen typu I i III, który jest składnikiem naczyń krwionośnych. W przeciwieństwie do miażdżycy, choroba Buerger'a nie obejmuje tętnic wieńcowych. Choroba dotyczy tętnic małych i średnich i często odcinkowo powierzchownych żył kończyn. Rzadko, w zaawansowanych stadiach choroby, zajęte są naczynia innych części ciała. Obraz patologiczny jest taki, jak w nieropnym uogólnionym zapaleniu tętnic lub uogólnionym zapaleniu żył z za-

4 PL 207 303 B1 krzepicą zajętych naczyń. W ostrych zmianach pojawia się proliferacja komórek śródbłonka i nacieki limfocytarne warstwy wewnętrznej, ale płytka sprężysta wewnętrzna jest nienaruszona. Zakrzep organizuje się, a następnie ulega częściowej rekanalizacji. Błona środkowa jest zachowana, ale mogą w niej występować nacieki z fibroblastów. Ponieważ przydanka jest bardziej podatna na nacieki z fibroblastów, starsze zmiany wykazują włóknienie okołotętnicze, które może obejmować przyległą żyłę i nerw. Objawy są takie jak w niedokrwieniu tętniczym i powierzchownym zapaleniu żył. Początek jest stopniowy, rozpoczyna się w większości od dystalnych naczyń kończyn górnych i dolnych i postępuje dystalnie, kończąc się zgorzelą dystalną. Przed wystąpieniem obiektywnych objawów choroby, pacjent może skarżyć się na ziębnięcie, drętwienie, mrowienie lub pieczenie. Częsty jest objaw Raynaud'a. Chromanie przestankowe pojawia się w zajętej kończynie (zwykle w łuku stopy lub nodze, rzadko w ręce, ramieniu lub udzie). W przypadku ciężkiego niedokrwienia, np. w stanie przedzgorzelinowym i przy owrzodzeniu lub zgorzeli, utrzymuje się uporczywy ból. Nadmierna aktywność układu współczulnego prawdopodobnie powodowana przez ostry, utrzymujący się ból, manifestuje się często ochłodzeniem, nadmierną potliwością i sinicą zajętej kończyny. We wczesnej fazie choroby mogą pojawić się owrzodzenia niedokrwienne i zgorzel, zwykle jednego lub kilku palców. Badania nieinwazyjne wykazują znaczny spadek przepływu krwi i ciśnienia w zajętych paluchach, stopie i palcach. Choroba postępuje dośrodkowo. Kolejną chorobą naczyń obwodowych jest choroba tętnic obwodowych, w której u pacjentów z chorobą tętnic obwodowych kończyn dolnych (PAD) rozwija się ciężkie, zagrażające kończynie niedokrwienie. Niedokrwienny ból spoczynkowy, niepoddające się leczeniu owrzodzenia i zgorzel są objawami pogarszającymi rokowanie. Są to pacjenci z wysokim ryzykiem utraty kończyny. Natychmiastowe wykrycie i ocena ostrego niedokrwienia kończyny z późniejszą skuteczną rewaskularyzacją są konieczne dla uratowania kończyny i zachowania ogólnego zdrowia. Przewlekłe krytyczne niedokrwienie kończyny jest końcowym stadium choroby okluzyjnej tętnic, zwykle miażdżycy. Oprócz miażdżycy w połączeniu z nadciśnieniem, hipercholesterolemią, paleniem papierosów i cukrzycą, rzadsze przyczyny przewlekłego krytycznego niedokrwienia obejmują chorobę Buerger'a lub zakrzepowo-zarostowe zapalenia naczyń i niektóre postacie zapalenia tętnic. Rozwój przewlekłego krytycznego niedokrwienia kończyny wymaga zwykle wielopoziomowego zamknięcia tętnicy, znacznie ograniczającego przepływ krwi w tkankach. Krytyczne niedokrwienie tkanek klinicznie manifestuje się bólem spoczynkowym, niegojeniem się ran (z uwagi na wzrost zapotrzebowania metabolicznego wymagany do gojenia się ran) lub martwicą tkanek (zgorzelą). Spoczynkowy ból niedokrwienny klasycznie opisuje się jako piekący ból w części podeszwowej stopy pod główkami śródstopia i palcach stopy, pogarszający się w nocy, gdy pacjent leży w łóżku. Spoczynkowy ból niedokrwienny lokalizuje się w stopie, gdzie tkanki są najdalej od serca i dystalnie od okluzji tętnicy. Niegojące się rany lokalizują się głównie w okolicach urazu spowodowanego niedopasowanym obuwiem lub skaleczeniem. Ranę zwykle uważa się za niegojącą, gdy brak jest reakcji na 4- do 12-tygodniowe leczenie zachowawcze, takie jak regularna zmiana opatrunku, unikanie urazu, leczenie zakażenia i usuwanie martwiczych tkanek. Zgorzel dotyczy zwykle palców u stóp i rozwija się, gdy dopływ krwi jest tak niski, że pojawia się samoistna martwica w większości słabo ukrwionych tkanek. Podczas gdy dokładnie zaplanowane leczenie zachowawcze może przynieść korzyść pacjentom z krytycznym niedokrwieniem kończyny, ostry charakter choroby może prowadzić do rozważania możliwości interwencji chirurgicznej. Zabiegi chirurgiczne obejmują rewaskularyzację lub amputację. Gdy pacjent chce przejść rewaskularyzację i jest akceptowalnym kandydatem do zabiegu operacyjnego, zwykle w celu dodatkowej oceny i zaplanowania rewaskularyzacji przeprowadza się arteriografię. W niektórych ośrodkach, angiografię rezonansu magnetycznego stosuje się jako badanie alternatywne lub uzupełniające dla arteriografii w celu zmniejszenia ekspozycji na kontrast. Zachowanie kończyny z zastosowaniem rewaskularyzacji jest ekonomicznie wydajne, prowadzi do lepszej jakości życia dla większości pacjentów i jest związane z niższą chorobowością i śmiertelnością okołozabiegową niż amputacja. Zachowanie kończyny powinno być celem u większości pacjentów z przewlekłym krytycznym niedokrwieniem kończyny. Wykonalność rewaskularyzacji jest wyznaczona przez wyniki badań arteriograficznych, jak i dostępność naczynia nadającego się do by-passu. Angioplastyka lub umieszczenie stentu, albo obydwie te metody, są najbardziej skuteczne w niewielkich zmianach proksymalnych, takich jak u pacjentów z chromaniem, ale są nierealne jako jedyna metoda leczenia w krytycznym niedokrwieniu kończyny, co wiąże się z wielopoziomowym charakterem choroby okluzyjnej tętnic. Idealnym naczyniem do by-

PL 207 303 B1 5 passu jest żyła odpiszczelowa większa, ale inne możliwe naczynia obejmują żyłę odpiszczelową mniejszą, żyły ramienia lub protezy naczyniowe. W większości klinicznych badań chirurgicznych ilość drożnych naczyń łydki mieści się w zakresie od 40 procent dla by-passów z protez naczyniowych do 85 procent dla by-passów z żyły odpiszczelowej. Dla porównania, badania terapii zachowawczej wykazały 25 do 49 procent skuteczności w niegojących się ranach i od 50 do 80 procent poprawy w spoczynkowym bólu niedokrwiennym. Pierwotna amputacja może być wskazana u pewnych pacjentów, takich jak ci z rozległą martwicą tkanek, zagrażającą życiu infekcją lub zmianami nienadającymi się do rewaskularyzacji. Decyzja o monitorowaniu stanu pacjenta z baczną obserwacją i postępowaniem zachowawczym, lub o przeprowadzeniu rewaskularyzacji lub amputacji zależy od uważnej oceny towarzyszącego ryzyka i korzyści chirurgii w porównaniu z postępowaniem zachowawczym. Co istotne, decyzja taka zależy od interpretacji inwazyjności u pacjenta i stosowności dostępnych opcji. Nawet pacjent w stanie, w którym jest niezdolny do chodzenia, może uważać amputację za nieodpowiednią, a nie wszyscy pacjenci są zmotywowani do pracy koniecznej przy rehabilitacji po amputacji. Gdy zapada decyzja o amputacji, zakres amputacji powinien być taki, aby zapewnić największe prawdopodobieństwo wyzdrowienia przy jednoczesnym pozostawieniu pacjentowi maksymalnej szansy na funkcjonalną rehabilitację. Rozpoznanie przewlekłego krytycznego niedokrwienia kończyny obejmuje ból objawiający się w spoczynku, niegojące się rany i zgorzel. Spoczynkowy ból niedokrwienny typowo opisuje się jako ból w łuku lub w dystalnej części stopy, pojawiający się u pacjenta w pozycji leżącej, który ustępuje, gdy pacjent wraca do pozycji, w której stopy są zależne. Podmiotowe parametry hemodynamiczne, które potwierdzają rozpoznanie krytycznego niedokrwienia kończyny, obejmują indeks kostkoworamienny 0,4 lub mniejszy, ciśnienie skurczowe na kostce 50 mm Hg lub mniejsze lub ciśnienie skurczowe na paluchu 30 mm Hg lub mniejsze. Działanie może obejmować leczenie zachowawcze, rewaskularyzację lub amputację. Postępująca zgorzel, gwałtownie powiększające się rany lub utrzymujący się spoczynkowy ból niedokrwienny mogą wskazywać na wagę zagrożenia kończyny oraz sugerować potrzebę rewaskularyzacji u pacjentów bez ryzyka stanowiącego przeszkodę w zabiegu. Przeszczepy omijające są zwykle konieczne z powodu wielopoziomowej i dystalnego charakteru zwężenia tętnicy w krytycznym niedokrwieniu kończyny. Pacjenci z cukrzycą częściej niż inni mają chorobę dystalną, która słabiej poddaje się przeszczepianiu by-passów. W porównaniu z amputacją, rewaskularyzacja jest ekonomicznie bardziej wydajna i związana jest z mniejszą zachorowalnością i mniejszą śmiertelnością okołozabiegową. Zachowanie kończyny powinno być celem u większości pacjentów z krytycznym niedokrwieniem kończyny. Obecnie, główny sposób leczenia chorób naczyń obwodowych obejmuje leczenie inwazyjne, takie jak angioplastyka lub nawet amputacja kończyny. W tej dziedzinie medycyny istotne znaczenie terapeutyczne ma znalezienie leków, które stymulują neowaskularyzację obwodową bez zwiększania progresji płytek miażdżycowych. PODSUMOWANIE WYNALAZKU Wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że inhibitor IL-18 stymuluje neowaskularyzacja naczyń po indukcji obwodowego niedokrwienia w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Neowaskularyzacja naczyń pojawia się w połączeniu z aktywacją sygnalizacji VEGF/Akt i łączy się ze zwiększeniem mobilizacji i różnicowania komórek progenitorowych śródbłonka w szpiku kostnym. Na podstawie tych wyników, przedstawiono terapeutyczne podejście do leczenia lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych wymagających neowaskularyzacji lub rewaskularyzacji. Zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych kończyn, w którym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy obejmującej inhibitor kaspazy-1 (ICE), przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne lub funkcjonalną pochodną białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18, przy czym muteina obejmuje jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych, białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobulin, a funkcjonalna pochodna jest PEGylowana. W korzystnym zastosowaniu, chorobą naczyń obwodowych jest choroba tętnic obwodowych, a zwłaszcza choroba naczyń obwodowych kończyn dolnych. W również korzystnym zastosowaniu chorobie naczyń obwodowych kończyn towarzyszy chromanie.

6 PL 207 303 B1 W kolejnym korzystnym zastosowaniu chorobą naczyń obwodowych jest choroba Beurger a (zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń). W kolejnym korzystnym zastosowaniu chorobą naczyń obwodowych jest niedokrwienie obwodowe, a zwłaszcza niedokrwienie krytyczne. W kolejnym korzystnym zastosowaniu chorobie naczyń obwodowych kończyn towarzyszy zgorzel i/lub owrzodzenie. W innym korzystnym zastosowaniu inhibitora IL-18 chorobie naczyń obwodowych kończyn towarzyszy amputacja kończyny, a w szczególności amputacja kończyny dolnej, stopy lub palca(ów) u stopy. W korzystnym wykonaniu wynalazku, inhibitorem IL-18 jest przeciwciało skierowane przeciwko IL-18. W szczególności, inhibitorem IL-18 jest przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi α IL-18, albo przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi β IL-18. Korzystnie, przeciwciałem przeciwko IL-18 jest przeciwciało humanizowane lub ludzkie. Korzystnie, inhibitor IL-18 jest glikolizowany w jednym lub kilku miejscach. Zakresem niniejszego wynalazku jest również objęte zastosowanie wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie naczyń obwodowych kończyn, w którym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18, przy czym muteina obejmuje jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych, a białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobulin. Zakresem niniejszego wynalazku jest też objęte zastosowanie wektora ekspresyjnego do indukowania i/lub nasilania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórkach, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie naczyń obwodowych kończyn, w którym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18, przy czym muteina obejmuje jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych, a białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobulin. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW Fig. 1: przedstawia A) reprezentatywną mikroangiografię prawej niedokrwionej i lewej ukrwionej kończyny dolnej, 3 i 28 dni po okluzji tętnicy udowej u myszy; B) wynik angiograficzny niedokrwienia/ukrwienia u myszy traktowanej pcdna3-mil18bp (IL-18BP) lub pustym plazmidem (kontrola) przez 3 lub 28 dni. Wartości przedstawiają średnią ± SEM, n=7 na grupę. **p<0,01 wobec myszy kontrolnych. Fig. 2: przedstawia A) zmiany wywołane niedokrwieniem w przepływie krwi kończyny tylnej monitorowane in vivo obrazowaniem perfuzji metodą laser - Doppler u myszy traktowanej pcdna3- -mil18bp (IL-18BP) lub pustym plazmidem (kontrola). W obrazach z kodem kolorowym normalna perfuzja jest zaznaczona kolorem czerwonym, znaczną redukcję w przepływie krwi w niedokrwionej kończynie tylnej przedstawiono na niebiesko. B) ilościową ocenę przepływu krwi wyrażoną jako stosunek przepływu krwi w kończynie niedokrwionej do przepływu w ukrwionej. Wartości przedstawiają średnią ± SEM, n=7 na grupę. **p<0,01 wobec myszy kontrolnych. Fig. 3: przedstawia A) reprezentatywny Western-blot białka VEGF zawartego w niedokrwionej i ukrwionej kończynie, 28 dni po okluzji tętnicy udowej; B) ilościową ocenę poziomów białka VEGF wyrażoną jako stosunek zawartości białka w kończynie niedokrwionej do zawartości w kończynie ukrwionej. Wartości przedstawiają średnią ± SEM, n=7 na grupę. **p<0,01 wobec ukrwionej kontroli i p<0,05 wobec niedokrwionej kontroli. Fig. 4: przedstawia A) reprezentatywny Western-blot białka fosfo-akt zawartego w kończynie niedokrwionej i kończynie ukrwionej, 28 dni po okluzji tętnicy udowej; B) ilościową ocenę poziomów białka fosfo-akt wyrażoną jako stosunek zawartości białka w kończynie niedokrwionej do zawartości w kończynie ukrwionej. Wartości przedstawiają średnią ± SEM, n=7 na grupę. **p<0,01 wobec ukrwionej kontroli i p<0,05 wobec niedokrwionej kontroli. Fig. 5: przedstawia A) reprezentatywne obrazy EPC (komórek progenitorowych śródbłonka) izolowanych ze szpiku kostnego myszy z niepodwiązaną tętnicą udową (pozornie operowanych) i myszy traktowanych pcdna3-mil18bp (IL-18BP) lub pustym plazmidem (kontrola). EPC określono jako komórki przylegające, podlegające dwukrotnemu barwieniu na AcLDL-Dil i czynnik von Willebrand'a (vwf); B) obliczenie podwójnie pozytywnych komórek u myszy traktowanych pcdna3-mil18bp lub

PL 207 303 B1 7 pustym plazmidem. Wartości przedstawiają średnią ± SEM, n=5 na grupę. ***p<0,01 wobec kontrolnych myszy, p<0,05 wobec myszy z niepodwiązaną tętnicą udową (pozornie operowanych). SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU Wynalazek niniejszy opiera się na stwierdzeniu, że inhibitory IL-18 zwiększają w sposób znaczący po-niedokrwienną angiogenezę po niedokrwieniu kończyny bez zaburzania gęstości naczyń ukrwionej kończyny w mysim modelu choroby in vivo. Wynalazek dostarcza zatem nowego podejścia leczniczego do leczenia lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych wymagających zwiększenia perfuzji tkanek. Termin zapobieganie" w kontekście wynalazku odnosi się do nie tylko całkowitego zapobiegania pewnemu skutkowi, ale również do każdego częściowego lub zasadniczego zapobiegania, atenuacji, redukcję, obniżenia lub zniesienia skutku, przed chorobą lub na jej wczesnym etapie. Termin leczenie" w kontekście wynalazku odnosi się do każdego korzystnego wpływu na postęp choroby, łącznie z atenuacją, redukcją, obniżeniem lub zniesieniem patologicznego rozwoju po wystąpieniu choroby. Termin choroba naczyń obwodowych" w znaczeniu tu stosowanym odnosi się do chorób lub zaburzeń zajmujących tętnice, żyły i naczynia limfatyczne kończyn. Obwodowe zaburzenia naczyniowe mogą być tętnicze (okluzyjne lub funkcjonalne), żylne, mieszane tętniczo-żylne (np. przetoka tętniczo-żylna) lub limfatyczne. Choroba okluzyjna tętnic obejmuje okluzję tętnicy obwodowej i zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń. Funkcjonalne zaburzenia naczyniowe mogą być spastyczne (objaw i choroba Raynaud'a, sinica kończyn) lub naczynio-rozkurczowe (czerwienica bolesna kończyn). Mogą być one wtórne do miejscowego zaburzenia naczynia lub zaburzeń aktywności układu współczulnego lub mogą towarzyszyć chorobom organicznym naczyń. Choroby żylne obejmują zakrzepicę i żylaki, mieszane zaburzenia tętniczo-żylne obejmują przetokę tętniczo-żylną, a zaburzenia limfatyczne obejmują obrzęk limfatyczny i lipedemę. Termin choroba naczyń obwodowych" obejmuje wszystkie wskazania medyczne, choroby, zaburzenia lub objawy opisane powyżej w części opisu Tło wynalazku". Termin inhibitor IL-18" w kontekście wynalazku odnosi się do cząsteczki modulującej wytwarzanie i/lub działanie IL-18 w ten sposób, że wytwarzanie i/lub działanie IL-18 jest atenuowane, zredukowane lub częściowo, zasadniczo lub całkowicie powstrzymane lub zablokowane. Inhibitorem wytwarzania może być więc cząsteczka negatywnie oddziałująca na syntezę, obróbkę lub dojrzewanie IL-18. Inhibitory IL-18 według wynalazku są wybrane z grupy obejmującej inhibitor kaspazy-1 (ICE), przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne lub funkcjonalną pochodną białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18. Inhibitor działania IL-18 może być na przykład, antagonistą IL-18. Antagonista może wiązać lub kompleksować samą cząsteczkę IL-18 z wystarczającym powinowactwem i swoistością częściowo lub zasadniczo neutralizując IL-18 lub miejsce (miejsca) wiążące IL-18 odpowiedzialne za wiązanie IL-18 z ligandami (jak np. receptororami). Antagonista może hamować również drogę przekazywania sygnału IL-18, która aktywuje się wewnątrz komórki po związaniu IL-18 z receptorem. Inhibitory działania IL-18 mogą być również rozpuszczalnymi receptorami IL-18 lub cząsteczkami naśladującymi receptory lub czynnikami blokującymi receptory IL-18 lub przeciwciałami przeciwko IL-18, takimi jak poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała lub dowolnym innym czynnikiem lub cząsteczką zapobiegającą wiązaniu IL-18 z jej celem terapeutycznym, znoszącą lub zapobiegającą tym samym uruchomieniu wewnątrz lub zewnątrzkomórkowych reakcji, w których pośredniczy IL-18. Choroba tętnic obwodowych" jest zaburzeniem obejmującym zwężenie tętnic w dowolnym miejscu od gałęzi aorty do tętnic nóg. Początek może być nagły lub stopniowy i generalnie powodujący niedokrwienie (zmniejszone dostarczanie tlenu do obszaru zaopatrywanego przez naczynie). Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, choroby tętnic obwodowych dotyczą korzystnie kończyn dolnych. Choroba lub okluzja tętnic obwodowych może być ostra lub przewlekła. Choroba tętnic obwodowych jest często związana z chromaniem. Chromanie jest bólem kończyny, głównie łydki, który pojawia się i prowadzi do utykania. Chromanie typowo jest odczuwalne podczas spacerowania i zmniejsza się w spoczynku. Z tego powodu, często odnosi się je do chromania przestankowego. Zwykle przerywana natura bólu w chromaniu wynika z okresowo niewystarczającego zaopatrzenia w tlen mięśni kończyny. Słabe zaopatrzenie w tlen, wynika ze zwężenia bądź okluzji tętnic zaopatrujących kończynę w krew. To ogranicza zaopa-

8 PL 207 303 B1 trzenie mięśni kończyny w tlen i jest szczególnie odczuwalne wtedy, gdy zapotrzebowanie tych mięśni na tlen zwiększa się, w wysiłku lub przy chodzeniu. W korzystnym wykonaniu wynalazku, chorobą naczyń obwodowych jest zakrzepowo-zarostowe zapalenia naczyń (choroba Buerger'a). Choroba Buerger'a" jest chorobą zarostową charakteryzującą się zmianami zapalnymi w małych i średnich tętnicach oraz żyłach, które często pojawiają się u palaczy papierosów, głownie u mężczyzn w wieku od 20 do 40 lat. Choroba zajmuje małe i średnie tętnice i często, odcinkowo powierzchowne żyły kończyn. W kolejnym korzystnym wykonaniu, chorobą naczyń obwodowych jest niedokrwienie obwodowe, szczególnie niedokrwienie kończyn. Niedokrwienie" jest niedoborem zaopatrzenia w krew, ogólnie spowodowanym okluzją lub urazem naczyń krwionośnych. Niedokrwienie obwodowe" w szczególności dotyczy niedokrwienia kończyn, tj. rąk i nóg, prowadząc do niedoboru zaopatrzenia w tlen odpowiednich tkanek kończyny. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku, niedokrwienie kończyn jest krytycznym niedokrwieniem kończyn. Krytyczne niedokrwienie kończyn" jest stanem, w którym zaopatrzenie kończyn w krew jest tak obniżone, że zagraża przetrwaniu kończyny. Obecny jest ból spoczynkowy, owrzodzenie lub zgorzel wskazujące na krytyczne niedokrwienie. Zgorzel jest terminem zastosowanym do opisania martwej tkanki i pojawiającym się często jako wynik lub w połączeniu z niedokrwieniem kończyny. Wrzód niedokrwienny spowodowany jest niewystarczającym zaopatrzeniem w krew. Krytyczne niedokrwienie kończyny, obejmujące zgorzel lub wrzód, wymaga rewaskularyzacji w celu zapobieżenia amputacji kończyny. Nieuchronnym następstwem choroby naczyń obwodowych i w szczególności obwodowego niedokrwienia, może być amputacja dotkniętej kończyny, w szczególności dotkniętej kończyny dolnej lub stopy. Rewaskularyzacja będzie prowadzić do reperfuzji dotkniętej tkanki i w ten sposób wspomoże proces gojenia. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania inhibitorów IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania amputacji kończyny. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, inhibitor IL-18 wybiera się spośród inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał skierowanych przeciwko pil-18, przeciwciał skierowanych przeciwko podjednostkom receptora IL-18, inhibitorów przekazywania sygnału IL-18, antagonistów IL-18, którzy konkurują z IL-18 i blokują receptor IL-18 oraz białek wiążących IL-18, izoform, mutein, białek fuzyjnych, funkcjonalnych pochodnych, aktywnych frakcji i koliście zmienionych pochodnych hamujących biologiczne działanie IL-18. Termin białka wiążące IL-18" stosuje się tutaj jako synonim terminu białko wiążące IL-18" lub IL-18BP". Obejmuje on białka wiążące IL-18, jak zdefiniowano w WO 99/09063 lub w Novick i in., 1999, łącznie z wariantami łączenia i/lub izoformy białek wiążących IL-18, jak zdefiniował Kim i in., 2000, które wiążą IL-18. Zwłaszcza ludzkie izoformy a i c IL-18BP nadają się do zastosowania według niniejszego wynalazku. Białka nadające się do zastosowania według niniejszego wynalazku mogą być glikolizowane lub nieglikolizowane, mogą pochodzić z naturalnych źródeł, takich jak mocz lub korzystnie można je wytwarzać drogą rekombinacji genetycznej. Ekspresję rekombinantów można przeprowadzić w prokariotycznych układach ekspresji, takich jak E. coli lub w eukariotycznych i korzystnie w ssaczych układach ekspresji. Szczególnie odpowiednią linią komórkową do ekspresji ssaczych białek jest linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO). W znaczeniu tu stosowanym termin muteiny" odnosi się do analogów IL-18BP lub analogów wirusowego IL-18BP, w których jedną lub kilka reszt aminokwasowych naturalnego IL-18BP lub wirusowego IL-18BP wymieniono na inne reszty aminokwasowe lub wycięto lub dodano jedną lub kilka reszt aminokwasowych do naturalnej sekwencji IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, bez znacznej zmiany aktywności powstałych produktów w porównaniu z naturalnym IL-18BP lub wirusowym IL-18BP. Te muteiny wytwarza się metodą znanej syntezy i/lub technik ukierunkowanej mutagenezy lub innych odpowiednich technik. Muteiny, według niniejszego wynalazku, obejmują białka kodowane przez kwasy nukleinowe takie jak DNA lub RNA, które hybrydyzują z DNA lub RNA, które kodują IL-18BP, lub kodują wirusowe IL-18BP, jak opisano w WO 99/09063 w ostrych warunkach. Termin ostre warunki" odnosi się do warunków hybrydyzacji i następującego po niej płukania, które specjalista standardowo określi jako ostre". Zobacz Ausbel i in., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., 6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i in. Bez ograniczeń, przykłady ostrych warunków obejmują warunki płukania w 12-20 C poniżej obliczonej T m, dla badanej hybrydy, np. 2xSSC i 0,5% SDS przez 5 minut,

PL 207 303 B1 9 np. 2xSSC i 0,1% SDS przez 15 minut; 0,1xSSC i 0,5% SDS w 37 C przez 30-60 minut, a następnie 0,1xSSC i 0,5% SDS w 68 C przez 30-60 minut. Specjalista rozumie, że ostrość warunków zależy również od długości sekwencji DNA, sond oligonukletydowych (takich jak 10-40 par zasad) lub mieszanych sond oligonukletydowych. Gdy stosuje się mieszane sondy, korzystnie stosuje się chlorek terametyloamoniowy (TMAC) zamiast SSC. Patrz Ausubel, powyżej. Dowolna z tych mutein korzystnie posiada sekwencję aminokwasów wystarczająco powielającą sekwencję IL-18BP, lub wystarczająco powielającą sekwencję wirusowego IL-18BP, taką by mieć aktywność porównywalną do IL-18BP. Jedną z aktywności IL-18BP jest zdolność wiązania IL-18. Dopóki muteiny mają zasadniczą zdolność wiązania IL-18, dopóty mogą być stosowane w oczyszczaniu IL-18, środkami takimi jak chromatografia powinowactwa i mogą być uważane za mające zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Zatem, za pomocą rutynowych doświadczeń, obejmujących badanie takiej muteiny np. w prostym kanapkowym teście kompetycyjnym, takim jak test radioimmunologiczny lub test ELISA, można określić, czy dana muteina ma zasadniczo taka samą aktywność jak IL-18BP, w celu określenia czy wiąże się ona do odpowiednio znakowanej IL-18 czy też nie. W korzystnym wykonaniu, każda taka muteina ma co najmniej 40% identyczności lub homologii z sekwencją albo IL-18BP albo kodowanego przez wirus homologa IL-18BP, jak zdefiniowano w WO 99/09063. Korzystniej, muteina ma co najmniej 50%, co najmniej 60%, co najmniej 70%, co najmniej 80% lub najkorzystniej 90% identyczności lub wskazanej homologii. Muteiny polipeptydów IL-18BP lub muteiny wirusowych IL-18BP, które mogą być stosowane według niniejszego wynalazku, lub kodujące je kwasy nukleinowe, obejmują pełny zestaw zasadniczo odpowiadających sekwencji, takich jak podstawione peptydy lub polinukleotydy, które specjalista może uzyskać rutynowymi sposobami, bez wykonywania dodatkowych eksperymentów, opierając się na tu zamieszczonych informacjach i wskazówkach. Korzystne zmiany w muteinach według niniejszego wynalazku, to zmiany znane jako podstawienie konserwatywne". Podstawienia konserwatywne aminokwasu w polipeptydach lub białkach IL-18BP lub wirusowych IL-18BP, mogą obejmować równoznaczne aminokwasy z grupy mającej wystarczająco podobne właściwości fizykochemiczne tak, że zamiana pomiędzy członkami grupy zachowuje biologiczne właściwości cząsteczki (Grantham, 1974). Jest oczywiste, że insercje i delecje aminokwasów mogą być dokonane w określonych powyżej sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie, gdy delecje lub insercje obejmują tylko kilka aminokwasów, np. mniej niż trzydzieści, a korzystnie mniej niż dziesięć, i nie usuwają lub nie zamieniają aminokwasów istotnych dla konformacji czynnościowej, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny wytworzone w następstwie takich delecji i/lub insercji wchodzą w zakres niniejszego wynalazku. Korzystnie, synonimowe grupy aminokwasów są określone w tabeli 1. Korzystniej, synonimowe grupy aminokwasów są określone w tabeli 2; i najkorzystniej synonimowe grupy aminokwasów są określone w tabeli 3. T a b e l a 1 Korzystne synonimowe grupy aminokwasów Aminokwas Synonimowe grupy 1 2 Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Arg, Gln, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, leu, Tyr

10 PL 207 303 B1 cd. tabeli 1 1 2 Cys Ser, Thr, Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp T a b e l a 2 Korzystniejsze synonimowe grupy aminokwasów Synonimowe grupy Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp T a b e l a 3 Najkorzystniejsze synonimowe grupy aminokwasów Aminokwas Synonimowe grupy 1 2 Ser Ser Arg Leu Arg Leu, Ile, Met

PL 207 303 B1 11 1 2 Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Met cd. tabeli 3 Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasów w białkach, które mogą być stosowane do uzyskania mutein, polipeptydów lub białek IL-18BP lub mutein wirusowych IL-18BP, do zastosowania w niniejszym wynalazku, obejmują dowolne znane etapy sposobów, takie jak przedstawione w patentach USA 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, Mark i in.; 5,116,943 Koths i in.; 4,965,195 Namen i in; 4,879,111 Chong i in.; i 5,017,691 Lee i in.; oraz białek z podstawieniem lizyną przedstawionych w patencie USA Nr 4, 904, 584 (Shaw i in.). Termin białko fuzyjne" odnosi się do polipeptydu obejmującego IL-18BP lub wirusową IL-18PB albo do muteiny lub jej fragmentów, poddanych fuzji z innym białkiem, które np. ma wydłużony okres przetrwania w płynach ustrojowych. Zatem, IL-18BP lub wirusowe IL-18BP może być w fuzji z innym białkiem, polipeptydem itp. np. immunoglobuliną lub jej fragmentem. Funkcjonalne pochodne", w znaczeniu tu stosowanym, obejmują pochodne IL-18BP lub wirusowego IL-18BP oraz ich muteiny i białka fuzyjne, które mogą być wytworzone z grup funkcyjnych, które występują jako łańcuchy boczne reszt albo grupy N-końcowe, albo C-końcowe, środkami znanymi w tej dziedzinie i są włączone w zakres tego wynalazku o ile pozostają farmaceutycznie dopuszczalne, tj. nie niszczą aktywności białek, która jest zasadniczo podobna do aktywności IL-18BP lub wirusowej IL-18BP i nie wywołują toksycznych właściwości kompozycji je zawierających. Te pochodne mogą na przykład, obejmować boczne łańcuchy glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i wydłużać czas przetrwania IL-18BP i wirusowego IL-18BP w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych wytworzone w reakcji z amoniakiem lub z pierwszo- lub drugorzędową aminą, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych wytworzone z resztami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi lub karbocyklicznymi grupami aroilowymi) lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych (na przykład grup reszt serylowej lub treonylowej) wytworzone z resztami acylowymi. Jako aktywne frakcje" IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, mutein i białek fuzyjnych, niniejszy wynalazek obejmuje każdy fragment lub prekursor łańcucha polipeptydowego samej cząsteczki białka lub razem z towarzyszącymi cząsteczkami lub resztami z nią połączonymi np. z resztami cukrowymi lub fosforanowymi lub agregatami cząsteczki białka lub reszt cukrowych połączonymi ze sobą, pod warunkiem, że omawiana frakcja ma zasadniczo podobne działanie jak IL-18BP.

12 PL 207 303 B1 W dalszym, korzystnym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18 jest przeciwciałem skierowanym przeciwko IL-18 lub jej receptorowi, IL-18R. Przeciwciała skierowane przeciwko dowolnej podjednostce IL-18R, nazywanej IL-18α lub β, można zastosować według niniejszego wynalazku. Przeciwciała według wynalazku mogą być poliklonalne lub monoklonalne, chimeryczne, humanizowane, lub w pełni ludzkie. Rekombinowane przeciwciała i ich fragmenty charakteryzują się wysoką zdolnością wiązania do IL-18 lub IL-18R in vivo i niską toksycznością. Przeciwciała, które można zastosować według wynalazku, charakteryzują się ich zdolnością do leczenia pacjentów przez okres wystarczający do uzyskania dobrej do doskonałej regresji lub złagodzenia patologicznego stanu lub dowolnego objawu lub grupy objawów związanych ze stanem patologicznym i niską toksycznością. Można łatwo wywołać powstawanie przeciwciał neutralizujących u zwierząt takich jak króliki, kozy lub myszy, immunizując IL-18 lub ll-18rα lub β. Immunizowane myszy są szczególnie korzystne w dostarczaniu źródeł limfocytów B do wytwarzania hybrydoma, które z kolei są hodowane w celu wytwarzania dużych ilości przeciwciał monoklonalnych przeciwko IL-18. Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin charakteryzującymi się dwoma lub wieloma segmentami lub częściami, pochodzącymi od różnych gatunków zwierząt. Ogólnie region zmienny przeciwciała chimerycznego pochodzi od przeciwciała od ssaka innego niż człowiek, takiego jak mysie przeciwciało monoklonalne, a region stały immunoglobuliny pochodzi z cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, obydwa regiony i ich kombinacja mają słabą immunogenność, co jest rutynowo sprawdzane (Elliott i in., 1994). Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin wytworzonymi technikami inżynierii genetycznej, w których mysi region stały został wymieniony na odpowiadającą część ludzką, podczas gdy region wiążący antygen pozostał mysi. Powstałe mysioludzkie chimeryczne przeciwciało korzystnie ma obniżoną immunogenność i poprawioną farmakokinetykę u ludzi (Knight i in.,1993). Zatem, w kolejnym korzystnym wykonaniu przeciwciało przeciwko IL-18 lub IL-18R jest humanizowanym przeciwciałem. Korzystne przykłady humanizowanych przeciwciał przeciwko IL-18 są opisane, na przykład w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 974 600. W kolejnym korzystnym wykonaniu przeciwciało jest całkowicie ludzkie. Technologia wytwarzania ludzkich przeciwciał jest szczegółowo opisana, np. w WO 00/76310, WO 99/53049, w patencie USA 6,162,963 lub AU 5336100. Jeden ze sposobów wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał polega na humanizacji" mysiego humoralnego układu odpornościowego, tj. wytwarzaniu mysich szczepów zdolnych do wytwarzania ludzkiej Ig (Xenomice), przez wprowadzenie loci dla ludzkiej immunoglobuliny (Ig) do myszy, u której własny gen Ig został inaktywowany. Loci Ig są kompleksem w znaczeniu zarówno struktury fizycznej jak i rearanżacji genu i procesów ekspresji wymaganych do ostatecznego wytworzenia szerokiego zakresu odpowiedzi odpornościowej. Różnorodność przeciwciał jest pierwotnie wytwarzana przez kombinowaną rearanżację pomiędzy różnymi genami V, D i J obecnymi w loci Ig. Te loci zawierają również wplecione elementy regulatorowe, które kontrolują ekspresją przeciwciała, wyłączenie alleliczne, przełączanie klas i dojrzewanie powinowactwa. Wprowadzenie nieprzebudowanych ludzkich transgenów Ig do myszy, pokazuje, że mysi mechanizm rekombinacji jest kompatybilny z ludzkimi genami. Ponadto, hybrydoma wydzielające swoiste wobec antygenu hu-mabs w różnych izotypach można uzyskać immunizując Xenomysz antygenem. W pełni ludzkie przeciwciała i sposoby ich wytwarzania są znane w tej dziedzinie (Mendez i in., 1997); Buggemann i in., (1991); Tomizuka i in., (2000) patent WO 98/24893). W bardzo korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, inhibitorem IL-18 jest IL-18BP lub izoforma, muteina, białko fuzyjne, funkcjonalna pochodna, aktywna frakcja lub koliście zmieniona ich pochodna. Te izoformy, muteiny, białka fuzyjne lub funkcjonalne pochodne zachowują biologiczną aktywność IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18 i korzystnie mają przynajmniej zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Idealnie, takie białka mają zwiększoną aktywność biologiczną w porównaniu z niezmienionym IL-18BP. Korzystne aktywne frakcje posiadają aktywność, która jest lepsza od aktywności IL-18BP lub mają dodatkowe zalety, jak lepsza stabilność lub niższa toksyczność lub immunogenność lub są łatwiejsze do wytworzenia w dużych ilościach lub prostsze do oczyszczenia. Sekwencję IL-18BP lub jej wariantów ze splicingu/izoform można uzyskać z WO 99/09063 lub z Novick i in., 1999, jak i z Kim i in., 2000. Funkcjonalne pochodne IL-18BP można połączyć z polimerami w celu poprawy właściwości białka, takich jak stabilność, czas półtrwania, biodostępność, tolerancja przez organizm ludzki lub

PL 207 303 B1 13 immunogenność. Dla osiągnięcia tego celu, IL18-BP można związać z np. glikolem polietylenowym (PEG). PEGylację można przeprowadzić znanymi sposobami, opisanymi na przykład w WO 92/13095. Zatem, w korzystnym wykonaniu wynalazku, inhibitory IL-18 i w szczególności IL-18BP są PE- Gylowane. W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18 obejmuje fuzję immunoglobulin, tj. inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym obejmującym całe lub część białka wiążącego IL-18, które są sfuzowane z całą immunoglobuliną lub jej częścią. Sposoby wytwarzania białek fuzyjnych immunoglobulin są dobrze znane w tej dziedzinie, jak te opisane na przykład w WO 01/03737. Specjalista zrozumie, że powstałe białko fuzyjne według wynalazku zachowuje biologiczną aktywność IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18. Fuzja może być bezpośrednia lub przez krótki peptyd łączący, który może być tak krótki, jak 1 do 3 reszt aminokwasowych lub dłuższy, na przykład 13 do 20 reszt aminokwasowych. Wymieniony łącznik może być tripeptydem o sekwencji na przykład, E-F-M (Glu-Phe-Met) lub 13 aminokwasową sekwencją łączącą zawierającą Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln- -Phe-Met wprowadzoną pomiędzy sekwencję IL-18BP a sekwencję immunoglobuliny. Powstałe białko fuzyjne posiada lepsze właściwości, takie jak wydłużony okres obecności w płynach ustrojowych (okres półtrwania), zwiększoną aktywność swoistą, zwiększony poziom wyrażania lub ułatwione jest oczyszczanie białka. W korzystnym wykonaniu, IL-18BP jest sfuzowane z regionem stałym cząsteczki Ig. Korzystnie IL-18BP jest sfuzowane z regionami łańcucha ciężkiego, takimi jak np. domeny CH2 i CH3, ludzkiej IgG1 lub IgG2. Wytwarzanie konkretnych białek fuzyjnych obejmujących IL-18BP i część immonoglobuliny jest opisane na przykład, w przykładzie 11 WO 99/09063. Inne izoformy cząsteczek Ig, takie jak na przykład izoformy IgG 2 lub IgG 4 lub inne klasy Ig, jak IgM lub IgA, również nadają się do wytwarzania białek fuzyjnych według niniejszego wynalazku. Białka fuzyjne mogą być monomerami lub multimerami, hetero- lub homomultimerami. Inhibitor IL-18 można stosować w kombinacji z jedną lub kilkoma innymi cząsteczkami aktywnymi w stanie klinicznym według wynalazku, takimi jak wazodilatatory, Ca-blokery, aspiryna, beta blokery i im podobne. Na przykład, w kombinacji z inhibitorem IL-18 według niniejszego wynalazku można również stosować antagonistów TNF. Antagoniści TNF wykazują swoją aktywność na klika sposobów. Po pierwsze, antagoniści mogą wiązać lub kompleksować samą cząsteczkę TNF z wystarczającym powinowactwem i konkretnie, zasadniczo lub częściowo neutralizować epitop lub epitopy TNF odpowiedzialne za wiązanie z receptorem TNF (dalej określani jako antagoniści kompleksujący"). Antagoniści kompleksujący mogą być, na przykład, przeciwciałami przeciwko TNF. Alternatywnie, antagoniści TNF mogą hamować szlak przekazywania sygnału TNF aktywowany po związaniu TNF przez receptor na powierzchni komórki (nazywani tu dalej antagonistami sygnału"). Obie grupy antagonistów nadają się do zastosowania, zarówno osobno jak i razem, w kombinacji z inhibitorem IL-18, w leczeniu lub zapobieganiu chorobom naczyń obwodowych. Antagonistów TNF można łatwo zidentyfikować i ocenić rutynową metodą skreeningu związków-kandydatów pod kątem ich działania na aktywność natywnego TNF na podatnych liniach komórkowych in vitro, na przykład ludzkich limfocytach B, u których TNF powoduje proliferację i sekrecję immunoglobulin. Test zawiera formulację TNF w różnych stężeniach kandydujących antagonistów, np. stosuje się w teście od 0,1 do 100-krotnej ilości molowej TNF oraz kontrolę bez TNF lub samego antagonistę (Tucci i in., 1992). Antagoniści kompleksujący są korzystnymi antagonistami TNF do zastosowania według niniejszego wynalazku. Wśród kompleksujących antagonistów, korzystne są te polipeptydy, które wiążą TNF z wysokim powinowactwem i posiadają niską immunogenność. Rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i przeciwciał neutralizujących TNF są szczególnie korzystne. Na przykład, rozpuszczalne TNF-RI i TNF-RII nadają się do zastosowania w niniejszym wynalazku. Obcięte postaci tych receptorów, zawierające domeny zewnątrzbłonowe receptorów lub ich funkcjonalne części, są korzystniejszymi antagonistami według wynalazku. Obcięte rozpuszczalne receptory TNF typu I i typu II opisano na przykład, w EP 914431. Obcięte postaci receptorów TNF są rozpuszczalne i wykrywa się je w moczu i surowicy jako 30kDa i 40kDa białka hamujące wiążące TNF, które nazywane są, odpowiednio TBPI i TBPII (Engelmann i in., 1990). Równoczesne, kolejne lub oddzielne zastosowanie inhibitora IL-18 i antagonistów TNF jest korzystne według wynalazku.

14 PL 207 303 B1 Można również zastosować ludzki rozpuszczalny TNF-RI (TBPI), antagonistą TNF. Naturalne i rekombinowane rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i sposoby ich wytwarzania opisano w patentach europejskich EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900. Pochodne, fragmenty, regiony i biologicznie aktywne części cząsteczek receptora funkcjonalnie podobne do cząsteczek receptora, także można zastosować w niniejszym wynalazku. Taki biologicznie aktywny ekwiwalent lub pochodna cząsteczki receptora odnosi się do części polipeptydu lub sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, o dostatecznym rozmiarze i zdolności wiązania TNF z takim powinowactwem, żeby uległa zahamowaniu lub zablokowaniu interakcja ze związanym z błoną receptorem TNF. Inhibitor IL-18 można zastosować równocześnie, kolejno lub oddzielnie z inhibitorem TNF. W następnym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, inhibitor IL-18 stosuje się w ilości około 0,01 do 100 mg/kg lub około 1 do 10 mg/kg lub 2 do 5 mg/kg. Inhibitor IL-18 według wynalazku, korzystnie podaje się układowo i korzystnie podskórnie lub domięśniowo. Może być podawany codziennie lub co drugi dzień. Postaci o przedłużonym uwalnianiu umożliwiają rzadsze podawanie, takie jak na przykład, raz na tydzień. Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub leczenia chorób naczyń obwodowych. Zatem, w celu dostarczenia inhibitora IL-18 do miejsca, w którym jest on potrzebny, rozważa się podejście w postaci terapii genowej. W celu leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych, wektor do terapii genowej zawierający sekwencję inhibitora IL-18 można na przykład wstrzyknąć bezpośrednio do chorej tkanki, unikając w ten sposób problemów związanych z ogólnoustrojowym podawaniem wektorów terapii genowej, takich jak rozcieńczenie wektora, osiągnięcie i naprowadzenie do komórek lub tkanek docelowych oraz efekty uboczne. Zgodnie z wynalazkiem przewiduje się również zastosowanie wektora do indukowania i/lub nasilenia endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórkach normalnie niemych pod względem ekspresji inhibitora IL-18 lub takich, w których ilość inhibitora wytworzona w wyniku ekspresji nie jest wystarczająca. Wektor może zawierać sekwencje regulatorowe funkcjonalne w komórkach, niezbędne do ekspresji inhibitora IL-18. Takimi sekwencjami regulatorowymi mogą być na przykład promotory lub wzmacniacze. Sekwencje regulatorowe można zatem wprowadzać do odpowiedniego locus genomu przez rekombinację homologiczną, łącząc w funkcjonalny sposób sekwencje regulatorowe z genem, którego ekspresja ma być indukowana lub nasilona. Technologię tę zwykle określa się jako Endogenną aktywację genu (EGA) i opisano ją np. w WO 91/09955. Należy rozumieć, że za pomocą tej samej techniki jest również możliwe bezpośrednie zniesienie ekspresji IL-18, bez stosowania inhibitora IL-18. W tym celu, czynnik regulacji negatywnej, jak np. element wyciszający, można wprowadzić do locus genu IL-18, powodując w ten sposób obniżenie lub zabezpieczenie przed ekspresją IL-18. Dla specjalisty jest jasne, że takie obniżenie lub uciszenie ekspresji IL-18 daje taki sam skutek, jak zastosowanie inhibitora IL-18 w celu zapobiegania i/lub leczenia choroby. Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania komórek, zmodyfikowanych genetycznie tak, że wytwarzają inhibitor IL-18, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych. Inhibitor IL-18 do zastosowania według niniejszego wynalazku korzystnie podaje się w kompozycji farmaceutycznej, ewentualnie w kombinacji z terapeutycznie skuteczną ilością inhibitora TNF lub innego leku działającego w leczeniu lub zapobieganiu chorobie naczyń obwodowych. Opisane powyżej IL-18BP i jej izoformy, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne, aktywne frakcje lub koliście zmienione pochodne są korzystnymi aktywnymi składnikami kompozycji farmaceutycznych. Definicja farmaceutycznie dopuszczalny", w założeniu obejmuje dowolny nośnik, który nie zaburza skuteczności działań biologicznych aktywnego składnika i nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Na przykład, do podawania pozajelitowego aktywne białko(-ka) może być formułowane w jednostce dawkowania przystosowanej do iniekcji w podłożu takim, jak sól fizjologiczna, roztwór dekstrozy, albumina surowicy i roztwór Ringera. Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej według wynalazku mogą być podawane pacjentowi różnymi drogami. Drogi podawania obejmują drogę śródskórną, przezskórną (np. w postaci o powolnym uwalnianiu), domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną, doustną, śródczaszkową, nadtwardówkową, miejscową i donosową. Może być zastosowana każda inna terapeutycznie sku-

PL 207 303 B1 15 teczna droga podawania, na przykład absorpcja przez nabłonek lub tkanki śródbłonka lub przez terapię genową, w której cząsteczka DNA kodująca aktywny czynnik jest podawana pacjentowi (np. za pomocą wektora), co powoduje wyrażanie i sekrecję aktywnego czynnika in vivo. Ponadto, białko(-ka), według wynalazku, może być podawane razem z innymi składnikami biologicznie aktywnych czynników, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalne surfaktanty, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki i podłoża. Do podawania pozajelitowego (np. dożylnego, podskórnego, domięśniowego) aktywne białko (-ka) może być formułowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub liofilizowany puder w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym podłożem pozajelitowym (np. wodą, solą fizjologiczną, roztworem dekstrozy) i dodatkami podtrzymującymi izotoniczność (np. mannitol) lub stabilność chemiczną (np. konserwanty i bufory). Formulacja jest sterylizowana powszechnie stosowanymi sposobami. Biodostępność aktywnego białka(-ek) według wynalazku może być również poprawiona przez zastosowanie technik łączenia, które wydłużają czas półtrwania cząsteczki w organizmie człowieka, na przykład przez łączenie cząsteczki z glikolem polietylenowym, jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT WO 92/13095. Terapeutycznie skuteczna ilość aktywnego białka(-ek) będzie funkcją wielu zmiennych, obejmujących rodzaj białka, powinowactwo antagonisty do IL-18, resztkową aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistów, drogę podania, stan kliniczny pacjenta (w tym konieczność utrzymania nietoksycznego poziomu aktywności endogennej IL-18). O terapeutycznie skutecznej ilości" mówimy wtedy, gdy podany inhibitor IL-18 powoduje zablokowanie biologicznej aktywności IL-18. Dawka podana jednorazowo lub kilkakrotnie osobnikowi, będzie zależeć od wielu różnych czynników, włączając w to właściwości farmakokinetyczne inhibitora IL-18, drogę podania, stan pacjenta i jego charakterystykę (płeć, wiek, ciężar ciała, zdrowie, wzrost), nasilenie objawów, prowadzone równolegle inne rodzaje leczenia, częstotliwość leczenia i pożądane efekty. Dobór i operowanie ustalonymi zakresami dawek leży w zakresie możliwości specjalisty, tak samo jak sposoby in vitro i in vivo określenia zahamowania IL-18 u osobnika. Według wynalazku, inhibitor IL-18 stosuje się w ilości około 0,001 do 100 mg/kg lub około 0,01 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,1 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 3 mg/kg ciężaru ciała lub około 2 mg/kg ciężaru ciała. Droga podania, korzystna według wynalazku, to droga podawania podskórnego. Ponadto, według wynalazku korzystne jest podawanie domięśniowe. W celu podawania inhibitora IL-18 bezpośrednio do miejsca działania, również korzystne jest podawanie miejscowe. W kolejnym korzystnym wykonaniu, inhibitor IL-18 podaje się codziennie lub co drugi dzień. Dawki dzienne są zwykle podawane w postaci dawek podzielonych lub w postaci o przedłużonym uwalnianiu, by uzyskać pożądane skutki. Drugie lub następne podanie można przeprowadzić z taką samą dawką, mniejszą lub większą niż dawka wstępna lub poprzednia podana osobnikowi. Drugą lub następną dawkę można podać podczas lub przed wystąpieniem choroby. Według wynalazku, inhibitor IL-18 można podawać profilaktycznie lub leczniczo osobnikowi przed, równocześnie lub kolejno z innymi schematami lub czynnikami leczniczymi (np. terapia wielolekowa) w terapeutycznie skutecznej ilości, w szczególności z inhibitorem TNF i/lub innym czynnikiem chroniącym naczynia. Aktywne czynniki podawane równocześnie z innymi czynnikami leczniczymi można podawać w tej samej lub odrębnej kompozycji. Kompozycję farmaceutyczną wytwarza się sposobem obejmującym zmieszanie farmaceutycznie skutecznej ilości inhibitora IL-18 i/lub antagonisty TNF z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Leczenie chorób naczyń obwodowych, obejmuje podawanie farmaceutycznie skutecznej ilości inhibitora IL-18, ewentualnie w kombinacji z farmaceutycznie skuteczną ilością antagonisty TNF, potrzebującemu tego pacjentowi. Mając obecnie wynalazek opisany w całości, dla specjalisty jest jasne, że można go przeprowadzić przy szerokim zakresie równoważnych parametrów, stężeń i warunków bez odchodzenia od istoty i zakresu wynalazku i bez nadmiernego eksperymentowania. Choć wynalazek opisano w kontekście konkretnych wykonań, należy rozumieć, że możliwe są jego dalsze modyfikacje. Zakresem wynalazku objęte są wszystkie możliwe warianty, zastosowania lub adaptacje jakie przedstawione są w załączonych zastrzeżeniach patentowych. Wszystkie cytowane źródła referencyjne, w tym artykuły prasowe lub skróty, opublikowane lub nieopublikowane zgłoszenia patentowe USA i inne, udzielone patenty USA lub inne i jakiekolwiek inne źródła referencyjne są w całości włączone przez ich przywołanie, włączając wszystkie dane, tabele,

16 PL 207 303 B1 figury i tekst w nich prezentowany. Ponadto, cała zawartość źródeł referencyjnych cytowanych w źródłach referencyjnych tu cytowanych jest również w całości włączona przez przywołanie. Odniesienie do etapów znanych konwencjonalnych sposobów, czy do znanych konwencjonalnych sposobów nie oznacza, że jakikolwiek aspekt, opis lub wykonanie niniejszego wynalazku jest ujawniony, wskazany lub zasugerowany w stanie techniki. Powyższy opis konkretnych wykonań w pełni ujawnia ogólny charakter wynalazku tak, a zatem specjalista, stosując specjalistyczną wiedzę może łatwo zmodyfikować i/lub zaadaptować do wielu zastosowań takie konkretne wykonania, bez zbędnego eksperymentowania i bez odchodzenia od ogólnej istoty niniejszego wynalazku. Zatem, takie adaptacje i modyfikacje będą w zakresie ekwiwalentów ujawnionych wykonań na podstawie przedstawionych pouczeń i wskazówek. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1: Zahamowanie IL-18 zmniejsza obwodowe niedokrwienie Metody: Wprowadzenie kończyny tylnej w niedokrwienie Samce myszy C57BL/6J (Iffa Creddo, Lyon, Francja) poddawano zabiegowi chirurgicznemu w celu wywołania jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej. Zwierzęta znieczulano wziewnie izofluranem. Szew zakładano na prawą tętnicę udową 0,5 cm proksymalnie od oddzielenia się tętnic piszczelowej i pośladkowej. Następnie myszy trzymano (po 7 myszy w grupie) w specyficznych, wolnych od patogenów warunkach przez 3 lub 28 dni. Dla zbadania roli IL-18BP we indukowanej niedokrwieniem angiogenezie, grupie myszy podawano 60 μg plazmidu ekspresyjnego mysiego IL-18BP, pcdna3-mil18bp w oba mięśnie piszczelowo-grzbietowe, jak opisano uprzednio (Mallat i in., 2001). Myszy kontrolne otrzymywały iniekcję takiej samej ilości kontrolnego, pustego plazmidu. Dostarczano przezskórnych impulsów elektrycznych (8 płaskofalowych impulsów elektrycznych 200 V/cm, trwających 20 ms o częstotliwości 2 Hz) za pomocą elektropulsatora PS-15 (Genetronics) z zastosowaniem dwóch płaskich elektrod ze stali nierdzewnej, umieszczonych w odległości 4,2 do 5,3 mm od siebie, po każdej stronie kończyny. Wdrożono to postępowanie, ponieważ uprzednio wykazano, że zwiększone osoczowe poziomy IL-18BP, zmniejszają aktywność osoczowej IL-18 i hamują rozwój i postęp płytek miażdżycowych (Mallat i in., 2001). Ilościowa ocena angiogenezy Mikroangiografia Gęstość naczyń oceniono za pomocą angiografii o wysokiej rozdzielczości pod koniec okresu leczenia, jak opisano poprzednio (Silvestre i in., 2000; Silvestre i in., 2001). Myszy znieczulano (wziewnie izofluranem) i wstrzykiwano im środek kontrastujący (siarczan baru, 1 g/ml), przez cewnik wprowadzony do aorty brzusznej. Obrazy (po 3 na zwierzę) uzyskiwane za pomocą cyfrowego przekaźnika rentgenowskiego zbierano w celu uzyskania kompletnego obrazu kończyn tylnych. Gęstość naczyń wyrażono jako procent pikseli obrazu zajmowanych przez naczynia w ocenianym obszarze. Oceniany obszar wyznaczano na podstawie położenia szwu na tętnicy udowej, kolana, brzegu kości udowej i zewnętrznej granicy kończyny. Gęstość naczyń włosowatych Badanie mikroangiograficzne uzupełniano oceną gęstości naczyń włosowatych w ukrwionych i niedokrwionych mięśniach, jak opisano poprzednio (Silvestre i in., 2000; Silvestre i in., 2001). Zamrożone skrawki tkanki (7 μm) inkubowano ze szczurzym, monoklonalnym przeciwciałem przeciwko CD31 (20 μg/ml, Pharmingen) celem identyfikacji naczyń włosowatych. Barwienie immunologiczne uwidaczniano stosując układ wizualizacji awidyna-biotyna-peroksydaza chrzanowa (Vectostatin ABC kit elite, Vector Laboratories). Gęstość naczyń włosowatych obliczano w losowo wybranych polach o określonych granicach, z zastosowaniem oprogramowania Histolab (Microvision). Obrazowanie perfuzji Dopplerem laserowym By uzyskać dowody na indukowane niedokrwieniem zmiany w unaczynieniu, przeprowadzono doświadczenia z obrazowaniem perfuzji Dopplerem laserowym, jak opisano poprzednio (Silvestre i in., 2000; Silvestre i in., 2001). Nadmiar włosów usuwano kremem depilacyjnym z kończyny przed obrazowaniem, a mysz umieszczano na ogrzewanej płycie o temperaturze 37 C, by zminimalizować wahania temperatury. Pomimo to, by uwzględnić zmienne obejmujące światło i temperaturę w otoczeniu, obliczoną perfuzję wyrażano jako stosunek wartości dla kończyny niedokrwionej do ukrwionej. Analiza statystyczna Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. Do porównania każdego parametru zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA. Następnie przeprowadzono porównania stosując test

PL 207 303 B1 17 Bonnferoniego celem identyfikacji, które różnice między grupami mają znaczenie dla całej ANOVA. Wartość p<0,05 uznano za statystycznie istotną. Wyniki: Mikroangiografia W 3 dniu stosunek wyników angiograficznych kończyny niedokrwionej/ukrwionej w każdej grupie był niezmieniony (Fig. 1). Natomiast, w 28 dniu, wykazano 1,6-krotny wzrost wyniku angiograficznego u myszy leczonych IL-18BP w porównaniu do kontroli (p<0,01). Gęstość naczyń włosowatych Mikroangiograficzne dane potwierdzono analizą gęstości naczyń włosowatych po barwieniu CD31. W 28 dniu, gęstość naczyń włosowatych w niedokrwionej kończynie myszy kontrolnej była niższa niż w ukrwionej kończynie (415±31 wobec 688±42 naczyń/mm 2, p<0,01). Jednak, gęstość naczyń włosowatych w kończynie myszy leczonej IL-18BP była znacząco większa (1,4 krotny wzrost), niż u myszy kontrolnych (odpowiednio 588±31 wobec 415±31 naczyń/mm 2, p=0,01) i nie różniła się od poziomu obserwowanego w ukrwionych kończynach. Obrazowanie perfuzji Dopplerem laserowym Mikroangiografia i pomiar gęstości naczyń włosowatych był powiązany ze zmianami w perfuzji krwią. Poprawa przepływu krwi w kończynie tylnej pojawiała się zarówno u myszy leczonych jak i nieleczonych. Jednak, u myszy leczonych IL-18BP, wykazano większy wzrost przepływu krwi (perfuzja stopy) w 28 dniu, w porównaniu do grupy zwierząt kontrolnych (1,5 krotny, p<0,01, Figura 2). P r z y k ł a d 2: Regulacja poziomów białek VEGF, fosfo-akt i enos Metoda: Wyrażanie VEGF, fosfo-akt i enos (białka śródbłonkowej syntazy tlenku azotu) określono metodą Western-blot w niedokrwionych i w ukrwionych kończynach, jak opisano poprzednio (Silvestre i in., 2000; Silvestre i in., 2001). Wyniki: VEGF. W 3 dniu nie obserwowano zmian poziomu białka VEGF pomiędzy ukrwionymi a niedokrwionymi kończynami, w każdej z grup. W 28 dniu, u myszy kontrolnych zawartość białka VEGF wykazywała tendencję wzrostową w kończynie niedokrwionej, w porównaniu do niedokrwionej, ale nie osiągała istotności statystycznej. Natomiast, poziom białka VEGF w kończynie niedokrwionej ulegał znacznemu zwiększeniu do 120% u myszy leczonych IL-18BP w porównaniu do kontroli (p<0,05) (Figura 3). Fosfo-Akt. W 3 dniu, poziom białka fosfo-akt był nie zmieniony w ukrwionych i niedokrwionych kończynach tylnych niezależnie od leczenia. W 28 dniu, u myszy kontrolnych, zawartość białka fosfo-akt wzrastała o 60% w kończynie niedokrwionej ponad poziom w kończynie ukrwionej (p<0,01). Ten wzrost zawartości fosfo-akt w niedokrwionej kończynie był podwójny u myszy leczonych IL-18BP (110% wzrostu, p<0.05 w porównaniu do wzrostu w niedokrwionej kończynie kontrolnych myszy) (Figura 4). enos. W 3 dniu, zawartość białka enos była nie zmieniona w niedokrwionych (107±8% wobec 103±24%) i ukrwionych kończynach (100±12% wobec 94±21%) odpowiednio dla kontrolnych i leczonych IL-18BP myszy. W 28 dniu, u myszy kontrolnych, poziomy enos zwiększały się o 55% w niedokrwionej kończynie w odniesieniu do ukrwionej (odpowiednio 155±8% wobec 110±11%, p<0,05). Ten wzrost był niezaburzony przez leczenie IL-18BP (160±12%, p=0,01 wobec niedokrwionej kontroli). P r z y k ł a d 3: Wpływ IL-18BP na EPC (komórki progenitorowe śródbłonka) Metody: Badanie cytometrem przepływowym Uważa się, że EPC pochodzą od hematopoetycznych komórek progenitorowych Sca-1-dodatnich (Takahashi i in., 1999). Procent komórek jednojądrzastych wyrażających białko markerowe EPC Sca- 1 oceniono cytometrią przepływową. Siedem dni po niedokrwieniu, izolowano komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej (300 μl) i ze szpiku kostnego myszy traktowanych albo pustym plazmidem pcdna3 albo plazmidem pcdna-mil18bp (n=5 na grupę). Komórki szpiku kostnego uzyskano przepłukując kość piszczelową i udową. Komórki jednojądrzaste o niskiej gęstości izolowano przez wirowanie z gradientem gęstości na Ficoll-u. Komórki jednojądrzaste następnie inkubowano z izocyjanianem fluoresceiny (FITC) skoniugowanym z monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko Sca-1 (D7, BD Pharmingen). Identyczne pod względem izotypu przeciwciała stosowano jako kontrolę. Test różnicowania EPC Natychmiast po izolacji, 5 10 6 komórek jednojądrzastych pochodzących ze szpiku wysiewano na naczynia hodowlane 35 mm pokryte witronektyną z osocza szczurzego (Sigma) i żelatyną (0,1%) i utrzy-

18 PL 207 303 B1 mywano w podstawowym podłożu śródbłonka (EBM2, Bio whittaker). Po 4 dniach hodowli, komórki które nie przylgnęły, usuwano, a komórki, które przylgnęły poddawano badaniom immunochemicznym. W celu wykrycia pobierania acylowanej lipoproteiny o niskiej gęstości znakowanej 1,1'-dioktadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjanianem (AcLDL-Dil), komórki inkubowano z AcLDL-Dil (Tebu) w 37 C przez godzinę. Komórki następnie utrwalano 2% paraformaldehydem, inkubowano z pierwotnym poliklonalnym przeciwciałem króliczym przeciwko czynnikowi von Willbrand'a (vwf) (DAKO) przez 1 godzinę oraz ze znakowaną FITC monoklonalną, przeciwkróliczą IgG (H+L) przez 30 minut (Coulter). Podwójnie barwione komórki, dodatnie pod względem zarówno AcLDL-Dil jak vwf oceniano jako EPC i zliczono na studzienkę. Trzech niezależnych badaczy obliczało liczbę EPC na studzienkę, przeliczając trzy losowo wybrane pola o dużym powiększeniu. Wynik wyrażono jako procent całkowitej liczby komórek jednojądrzastych. Wyniki EPC uważa się za pochodzące od komórek jednojądrzastych dodatnich pod względem Sca-1 (Takahashi i in., 1999). Procent komórek jednojądrzastych Sca-1 dodatnich w krwi obwodowej pozostawał niezmieniony u myszy leczonych IL-18BP w porównaniu do zwierząt kontrolnych (odpowiednio 31,5±13% wobec 28,5±13%). Podobnie, całkowita liczba komórek jednojądrzastych Sca-1 dodatnich izolowanych ze szpiku kostnego nie różniła się pomiędzy myszami leczonymi IL-18BP a zwierzętami kontrolnymi (odpowiednio 4,35±0,95% wobec 5,87±0,22%). Ponadto, leczenie IL-18BP nie wpłynęło na ogólną liczbę komórek jednojądrzastych we krwi obwodowej lub szpiku kostnym (dane nieprzedstawione). EPC izolowano i hodowano z komórek jednojądrzastych szpiku kostnego i charakteryzowano jako komórki podwójnie barwione AcLDL-Dil i vwf dodatnie. Procent komórek barwiących się podwójnie dodatnio był prawie niewykrywalny u zwierząt bez niedokrwienia (<5%, n=4). Niedokrwienie powodowało zauważalny wzrost procentu komórek barwiących się podwójnie dodatnio na AcLDL-Dil i vwf (48±3%, p<0,001 wobec zwierząt bez niedokrwienia). Ten efekt powiększał się później, po leczeniu IL-18BP (48±3% w kontroli wobec 85±2% u myszy leczonych IL-18BP, p<0,001) (Figura 5). Zatem, leczenie IL-18BP wydaje się raczej stymulować różnicowanie komórek jednojądrzastych do EPC, a nie zwiększać liczbę krążących komórek progenitorowych. LITERATURA 1. Buggemann et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991) 2. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, ZandI, E and Karin, M, (1997). Nature 388,16514-16517. 3. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127. 4. Engelmann, H., Novick, D., and Wallach. D., 1990, J. Biol. Chem. 265,1531-1536. 5. Grantham (1974), Science, 185. 862-864. 6. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D. Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occuning Isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc NatI Acad Sd USA 2000;97:1190-1195. 7. Kim SH et al., J. Immuno. 2001,166. pp. 148-154. 8. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mousehuman chimeric anti-tnf antibody. Mol Immunol 1993 Nov 30:161443-53. 9. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1982. 10. Meldmm, D. R.. Cleveland, J. C, Jr., Cain, B. S., Meng, X & Harken, A H. (1998) Ann Thorac Surg 65,439-43. 11. Mendez, M.M., Green, LL, CorvaIan, J.R.F., Jia X-C.. Maynard-Currie, E.E., Yang, X-D., Gallo, M.L, Louie, D.M., Lee, D.V.. Erickson. K.L., Luna, J., Roy, C.M-N., Abderrahim, H., Kirshenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D.M., Fukushima, A.. Hales, J.F., Finer. M.H.. Davis, C.G., Zsebo, K.M, and Jakobovits, A. (1997). "Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice". Nature Genetics, 15, 146-56. 12. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata. K and Tamura. T. (1989). Infect Immun. 67, 590-595. 13. Novick. D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznlkov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

PL 207 303 B1 19 14. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P. Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970. 15. Silvestre, J.S., Mallat Z, Duriez M, Tamarat R, Bureau MF, Schemnan D, Duverger N, Branellec D, Tedgui A, Levy BI. 2000. Antianglogenic effect of lnterleukin-10 in ischemia-induced angiogenesis in mice hindllmb. Circ. Res. 87:448-452. 16. Silvestre, J.S., Mallat Z, Tamarat R, Duriez M, Tedgui A and Levy BI. 2001. Regulatlon of Matrix Metalloproteinase activity in ischemic tissue by lnterleukin-10: Role in ischemia-induced angiogenesis. Circ. Res. 89:259-264. 17. Takahashi, T., Kalka, C, Masuda, H., Chen, D., Silver, M., Keamey, M., Magner, M., Isner, J.M., Asahara, T. 1999. Ischemia- and cytokine-induced mobillzation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascuiarization. Nat Med. 5:434-438. 18. Torigoe, K., Ushio, S., Okura, T., Kobayashi, S., Taniai, M., Kunikate, T., Murakami, T., Sanou, O., Kojima, H., Fuji, M., Ohta, T., Ikeda, M., Ikegami, H. & Kurimoto, M. (1997) J. Biol. Chem. 272. 25737-25742. 19. Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000). 20. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.Immunol. 148, 2778-2784. 21. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K. Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161, 3400-3407. Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych kończyn, w którym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy obejmującej inhibitor kaspazy-1 (ICE), przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne lub funkcjonalną pochodną białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18, przy czym muteina obejmuje jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych, białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobulin, a funkcjonalna pochodna jest PEGylowana. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą naczyń obwodowych jest choroba tętnic obwodowych. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że choroba naczyń obwodowych jest chorobą naczyń obwodowych kończyn dolnych. 4. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym chorobie naczyń obwodowych kończyn towarzyszy chromanie. 5. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym chorobą naczyń obwodowych jest choroba Beurger a (zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń). 6. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym chorobą naczyń obwodowych jest niedokrwienie obwodowe. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że niedokrwienie obwodowe jest niedokrwieniem krytycznym. 8. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym chorobie naczyń obwodowych kończyn towarzyszy zgorzel i/lub owrzodzenie. 9. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym chorobie naczyń obwodowych kończyn towarzyszy amputacja kończyny. 10. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym inhibitorem IL-18 jest przeciwciało skierowane przeciwko IL-18. 11. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym inhibitorem IL-18 jest przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi α IL-18. 12. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym inhibitorem IL-18 jest przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi β IL-18. 13. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 10 do 12, w którym przeciwciałem przeciwko IL-18 jest przeciwciało humanizowane lub ludzkie. 14. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., w którym inhibitor IL-18 jest glikolizowany w jednym lub kilku miejscach.

20 PL 207 303 B1 15. Zastosowanie wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych kończyn, w którym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18, przy czym muteina obejmuje jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych, a białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobulin. 16. Zastosowanie wektora ekspresyjnego do indukowania i/lub nasilania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórkach do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom naczyń obwodowych kończyn, w którym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało przeciwko IL-18, przeciwciało przeciwko dowolnej spośród podjednostek receptora IL-18 oraz białko wiążące IL-18, albo izoformę, muteinę, białko fuzyjne białka wiążącego IL-18, które hamują biologiczną aktywność IL-18, przy czym muteina obejmuje jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych, a białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobulin. Rysunki

PL 207 303 B1 21

22 PL 207 303 B1

PL 207 303 B1 23

24 PL 207 303 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.