WIRUS NEKROZY POMIDORA (TOMATO TORRADO VIRUS) NOWY PATOGEN POMIDORA

Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 WIRUS NEKROZY POMIDORA (TOMATO TORRADO VIRUS) NOWY PATOGEN POMIDORA HENRYK POSPIESZNY, NATASZA BORODYNKO, BEATA HASIÓW, ALEKSANDRA OBRĘPALSKA-STĘPLOWSKA, MARTA BUDZISZEWSKA Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Władysława Węgorka 20, 60-318 Poznań h.pospieszny@ior.poznan.pl I. WSTĘP W roku 2003, w Wielkopolsce (okolice Kalisza) na pomidorze szklarniowym odmiany Grace obserwowano objawy chorobowe dotąd nie notowane na tej roślinie w Polsce. Porażone rośliny były zahamowane we wzroście, listki i liście zniekształcone, często z objawami nekroz. Chorobie tej towarzyszyło nasilone występowanie mączlika szklarniowego (Trialeurodes vaporariorum). Wstępnie przeprowadzone badania wykazały, że czynnikiem sprawczym był wirus sferyczny i potwierdzono w warunkach eksperymentalnych, że mączlik szklarniowy faktycznie ma zdolność jego przenoszenia (Pospieszny 2005). Jedynym wirusem sferycznym, jaki dotąd występował na pomidorze w Polsce jest wirus mozaiki ogórka (Cucumber mosaic virus), który jednak nie jest przenoszony przez mączlika. Z kolei mączlik szklarniowy był opisywany jako wektor nitkowatych kriniwirusów, ale nie wirusów sferycznych. Izolat wirusa sferycznego wyizolowanego z pomidora oznaczyliśmy jako Wal 03. Dwa kolejne izolaty oznaczone jako Ros i Kra i podobne do izolatu Wal 03 pozyskaliśmy dopiero w roku 2007 z pomidora szklarniowego z woj. mazowieckiego. Także i w tym przypadku występowaniu wirusów towarzyszył mączlik szklarniowy. Na chorych roślinach występowały klasyczne dla tego wirusa objawy chorobowe w postaci żółtych przebarwień, a potem nekroz listków zaczynających się od ich nasady i następnie obejmujące całe liście, a nawet całe szczyty. Podobne objawy chorobowe na pomidorach obserwowano w południowo-wschodniej Hiszpanii, region Murcia. Choroba ta przez miejscowych producentów pomidora była nazwana jako Torrado, co oznacza opalona ogniem (roślina). Wirus ten został zidentyfikowany i opisany w roku 2007 (Verbeek i wsp. 2007a) i nazwany Tomato torrado virus (ToTV). Nie jest on podobny do żadnego z dotąd opisanych wirusów i zaproponowano dla niego nowy rodzaj Torradovirus. Obecnie rodzaj ten jest wzbogacony o kolejnego, nowego wirusa podobnego do ToTV, nazwanego jako Tomato marchitez virus (ToMarV). Wirus ten występuje w Meksyku i powoduje na liściach objawy chorobowe podobne ToTV, przy czym powoduje także nekrotyczne pierścienie na owocach, całkowicie pozbawiając je wartości handlowej. ToTV i To-

1086 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 MarV są genetycznie różne (Verbeek i wsp. 2007b). Ostatnio wykazano, że ToTV w Hiszpanii występuje na licznych chwastach i roślinach dzikorosnących (Alfaro- Fernandez i wsp. 2008). W roku 1984, w Kalifornii stwierdzono występowanie nekroz na pomidorze, podobnych do wywoływanych przez ToTV i powodowanych przez sferycznego wirusa przenoszonego przez mączlika ostroskrzydłego (Bemisia tabaci), którego nazwano wirusem nekrotycznej karłowatości pomidora (Tomato necrotic dwarf virus) (Larsen i wsp. 1984). Celem badań była identyfikacja i charakterystyka wirusa sferycznego występującego na pomidorze w Polsce. II. MATERIAŁ I METODY 1. Izolaty wirusa i zakres roślin gospodarzy Wirusy utrzymywano w szklarni na pomidorze odm. Beta Lux oraz tytoniu Nicotiana benthamiana i N. tabacum odm. Xanthi nc oraz Physalis floridana. Chore rośliny tytoniu były źródłem wirusa do zakażania roślin, celem ustalenia zakresu porażonych roślin oraz objawów chorobowych, a także do oczyszczania wirusa. Różne gatunki roślin testowych zakażono mechanicznie i następnie utrzymywano je w warunkach szklarniowych. Eksperymenty powtarzano co najmniej trzykrotnie, każdorazowo inokulując co najmniej po 3 rośliny z każdego testowanego gatunku. Objawy chorobowe obserwowano przez 34 tygodnie, a z roślin bez objawów początkowo wykonywano tylko reizolacje na N. benthamiana i pomidor Beta Lux lub N. tabacum odm. Xanthi nc, a później stosowano technikę serologicznego wyłapywania (immunocapture) i odwrotnej transkrypcji oraz reakcji łańcuchowej polimerazy (reverse transcription and polimerase chain reaction) (IC/RT-PCR). 2. Mikroskopia elektronowa i oczyszczanie wirusa Sok z roślin porażonych wirusem lub oczyszczony preparat wirusowy barwiono 2% kwasem fosforowolframowym. Skrawki tkanki liściowej utrwalano w 3% aldehydzie glutarowym w 0,025 M buforze fosforanowym, ph 7,3 zawierającym 1% czterotlenek osmu. Po odwodnieniu preparat tkankowy zatapiano w żywicy epoksydowej Epon 812. Tkankę zatopioną w żywicy cięto na ultracienkie skrawki i barwiono je octanem uranylu. W tak przygotowanych preparatach tkankowych analizowano w mikroskopie elektronowym ultrastrukturę organelli komórek porażonych przez wirusa. Wirusa do oczyszczania namnażano na tytoniu głównie N. benthamiana i N. tabacum odm. Xanthi nc i White Burley. Po około 12 dniach po inokulacji rośliny zbierano i świeże lub po mrożeniu homogenizowano w 0,1M buforze cytrynianowym zawierającym 2% ME, 0,5% siarczanu sodu i 0,002% Na EDTA, ph 7,5 w stosunku 1 : 5 (w/v). Homogenat przesączano, dodawano 2% Tritonu X-100 (v/v) i inkubowano przez noc w temp. 4 C. Mieszaninę soku roślinnego z Tritonem klarowano 20% chloroformem przez 5 min. i następnie wirowano 5 000 g 15 min. Supernatant zbierano i wirowano przez warstwę sacharozy przez 2 godz. przy 80 000 g. Osad rozpuszczano w buforze cytrynianowym ph 7,5 i klarowano przez wirowanie przez 10 min. przy 8 000 g. Supernatant nanoszono na 1040% gradient gęstości sacharozy i wirowano przez 2 godz. przy 28 000 obrotach. Strefy wirusowe zawieszone w gradiencie sacharozy lokalizowa-

Wirus nekrozy pomidora 1087 no przez przepuszczanie wiązki światła, która rozpraszając się na warstwach wirusa wywoływała efekt opalescencji. Strefy wirusowe zdejmowano z gradientu i zagęszczano przez wirowanie przez 2 godz. przy 80 000 g. 3. Serologia Typ objawów chorobowych na pomidorze, zakres porażonych roślin, dwa typy sferycznych cząstek wirusowych i przenoszenie przez mączlika ukierunkował dobór surowic do serologicznej identyfikacji, z jednej strony na konkretnego wirusa tj. wirusa nekrotycznej karłowatości pomidora (Tomato necrotic dwarf virus, ToNDV), a z drugiej ogólnie na wirusy z rodziny Bromoviridae, a szczególnie z rodzaju Nepovirus. Surowicę przeciwko ToDNV otrzymaliśmy dzięki życzliwości dr W. Wintermatel, USA, a surowicę przeciwko nepowirusom tj. wirusowi utajonego pierścieniowej plamistości truskawki (SLRSV), wirusowi mozaiki gęsiówki (ArMV), wirusowi brązowej plamistości pomidora (TBRV) i wirusowi pierścieniowej plamistości buraka (BRSV) pochodziły z własnej kolekcji. Do identyfikacji zastosowano test immunoelektronomikroskopię, Western-blot i IC/RT-PCR. 4. Produkcja surowicy Z powodu niskiej koncentracji wirusa w oczyszczonym preparacie i nie najlepszej jego jakości jako antygenu obrano skrócony schemat immunizacji królików. Króliki nowozelandzkie immunizowano domięśniowo, pięciokrotnie w jednotygodniowych odstępach używając każdorazowo około 0,3 mg/ml wirusa. Pierwszy zastrzyk wykonano z adiuwantem kompletnym, mieszając z preparatem wirusowym w stosunku 1 : 1. Następne immunizacje przeprowadzano z adiuwantem niekompletnym. Pierwsze skrwawianie wykonano 7 dni po ostatniej immunizacji. Przeprowadzono około 10 skrwawień i dla każdego z nich wykonywano ocenę jakości surowicy tzn. specyficzność i miano. Celem ograniczenia niespecyficzności tj. reakcji z sokiem z zdrowych roślin, surowicę adsorbowano ekstraktem białkowym z tytoniu (roślina z której oczyszczono wirusa) w stosunku 1 : 20 (w/v). Dla testu enzymoimmunologicznego i surowej surowicy ekstrahowano gamma-globuliny. 5. Przenoszenie przez mszyce i mączlika szklarniowego Przez mszyce. Mszyce Myzus persicae utrzymywano na tytoniu N. tabacum odm. Xanthi nc. Mszyce zbierano ze zdrowych roślin tytoniu, głodzono przez 2 godz. w probówce i przenoszono na liście roślin chorych N. tabacum odm. Xanthi nc, a następnie, po 23 min. żerze nabycia mszyce (po 510 osobników) nanoszono na zdrowe siewki N. tabacum odm. Xanthi nc. Po dobie żeru inokulacyjnego mszyce opryskiwano insektycydem. Po około 23 tygodniach obecność wirusa w zakażanych przez mszyce siewkach sprawdzano przez reizolację na N. benthamiana oraz testem IC/RT-PCR. Przenoszenie przez mączlika szklarniowego. Osobniki uskrzydlone z roślin pomidora odm. Beta Lux porażonych przez wirusa Wal 03 przenoszono w liczbie 5 do 10 osobników na siewki pomidora odm. Beta Lux na okres 48 godz., następnie usuwano przez opryskiwanie insektycydami. Przeniesienie i zakażenie siewek pomidora wirusem przez mączlika przejawiało się nekrotycznymi plamami na liściach, a później nekrozą liści i całych siewek. Z siewek bez objawów wykonywano reizolacje na rośliny N. benthamiana oraz testowano je IC/RT-PCR.

1088 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 6. Izolacja RNA Izolację RNA przeprowadzano metodą fenol-chloroform, wg protokołu przedstawionego przez Sambrooka (Sambrook i wsp. 1989). 2 μl RNA rozpuszczano w 8 μl formazolu, po czym rozdzielano na 1% żelu agarozowym. 7. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym Białka wirusowe były rozdzielane na 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Na żel nakładano zagęszczony, oczyszczony preparat wirusowy (50 ug/ul na studzienkę). Żel był wybarwiany przez noc w Coomasie Brillant Blue. Prążki odpowiadające wielkością podjednostkom białka płaszcza zostały wycięte z żelu i zanalizowane w Laboratorium Spektrometrii Mas w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Poznaniu na spektrometrze ESI-MS/MS. 8. RT-PCR Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono z użyciem zestawu do odwrotnej transkrypcji SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) z użyciem startera oligodt 22. Następnie prowadzono reakcje amplifikacji uzyskanego cdna ze specyficznymi starterami komplementarnymi do namnażanych fragmentów, zaprojektowanymi na podstawie danych zdeponowanych w GeneBanku. Alternatywnie przeprowadzano RT-PCR jednoetapowy przy użyciu zestawu One Step RT-PCR Kit (Qiagen). Amplifikację końców 5 i 3 prowadzono przy użyciu zestawu 5 oraz 3 RACE (Invitrogen). 9. IC/RT-PCR Testy IC/RT-PCR przeprowadzono z surowicą skierowaną przeciwko ToTV. Użyto startery TR2F 5 GAAGGACGAAGAGCGACTG 3 i TR2R 5 AAGGTAGGTA- TGCGTTTGC 3 amplifikujące fragment RNA 2 długości około 573 nt. Probówki do reakcji PCR opłaszczano specyficznymi przeciwciałami rozcieńczonymi 50 razy w buforze węglanowym. Próbówki inkubowano 1 godzinę w 37 C po czym płukano 3 razy buforem PBS-T. Następnie dodawano sok z liści roztartych w buforze do ekstrakcji prób i inkubowano przez 1 godzinę w 37 C i płukano. Do probówek dodawano po 25 μl mieszaniny do reakcji RT-PCR. Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono przez 20 minut w 42 C, a reakcję PCR prowadzono przez 30 cykli (denaturacja 94 C 30 sek., przyłączanie starterów 50 C 30 sek. i elongacja 72 C 30 sek.). 10. Klonowanie, sekwencjonowanie i analiza filogenetyczna Produkty amplifikacji eluowano z żelu z stosując QiaexII Gel Extraction Kit (Qiagen), zagęszczano i ligowano do wektora w systemie pgem T-Easy (Promega). Następnie transformowano komórki bakteryjne, stosując elektrokompetentne szczepy TG1 E. coli. Alternatywnie prowadzono transformację metodą szoku termicznego. Poznane sekwencje dla poszczególnych izolatów ToTV analizowano w oparciu o bazę danych NCBI. Porównano stopień podobieństwa sekwencji nukleotydowych (BlastN) oraz aminokwasowych (BlastP) z sekwencjami zdeponowanymi w GenBanku. Analizę filogenetyczną w oparciu o sekwencje białka płaszcza badanych izolatów ToTV prowadzono z użyciem programu MEGA 4.0, wybierając model Neighbour Joining (NJ) oraz liczbę bootstrapową o wartości 1 000.

Wirus nekrozy pomidora 1089 III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE 1. Zakres roślin porażonych przez wirusa i objawy chorobowe Gatunki roślin porażone przez wirusa Wal 03 oraz objawy przez niego powodowane są przedstawione w tabeli 1. Wirus głównie porażał gatunki roślin z rodziny psiankowatych. Na większości roślin z tej rodziny powodował objawy w postaci łagodnych przejaśnień nerwów liści, żółknięcia, zniekształceń, mozaiki, które są niekiedy trudne do wychwycenia niewprawnym okiem. Wyraźne objawy chorobowe, często typu nekroz, wirus powoduje nie tylko na pomidorze, ale także na Physalis floriana i ziemniaku. Tabela 1. Zakres porażanych roślin i objawy chorobowe powodowane przez Wal 03 Table 1. Host range and symptoms caused by Wal 03 isolate Rośliny Plants Capsicum annuum Datura inoxia Nicotiana affinis N. benthamiana N. clevelandii N. debneyi N. glutinosa N. tabacum cv. White Burley N. tabacum cv. Xanthi Nicandra physaloides Petunia hybrida Physalis floridana Solanum lycopersicum (Beta Lux, Grace) S. lycopersicum (Emotion, Raisa) S. melongema S. tuberosum lokalne local (rs) (rs) (rs) (ns) Objawy Symptoms systemiczne systemic ch vc, ch s, ch ch, mf s s, ch vc, ch vc, ch vc, ch ch ch ch, mf, n n, mf ch ns ch chloroza chlorosis; rs pierścienie ring spots; ns nekrotyczne plamy necrotic spots; vc rozjaśnienie nerwów vein clearing; s infekcja bez objawowa symptomless infection; mf zniekształcenia malformations; n nekrozy necrosis; ( ) objawy występowały rzadko symptoms occured occasionally; brak objawów, brak infekcji no symptoms, no virus Ponieważ Wal 03 występował w warunkach Polski na pomidorze szklarniowym powodując zmiany chorobowe czyniące go potencjalnie groźnym patogenem dla tej rośliny, została przetestowana reakcja wielu odmian pomidora na tego wirusa. Z testowanych odmian pomidora można wyróżnić trzy różne grupy: 1. odmiany bardzo podatne: reagujące różnego typu nekrozami i deformacjami liści i roślin np. Beta Lux, Krakus; 2. odmiany podatne: reagujące na wirusa nekrotycznymi, drobnymi plamkami albo mozaiką lub infekcja bezobjawową Hebana, Bawole Serce; 3. odmiany odporne: praktycznie nie ulegające porażeniu: Emotion, Raisa.

1090 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 Oznacza to, że dobór odmian odpornych może być jednym z istotnych czynników ograniczających występowanie wirusa. 2. Mikroskopia elektronowa i właściwości wirusa oczyszczonego W soku roślinnym obserwowano obecność cząstek wirusowych o średnicy około 28 nm (rys. 1). Generalnie koncentracja wirionów w soku roślinnym jest ekstremalnie niska, a w przypadku pomidora Beta Lux z objawami nekroz cząstek wirusowych często nie obserwowano. Analiza ultrastruktury komórek liściowych porażonych przez wirusa wykazała, że znakomita część cząstek wirusowych jest uwiązana w kryształach, rozmieszczonych w cytoplazmie (rys. 2). Rys. 1. Cząstki wirusowe w oczyszczonym preparacie w mikroskopie elektronowym Fig. 1. Purified particles of ToTV Wal 03 Rys. 2. Skupiska cząstek wirusowych Wal 03 w postaci kryształów Fig. 2. Crystal-like aggregates of ToTV Wal 03 particles in the leaf cell of tomato

Wirus nekrozy pomidora 1091 Wirus podczas wirowania w gradiencie gęstości sacharozy sedymentował w postaci dwóch stref opalizujących w świetle przechodzącym, co odpowiada dwom typom cząsteczek wirusowych. Cząstki te nie różnią się morfologicznie, ale różnią się współczynnikiem sedymentacji, co może wynikać z różnego upakowania cząstek genomowym RNA. Zarówno charakterystyka spektrofotometryczna, jak i mikroskopia elektronowa świadczą o ograniczonej czystości preparatu tzn. czystym cząstkom wirusowym towarzyszą niskocząsteczkowe białka roślinne. Wydajność czystego wirusa była stosunkowo niska i wynosiła około 0,7 mg z 1 000 g masy zielonej. 3. Przenoszenie przez mszyce i mączlika szklarniowego Eksperymentalnie potwierdzono to co obserwowano w warunkach szklarniowych tzn. że bardzo efektywnym wektorem Wal 03 jest mączlik szklarniowy. Niekiedy 5 osobników mączlika na siewkę pomidora było wystarczającym warunkiem do 100% efektywności przenoszenia. M. persicae nie przenosi wirusa Wal 03. 4. Serologia Żadna z surowic przeciwko wirusom z rodziny Bromoviridae zastosowanych do identyfikacji wirusa Wal 03 nie dała z nim pozytywnej reakcji. Surowica uczulona na TNDV w testach Western blot i immunoelektronomikroskopii (IEM) reagowała z badanym wirusem. Później, kiedy dysponowaliśmy starterami specyficznymi do Wal 03 pokrewieństwo zostało potwierdzone techniką IC/RT-PCR. Stosując uproszczony schemat immunizacji ze względu na trudności wyprodukowania odpowiedniej ilości bardzo czystego wirusa uzyskaliśmy surowicę na izolat wirusowy Wal 03, przy czym jak można było się spodziewać o stosunkowo niższym mianie i do pewnego rozcieńczenia o ograniczonej specyficzności. W teście ELISA pośrednie miano surowicy wynosiło ok. 20 000, przy czym optymalne rozcieńczenie do wykrywania wirusa mieściło się pomiędzy 5 000 i 10 000. Przy tych rozcieńczeniach wynik pozytywny stanowił trzykrotną wartość absorpcji dla kontroli negatywnej (sok z rośliny zdrowej). Surowicę z powodzeniem można było wykorzystać w testach diagnostycznych, gdzie jest wykorzystywana do wyłapywania i zagęszczania cząstek wirusowych z soku roślinnego i jej ograniczona specyficzność nie limituje jej wykorzystania, jak np. w IC/TR-PCR (rys. 3). Rys. 3. Rozdział elektroforetyczny produktów reakcji IC/RT-PCR M marker HyperLadder IV(Bioline) C kontrola negatywna 1 izolat Wal 03, 2 izolat Ros, 3 izolat Kra Fig. 3. Identification of the Polish ToTV isolates by IC/RT-PCR M marker HyperLadder IV(Bioline) C negative control 1 Wal 03 isolate, 2 Kra isolate, 3 Ros isolate

1092 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 5. Budowa kapsydu Analiza elektoforetyczna białka kapsydu wirusa Wal 03 wykazała, że otoczkę białkową wirusa tworzą trzy podjednostki o wielkości: ~ 32, 26 i 24 kda (rys. 4). Rys. 4. Obraz elektroforetyczny podjednostek białkowych kapsydu wirusa Wal 03 (ToTV) M marker białek Fermentas Fig. 4. Coomassie Brillant Blue stained coat proteins after denaturating polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) M protein Ladder 6. Charakterystyka genomu Elektroforeza RNA Wal 03 pokazała, że genom składa się z dwóch fragmentów: RNA1 wielkości około 7 800 nt oraz RNA2 wielkości około 5 400 nt (rys. 5). Rys. 5. Obraz elektroforetyczny genomu wirusa Wal 03 M marker RNA (High RNA range ladder 0,5 6kb) Fermentas 1 RNA1 i RNA2 Fig. 5. Electrophoretic mobility of ToTV-Wal 03 RNAs M marker RNA (High RNA range ladder 0,5 6kb) Fermentas 1 RNA1 and RNA2

Wirus nekrozy pomidora 1093 7. Molekularna identyfikacja i charakterystyka ToTV Na podstawie sekwencji nowego wirusa Tomato torrado virus (ToTV) (Verbeek i wsp. 2007a), bardzo podobnego do wirusa Wal 03, zaprojektowano serię starterów komplementarnych do sekwencji izolatu hiszpańskiego ToTV, w celu identyfikacji i charakterystyki izolatów wirusowych Wal 03 oraz Kra i Ros. W badaniach skupiono się głównie na poliproteinie kodowanej przez drugą nić RNA (RNA2), a zwłaszcza na podjednostkach polipeptydowych wchodzących w skład białka płaszcza. Badania z zastosowaniem RT-PCR i IC/RT-PCR (rys. 3) wykazały, że wszystkie polskie izolaty są podobne do wirusa ToTV. Nić RNA2 ToTV posiada dwie ramki odczytu: ORF1, kodującą białko o nie poznanych dotąd funkcjach oraz ORF2, która koduje informacje dla białka płaszcza składającego się z trzech podjednostek Vp 23, 26, 35 oraz białka odpowiadającego za transport MP. Amplifikację poliproteiny ORF2 dla trzech polskich izolatów wirusa ToTV Wal 03, Kra i Ros prowadzono za pomocą techniki RT-PCR z użyciem zestawu One Step RT-PCR Kit (Qiagen) i ze starterami zaprojektowanymi na podstawie sekwencji RNA2 hiszpańskiego izolatu wirusa ToTV. W przypadku izolatu Wal 03 poznano pełną długość ORF2 RNA2, natomiast u dwóch pozostałych izolatów Kra i Ros poznano znaczny fragment poliproteiny obejmujący pełną długość regionu kodującego trzy podjednostki białka płaszcza. Na podstawie sekwencjonowania ustalono, że region kodujący ORF2 nici RNA2 Wal 03 składa się z 3 592 nukleotydów, natomiast kodowana poliproteina składa się z 1 198 aminokwasów. W obrębie poliproteiny występuje sekwencja białka 3A z charakterystycznym regionem dla białka odpowiadającego za przemieszczanie cząstek wirusowych MP (movement protein) oraz trzy podjednostki białka strukturalnego, opłaszczającego genom wirusa. Podjednostki białka analogicznie, jak u hiszpańskiego izolatu wirusa ToTV, kodowane są u wszystkich polskich izolatów w następującej kolejności: Vp35, Vp26 oraz Vp23 i składają się odpowiednio z 246, 237 i 217 aminokwasów. Analiza porównawcza sekwencji zarówno nukleotydowej, jak i aminokwasowej białka płaszcza analizowanych izolatów wykazała największą homologię do hiszpańskiego wirusa ToTV. Homologia sekwencji izolatów Kra, Ros i Wal 03 do ToTV wynosi 99%, 98%, 99%, odpowiednio dla Vp35, Vp23 oraz Vp26 na poziomie nukleotydowym. Na poziomie aminokwasowym podobieństwo sekwencji Wal 03 w stosunku do poznanych sekwencji izolatu hiszpańskiego wynosi 100% dla Vp35 oraz 100% i 99% dla Vp26 i Vp23. W przypadku izolatu Kra największe podobieństwo 100% występuje dla podjednostki Vp26, natomiast dla pozostałych jednostek wynosi 99% podobieństwa i 9899% identyczności. W przypadku izolatu Ros podobieństwo jednostek wynosi 9899%, a identyczność sięga 99%. Między polskimi izolatami największą homologię sekwencji nukleotydowej kodującej białko płaszcza stwierdzono pomiędzy izolatem Kra i Ros, rzędu 99100%, natomiast w stosunku do izolatu Wal 03 podobieństwo jest nieco niższe i wynosi 9899% (tab. 2). Przeprowadzona analiza filogenetyczna potwierdziła wysokie podobieństwo między polskimi izolatami wirusa nekrozy pomidora, a hiszpańskim ToTV, jak również bardzo krótki dystans ewolucyjny między izolatami Kra i Ros.

1094 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 Tabela 2. Analiza porównawcza w BlastN sekwencji nukleotydowej podjednostek białka płaszcza polskich izolatów wirusa nekrozy pomidora Table 2. The comparative analysis of nucleotide sequences of CP subunits between Polish isolates of ToTV Wirus Virus Region Kra Ros Wal 03 Vp23 100% 98% Kra Vp26 99% 99% Vp35 99% 99% Vp23 100% 98% Ros Vp26 99% 99% Vp35 99% 99% Vp23 98% 98% Wal 03 Vp26 99% 99% Vp35 99% 99% Rys. 6. Drzewo obrazujące zależności filogenetyczne polskich izolatów ToTV Fig. 6. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequence of the RNA2 fragment encoding CP subunits of Polish isolates of ToTV IV. DYSKUSJA Już okoliczności izolowania wirusa oznaczonego roboczo jako Wal 03 i wstępne rozpoznanie jego morfologii sugerowało, że mamy do czynienia z nowym wirusem. Występowaniu tego sferycznego wirusa towarzyszył mączlik szklarniowy (T. vaporariorum). Eksperymenty w warunkach kontrolowanych potwierdziły, że mączlik szklarniowy jest bardzo efektywnym wektorem wirusa Wal 03. Jeżeli uwzględnimy, że wirus Wal 03, który otrzymał nazwę wirus nekrozy pomidora (Tomato torrado virus) jest wirusem nietrwałym i przenoszonym mechanicznie w sposób znacznie mniej efektywny niż przez mączlika szklarniowego, to czyni mączlika najistotniejszym elementem w epidemiologii wirusa. Tym bardziej, że mączlik przenosi wirusa w sposób trwały, z jednego sezonu w drugi. Potwierdzeniem wagi mączlika jako wektora ToTV jest fakt, że w warunkach szklarniowych problem wirusa przestał istnieć wraz z eliminacją mącz-

Wirus nekrozy pomidora 1095 lika szklarniowego. Jako pierwsi, jeszcze przed identyfikacją wirusa podkreślaliśmy w różnych publikacjach ważkość mączlika szklarniowego jako jego wektora (Pospieszny 2005; Pospieszny i wsp. 2007a, b). ToTV z roślin gospodarczo ważnych oprócz pomidora może porażać ziemniaka i paprykę, ale tylko w warunkach występowania mączlika czyli szklarniowych, gdyż w polu raczej on nie występuje, a jeżeli tak to przypadkowo, w sposób nie utrwalony, nie dający mu możliwości bycia wektorem wirusa. Innym istotnym faktem mającym znaczenie w epidemiologii ToTV na pomidorze szklarniowym jest to, że wrażliwość poszczególnych odmian może być zróżnicowana od silnej podatności do odporności na ToTV włącznie. Reasumując właściwości wirusa związane z jego szkodliwością i ograniczaniem występowania należy powiedzieć, że stosowanie odmian odpornych dostępnych oraz zwalczanie mączlika szklarniowego jako wektora wirusa czyli już w małym nasileniu, może całkowicie zabezpieczyć pomidora szklarniowego przed ToTV. ToTV w Hiszpanii został stwierdzony w warunkach polowych. Nie jest wykluczone, że wektorem ToTV jest także mączlik ostroskrzydły (Bemisia tabaci). Za tym może przemawiać fakt, że wirus nekrotycznej karłowatości pomidora (Tomato necrotic dwarf virus, TNDV) opisany w USA w 1985 roku (Larsen i wsp. 1984) w wielu właściwościach podobny do ToTV był przenoszony przez B. tabaci. Wirus ten był sferyczny, także miał dwa typy cząsteczek, genom dwudzielny oraz porażał tylko rośliny z psiankowatych. Wykazaliśmy, że surowica przeciwko TNDV reagowała z polskim izolatem ToTV. Wszystko to wskazuje, że oba izolaty wirusowe reprezentowały ten sam gatunek, czego jednak nie można w pełni wykazać, gdyż TNDV został przez Amerykanów utracony. W Hiszpanii, prawie w tym samym czasie co w Polsce, na pomidorze uprawianym w gruncie obserwowano objawy chorobowe w postaci nekroz liści, podobne do tych powodowanych przez polski izolat Wal 03. Pełną identyfikację i charakterystykę izolatu hiszpańskiego przeprowadzili naukowcy holenderscy (Verbeek i wsp. 2007a). Sekwencja nukleotydowa wirusa istotnie różniła się od dotąd opisanych i dlatego uznano go jako nowy i nazwano Tomato torrado virus. Wirus ten także nie mieści się w obecnej klasyfikacji wirusów i zaproponowano utworzenie nowego rodzaju Torradovirus (Verbeek i wsp. 2007a). Polskie izolaty, zarówno Wal 03, jak i dwa późniejsze Kra i Ros, na poziomie nukleotydowym są w 9899% podobne do izolatu hiszpańskiego, co oznacza, że są izolatami wirusa nekrozy pomidora. Także pozostałe właściwości, takie jak zakres porażanych gatunków roślin, objawy chorobowe, morfologia cząstek wirusowych, budowa kapsydu i budowa genomu są bardzo podobne. Tylko my, w przypadku polskich izolatów wskazujemy na mączlika szklarniowego, jako znaczącego wektora ToTV. Dotąd występowanie ToTV stwierdzono w Polsce (Pospieszny 2005; Pospieszny i wsp. 2007a), w Hiszpanii (Verbeek i wsp. 2007a) i na Wyspach Kanaryjskich (Alfaro- Fernández i wsp. 2007). Na koniec nasuwa się pytanie, skąd i w jaki sposób ToTV trafił do Polski, bo nie ma podstaw sądzić, że jest to wirus rodzimy. Nie ma też żadnych przesłanek, że jest to efekt ocieplenia się klimatu, gdyż występowanie wirusa stwierdzono w szklarniach, a nie w warunkach polowych. Firmy nasienne produkują nasiona pomidorów w krajach o ciepłym klimacie i prawdopodobnie stamtąd wirus został zawleczony. W Hiszpanii zarówno ToTV, jak i jego wektor, występują w warunkach polowych i wirus jest umocowany w naturalnym środowisku przez występowanie na wielu chwastach i roślinach dziko rosnących (Alfaro-Fernández i wsp. 2008).

1096 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 48 (3) 2008 Badania były finansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego w ramach projektu badawczego Nr 2P06R 06629. V. LITERATURA Alfaro-Fernández A., Cordoba-Sellez C., Cebrian M.C. 2007. First Report of Tomato torrado virus in tomato in the Canary Islands. Plant Dis. 91, s. 1060. Alfaro-Fernández A., Córdoba-Sellés C., Cebrián M.C., Herrera-Vásquez J.A., Sánchez-Navarro J.A., Juárez M., Espino A., Martín R., Jordá C. 2008. First Report of Tomato torrado virus on Weed Hosts in Spain. Plant Dis. 92, s. 831. Larsen R.C., Duffus J.E., Liu H.Y. 1984. Tomato necrotic dwarf a new type of whitely transmitted virus. Phytopathology 74, s. 795. Pospieszny H. 2005. Preliminary study on the spherical virus transmitted by greenhouse withefly (Trialeurodes vaporariorum). 2nd Joint Confer. Work Group Legum. Veget. Viruses, Florida, USA, Abstract Book, s. 30. Pospieszny H., Borodynko N., Obrępalska-Stęplowska A., Hasiów B. 2007a. The First Report of Tomato torrado virus in Poland. Plant Dis. 91, s. 1364. Pospieszny H., Borodynko N., Hasiów B., Obrępalska-Stęplowska A., Budziszewska M. 2007b. Tomato torrado virus New virus trasmitted by greenhouse whitefly (Trialeurodes vaporariorum) in Poland. 10th Plant Virus Epidemiology Symposium, 1519 October 2007, ICRI- SAT, India. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New-York, USA, 743745. Verbeek M., Dullemans A.M., van den Heuvel J.F.J.M., Maris P.C., van der Vlugt R.A.A. 2007a. Identification and characterisaction of tomato torrado virus, a new plant picorna-like virus from tomato. Arch. Virol. 152: 881890. Verbeek M., Dullemans A.M., van den Heuvel J.F.J.M., Maris P.C., van der Vlugt R.A.A. 2007b. Identification and characterisation of tomato marchitez virus, a new plant picorna-like virus from tomato. Arch. Virol. 153: 127134. HENRYK POSPIESZNY, NATASZA BORODYNKO, BEATA HASIÓW, ALEKSANDRA OBRĘPALSKA-STĘPLOWSKA, MARTA BUDZISZEWSKA TOMATO TORRADO VIRUS NEW PATOGEN OF TOMATO SUMMARY In 2003 and 2007 the spherical virus was isolated from greenhouse tomato plants with symptoms of leaves necrosis. The isolates on the basis of their host range, symptomatology, particles morphology, serology, coat protein and genome composition were identified as Tomato torrado virus (ToTV). First time we showed that virus was vectored by Trialeurodes vaporariorum very efficiently. The sequences comparison between the Polish isolates and ToTV (Spanish isolate) showed 99 and 98% homology for RNA1 and RNA2, respectively. The studies showed that Polish ToTV isolates are very close related to each other but not identical. Key words: Tomato torrado virus, host range, Trialeurodes vaporariorum, transmission, phylogenetic analysis