RECENZJA PRACY DOKTORSKIEJ mgr farm. Anny Kasprzyk pt. Farmakokinetyka i dystrybucja narządowa treosulfanu i jego biologicznie aktywnego monoepoksytransformeru Badania farmakokinetyczne stanowią bardzo ważny element w badaniach nad lekiem, ponieważ pozwalają na poznanie procesów jakim lek podlega w ustroju, dostarczają danych do oszacowania parametrów farmakokinetycznych i ich zmienności w populacji, a uzyskane wyniki mogą stanowić podstawę optymalizacji farmakoterapii. Jednym z ważnych aspektów w tych badaniach jest opracowanie czułej, selektywnej, dokładnej i precyzyjnej metody analitycznej. Metoda taka powinna zostać zwalidowana zgodnie z wytycznymi dla metod bioanalitycznych. Praca doktorska mgr Anny Kasprzyk wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Franciszka Główki, przy udziale dr Michała Romańskiego jako promotora pomocniczego, dotyczy tego typu badań nad treosulfanem - cytostatykiem od niedawna stosowanym w kondycjonowaniu przed przeszczepami komórek krwiotwórczych (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT). Praca realizowana była ze środków Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu oraz Narodowego Centrum Nauki we współpracy z Kliniką Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu i Kliniką Transplantologii Szpiku, Onkologii, Hematologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu oraz Katedrami Medycyny Sądowej oraz Histologii i Embriologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu.
Ocena merytoryczna pracy Jak wynika z danych literaturowych, treosulfan jest lekiem o stosunkowo słabo poznanych właściwościach farmakokinetycznych i niewykorzystanych możliwościach terapeutycznych. Jeszcze mniej wiadomo na temat farmakokinetyki jego aktywnych epoksytransformerów, które powstają w nietypowy sposób, bo bez udziału enzymów. Brak jest także danych na temat dystrybucji tego leku do tkanek potencjalnie związanych z jego toksycznością oraz do miejsca działania jakim jest, w przypadku kondycjonowania przed HSCT, szpik kostny. Stąd, konieczne są dalsze badania zarówno kliniczne, jak i przedkliniczne w celu pogłębienia wiedzy na temat tego leku i jego aktywnych transformerów oraz ich losów w organizmie. Wśród leków stosowanych w terapii kondycjonującej, treosulfan wydaje się być bardzo atrakcyjną alternatywą dla istniejących schematów kondycjonowania. Charakteryzuje się znacznie mniejszą toksycznością w stosunku do innych leków o podobnym zastosowaniu, stąd też może być stosowany u pacjentów pediatrycznych i osób w podeszłym wieku. W świetle tych danych, tematyka podjęta przez Doktorantkę jest niezmiernie ważna i aktualna. W swoich badaniach wybrała populację pacjentów pediatrycznych, u których stosowanie standardowej terapii było przeciwskazane. Uzyskane wyniki badań farmakokinetycznych wraz z pełną informacją o tych pacjentach umożliwiło przeprowadzenie dogłębnej analizy uzyskanych danych i poszukiwanie korelacji, które mogą być pomocne w optymalizacji dawkowania badanego leku. Należy podkreślić, że tego typu badania, uwzględniające stężenia aktywnych produktów aktywacji treosulfanu, do tej pory prowadzone były na bardzo małej grupie chorych (dwoje dzieci poddanych kondycjonowaniu przed HSCT). Z kolei badania farmakokinetyczne na zwierzętach prowadzone były wyłącznie na królikach i obejmowały, oprócz pomiaru stężeń badanego związku i jego dwóch aktywnych transformerów w osoczu, ocenę dystrybucji tych związków do cieczy wodnistej oka. Efektem przeprowadzonych badań są interesujące i wartościowe wyniki, które pozwalają na poznanie farmakokinetyki treosulfanu i jego
epoksytransformeru w grupie 16 pacjentów pediatrycznych z dwóch klinik onkologicznych z różnymi typami nowotworów, głównie układu krwiotwórczego. Są to wyniki unikatowe w skali świata, których zgromadzenie wymagało umiejętności współpracy z lekarzami. Prowadzone badania mają nie tylko charakter poznawczy, ale także posiadają kilka aspektów praktycznych. Wykazano m.in., że nie ma potrzeby różnicowania dawek treosulfanu w zależności od wieku i powierzchni ciała dziecka oraz, że obecnie stosowane schematy dawkowania tego leku są właściwe, gdyż zapewniają całkowita eliminację leku proleku i jego aktywnego transformeru przed wykonaniem przeszczepienia. Z kolei badania na zwierzętach przyczyniły się do wyjaśnienia przyczyn niskiej toksyczności treosulfanu, która związana jest z niewielką dystrybucją tych związków do mózgu i wątroby. Jeszcze jeden aspekt praktyczny przeprowadzonych badań, to potwierdzenie przydatności pomiarów stężeń badanych związków w osoczu u tych pacjentów, gdyż korelują one ze stężeniami tych związków w szpiku kostnym. Co więcej, w ramach przedstawionej do recenzji pracy doktorskiej opracowano i zwalidowano zgodnie z wytycznymi EMA metodę analityczną, która umożliwiła oznaczenie badanych związków w różnych matrycach biologicznych i z całą pewnością będzie wykorzystywana w przyszłości do dalszych badań nad treosulfanem. Praca napisana jest bardzo starannie, poprawnie pod względem edytorskim, stylistycznym i gramatycznym. Wyniki przedstawiono w postaci licznych tabel i rycin, które są niezwykle przejrzyste i właściwie zinterpretowane. W opisach tabel i rycin można doszukać się wszystkich niezbędnych informacji do zrozumienia zawartych w nich treści. Wśród nielicznych nieścisłości należy zwrócić uwagę na podrozdział 10.4 i 11.4: Analiza parametrów farmakokinetycznych, gdzie powinno być: Analiza farmakokinetyczna oraz w wielu miejscach pracy: kryteria Akaike i Schwartza, gdzie powinno być: kryteria Akaike i Schwarz a. Ocena metodologiczna pracy Rozprawa mgr Anny Kasprzyk liczy 190 stron i ma układ klasyczny, czyli składa się ze wstępu, celu pracy, części doświadczalnej, wyników,
omówienia wyników i dyskusji oraz wniosków. We wstępie Doktorantka omawia szeroko historię przeszczepień komórek krwiotwórczych oraz aktualnie stosowane schematy kondycjonowania przed przeszczepem, budowę i mechanizmy działania busulfanu i treosulfanu, działania niepożądane związane z ich stosowaniem oraz właściwości farmakokinetyczne tych leków. Cel pracy jest jasno sprecyzowany, a zaproponowane zadania badawcze są sformułowane poprawnie i logicznie ze sobą powiązane. Zastosowane metody badawcze są nowoczesne i zaawansowane technologicznie. Co więcej, zostały one trafnie dobrane do rodzaju zadań badawczych i zamierzonych celów. Do oznaczenia stężeń badanych związków Doktorantka zastosowała skomplikowaną technikę LC/MS/MS. W ramach badań opracowała oryginalną metodę oznaczania badanych związków w różnych matrycach biologicznych i przeprowadziła jej walidację zgodnie z wymogami EMA. Do analizy uzyskanych wyników zastosowała profesjonalne programy komputerowe, takie jak: WinNonlin, Statistica oraz GraphPad Prism. Na szczególną uwagę zasługuje dyskusja wyników, która jest niezwykle rzeczowa i wnikliwa. Omawiając wyniki Doktorantka często odnosi swoje rozważania do danych literaturowych - liczba cytowanych prac to aż 152 pozycje, które, w większości, ukazały się w ostatnich latach. Konsekwencją dyskusji wyników są wnioski, które trafnie podsumowują całą pracę i wskazują najważniejsze jej osiągnięcia. Pracę zamyka 6 załączników, zawierających m.in. zgody odpowiednich komisji etycznych oraz wyniki dopasowania modeli farmakokinetycznych do stężeń badanych związków pochodzących od poszczególnych pacjentów. Po zapoznaniu się z metodologią badań nasuwają się następujące uwagi i propozycje: Walidacja metod bioanalitycznych wg EMA obejmuje także badania stabilności standardu wewnętrznego oraz roztworów zapasowych i roboczych. Ponadto brak w opisie walidacji metody analitycznej informacji o badaniach stabilności z użyciem osocza ludzkiego oraz informacji czy i w jakich warunkach przechowywano próbki. Dopasowując model dwukompartmentowy do danych farmakokinetycznych zazwyczaj oczekuje się parametrów tj.: V 1, k 10, k 12 i k 21. W oparciu o nie można obliczyć tzw. parametry drugorzędne, np.:
CL, AUC, czy t 0.5. Nie jest jasne, dlaczego Doktorantka w Tabeli 27 podaje wartości parametrów typowych dla analizy bezmodelowej, podczas gdy w opisie tabeli wspomina o modelu dwukompartmentowym. W celu wyboru właściwego modelu farmakokinetycznego, Doktorantka stosowała kryteria informacyjne Akaike i Schwarz. Tymczasem ocena dobroci dopasowania obejmuje także inne elementy, tj. wizualna ocena dopasowania modelu do danych, wielkości współczynników zmienności i błędu standardowego parametrów farmakokinetycznych i, przede wszystkim, analiza rozkładu reszt (Gabrielsson J., Weiner D.: Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis: Concepts and Applications, 4th Edition, Swedish Pharmaceutical Press 2007). W pracy nie zamieszczono także informacji czy i jakie wagi zastosowano dopasowując modele do danych w programie WinNonlin. Dysponując stężeniami leku macierzystego i jego transformeru nie podjęto próby opracowania modelu z kompartmentem dla metabolitu. Takie podejście pozwoliłoby na równoczesne dopasowanie stężeń obu związków oraz na oszacowanie stałej szybkości powstawania aktywnego transformeru. Doktorantka podjęła próbę przewidywania pola pod krzywą zmian stężenia w czasie w szpiku kostnym pacjentów na podstawie znajomości stężeń badanych związków w osoczu i szpiku szczurów. Mając do dyspozycji program WinNonlin, można byłoby pokusić się o zbudowanie modelu fizjologicznego z uwzględnieniem wszystkich badanych tkanek i organów szczura, a następnie przeprowadzić symulacje stężeń tych związków w tkankach, w tym w szpiku kostnym, u ludzi. Nie wyjaśniono, dlaczego w badaniach wykorzystano zwierzęta obydwu płci oraz przyczyn, dla których w badaniach na zwierzętach wybrano drogę dootrzewnową, podczas gdy pacjenci otrzymywali lek drogą dożylną. Przedstawione uwagi nie umniejszają oceny merytorycznej pracy, która jest bardzo ambitna i świadczy o dużej wiedzy i umiejętnościach Doktorantki w zakresie prowadzenia badań farmakokinetycznych oraz rozwoju i walidacji metod analitycznych, jak również dowodzi znajomości nowoczesnych programów do analizy farmakokinetycznej i statystycznej.