MASOWE PORAŻENIE CUKINII W UPRAWIE POLOWEJ PRZEZ WIRUSY

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 46 (1) 2006 MASOWE PORAŻENIE CUKINII W UPRAWIE POLOWEJ PRZEZ WIRUSY HENRYK POSPIESZNY, MIECZYSŁAW CAJZA Instytut Ochrony Roślin Miczurina 20, Poznań H.Pospieszny@ior.poznan.pl I. WSTĘP Cukinia w Polsce jest nieporównywalnie mniej popularnym warzywem dyniowatym niż ogórek i jej uprawa ograniczała się do ogródków przydomowych. W ostatnich latach, znacząco wzrosła powierzchnia upraw cukinii w warunkach polowych, z zastosowaniem nowoczesnych technologii takich jak sterowane dokarmianie i nawadnianie roślin. W roku 2005 cukinia uprawiana była na powierzchni około 350 ha, a w roku 2006 planuje się zwiększenie powierzchni do ponad 500 ha. Ten bardzo istotny wzrost uprawy cukinii nie wynika ze zmiany gustów Polaków, ale uwarunkowany jest względami ekonomicznymi. Firmy zagraniczne przetwarzające warzywa przenoszą uprawy cukini z Hiszpanii, Francji i innych krajów do Polski. Cukinii uprawianej w polu zagraża wiele chorób, przy czym najgroźniejsze są wirusowe, a z czynników sprawczych, przede wszystkim wirus żółtej mozaiki cukinii (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV). W połowie lat siedemdziesiątych ubiegłego stulecia we Włoszech obserwowano silne wirusopodobne objawy chorobowe, którym towarzyszyły poważne straty w plonie. Dopiero na początku lat osiemdziesiątych prawie jednocześnie we Włoszech (Lisa i wsp. 1981), Francji (Lecoq i wsp. 1984) i USA (Provvidenti i wsp. 1984) stwierdzono, ze sprawcą silnych porażeń cukini jest wirus żółtej mozaiki cukinii. Jest to wirus nitkowaty o długości cząstek około nm, należący do rodzaju Potyvirus. Zaskakujące z punktu epidemiologii wirusa było jego błyskawiczne rozprzestrzenianie się, gdyż w ciągu niewielu lat występował już wszędzie tam gdzie uprawiano cukinię. Tej sytuacji sprzyjały takie właściwości wirusa jak efektywne przenoszenie przez mszyce oraz z nasionami. Na dalekie odległości niewątpliwie wirus był przenoszony z nasionami, przy czym zakres tego problemu nie jest łatwy do ustalenia, gdyż zależy od wielu czynników, takich jak: gatunek rośliny, odmiana, izolat wirusa, warunki środowiskowe itp. Na przykład jeden izolat ZYMV był przenoszony z nasionami Cucurbita pepo odm. styrica w zakresie od 0,3 do 15,3% (Tobias i wsp. 2003), z kolei w innych warunkach, inny izolat wirusa z nasionami tej samej odmiany przenosił się w zakresie od 1 do 5% (Riedle i wsp. 2002). Nasiona niektórych odmian ogórka mogą być skażone wirusem nawet w 90% (Dikova i Hristova 2002). ZYMV jest przenoszony na plantację cukinii i rozprzestrzeniany przez liczne gatunki mszyc takie jak: mszyca ogórkowa (Aphis gos-

2 Wirus żółtej mozaiki cukini 143 sipii), mszyca lucernowo-grochodrzewowa (Aphis craccivora), mszyca brzoskwiniowoziemniaczana (Myzus persicae), mszyca grochowianka (Acrythosiphon pisum), mszyca kapustnica wielożerna (Lipaphis rysimi) i inne. Zwiększa to istotnie możliwość przeniesienia ZYMV z różnych gatunków roślin, mogących być potencjalnym rezerwuarem wirusa. ZYMV jest szkodliwy jedynie dla roślin dyniowatych, ale był stwierdzany sporadycznie także na różnych gatunkach roślin dziko rosnących, takich jak: Chenopodium album, Lamium purpureum, Plantago media, Capsella bursa-pastoris, Rumex obtusifolium, Tripleurosperum maritimum, Stellaria media i Triforium repens (Riedle-Baur i wsp. 2002; Swoboda i Polak 2002). Uważa się jednak, że rola tych naturalnych rezerwuarów wirusa jest znacznie mniejsza niż nasion skażonych wirusem. Należy zwrócić uwagę na dużą zmienność genetyczną izolatów ZYMV, manifestującą się szeregiem różnych szczepów patogena (Pfosser i Baumann 2002; Tobias i Palkovics 2003). Gwarantuje to wirusowi dużą plastyczność i przystosowanie do różnych warunków, a jednocześnie stanowi istotny problem dla hodowli odpornościowej znacznie ją utrudniając. Z krajów sąsiadujących z Polską ZYMV występuje w Niemczech i w Czechach. W Czechach po raz pierwszy wirusa stwierdzono w roku 1991, ale już od roku 1997 stał się najgroźniejszym patogenem dyniowatych (Chod i Jakes 1991; Swoboda i Polak 2002). W Polsce po raz pierwszy ZYMV został zidentyfikowany w roku 2003 na ogórku szklarniowym (Pospieszny i wsp. 2003), przy czym wirus występował sporadycznie nie powodując znaczących strat. W niniejszej pracy przedstawiamy identyfikację wirusa porażającego w roku 2005 cukinię w uprawie polowej. II. MATERIAŁY I METODY W roku 2005, na 2 plantacjach cukini żółtej i zielonej (barwa owoców) wystąpiło silne porażenie roślin przez wirusy. Z zebranych prób chorych roślin przygotowano inoculum, którym zakażano rośliny i na których utrzymywano wirusy w warunkach szklarniowych. Zarówno rośliny zebrane w polu jak i rośliny na których utrzymywano wirusy przeglądano w mikroskopie elektronowym dla określenia morfologii cząstek. Określono zakres roślin gospodarzy (tab. 1) przez mechaniczną inokulację różnych gatunków roślin sokiem z chorych roślin cukini. W przypadku braku objawów na zakażanych roślinach, sok z nich przeglądano w mikroskopie elektronowym. Dla ustalenia możliwości wprowadzenia wirusa na plantację z nasionami cukini, pojedynczo do doniczek, wysiano 600 nasion jednej z odmian porażonych w polu. Po 30 i 60 dniach od wysiania dokonywano przeglądu roślin pod kątem wystąpienia objawów chorobowych. Z roślin podejrzanych o porażenie pobierano sok do badania w mikroskopie elektronowym i zakażenia roślinek cukinii w stadium rozwijającego się pierwszego liścia. Ostateczną identyfikację wirusa przeprowadzono techniką odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR). Reakcje RT-PCR przeprowadzono z trzema zestawami starterów specyficznych dla ZYMV: ZY-25 (CGCAGTGCTCATAAT- CAGGTCG) i ZY-251R (GCTGATGAGACGCTCGTGTG) oraz ZY-2 (GCTCCATA- CATAGCTGAGAC) i ZY-253R (AACGGAGTCTAATCTCGAGC), opracowanych przez Wisler i wsp. (1995), a także ZY-1R (CACAATTTTCCCATGAGAACCAGC)

3 144 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 46 (1) 2006 i 2Y-2F (GCTCCATACATAGCTGAGACAGC), opracowanymi przez Lin S.-S., Hou R.F. and Eh S.-D (Tajwan, dane nie publikowane). Reakcje RT-PCR prowadzono zgodnie z metodyką stosowaną przez autorów. Tabela 1. Zakres porażanych roślin oraz objawy chorobowe wywołane przez wirusa żółtej mozaiki cukinii Table 1. Host range and symptoms caused by Zucchini yellow mosaic virus Roślina Plant Chenopodium quinoa C. ficifolium Cucumis sativus Cucurbita pepo C. pepo cv. Patissonia var. Polo F1 C. pepo cv. Giromntiina var. Astra Citrullus lanatus var. Bingo Cucurbita melo Pisum sativum Phaseolus vulgaris Nicotiana tabacum var. Xanthi nc N. debneyi N. affinis N. benthamiana Physalis floridana Nicandra physaloides Datura inoxia Tetragonia expansa ZYMV-Zuy Lch; s ; Sm, Sz ; Sm, Sz ; Sm, Sz ; Sm, Sm s Objawy Symptoms ZYMV-Zug Lch; ; Sm ; Sm, Szn ; Sm, Szn ; Sm, Szn ; Sm ; Sm s Lch = lokalne, chlorotyczne plamy local chlorotic lesions; Sm = systemiczna mozaika systemic mosaic; Szn = systemiczne zniekształcenie liści systemic leaf deformation; s = bezobjawowa infekcja systemiczna symptomless systemie infection; = brak objawów, brak wirusa no symptoms, no virus Uzyskane produkty amplifikacji rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym. Strefę żelu, zawierającą produkty RT-PCR wycinano i eluowano z niej DNA przy pomocy zestawu GEl-Out (A&A Biotechnology), zgodnie z procedurą producenta. Oczyszczone DNA poddano sekwencjonowaniu. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Inspekcja pól cukinii porażonej wirusem pozwoliła jednoznacznie stwierdzić, że chore rośliny występowały jedynie na obrzeżu jednego z końców pól. Dotyczyło to zarówno plantacji cukinii żółtej jak i zielonej. Od brzegów pól wirus rozprzestrzeniał się w głąb plantacji porażając od 10 do 25% roślin. Nie obserwowano występowania chorych roślin wewnątrz oraz na drugim końcu plantacji. Powyższe obserwacje sugerują, że naniesienie wirusa na plantację mogło się dokonać przez mszyce, których wystę-

4 Wirus żółtej mozaiki cukini 145 powanie stwierdzono. Producenci obserwowali wyraźne zahamowanie rozprzestrzeniania się wirusów po zastosowaniu insektycydów, mimo, że może on być także przenoszony mechanicznie z rośliny chorej na zdrową w czasie zbiorów owoców. Efektywność mechanicznego przenoszenia istotnie spada wraz z wiekiem roślin (odporność polowa), a temu sprzyja także bardzo dobra kondycja roślin. Dobrą kondycją roślin należy także tłumaczyć stosunkowo słabe objawy chorobowe roślin. Pokrój porażonych roślin był nieznacznie słabszy, ale rośliny były zauważalnie pożółknięte w porównaniu z ciemnozielonymi roślinami zdrowymi. Na liściach występowała żółto-zielona mozaika, przy czym nie obserwowano silnych zniekształceń blaszek liściowych, jakie powodowały badane wirusy na tych samych odmianach warunkach szklarniowych. W warunkach polowych chore rośliny produkowały owoce o co najmniej ograniczonej wartości użytkowej (handlowej). W porównaniu z owocami z roślin zdrowych, były one zauważalnie mniejsze, przebarwione i niekiedy lekko zniekształcone. Najbardziej charakterystycznym objawem były przebarwienie owoców, które na cukinii zielonej ujawniały się żółtymi plamami, a żółtej zielonymi. Brak porażonych roślin na drugim końcu lub wewnątrz plantacji pozwala na przypuszczenie, że wirusy na plantacji cukinii nie zostały wprowadzone wraz z nasionami. Wrażenie to potwierdziły badania nasion na obecność w nich wirusów. Z 600 nasion wysianych wyrosły tylko rośliny wolne od wirusów. W mikroskopie, w soku porażonych roślin cukinii stwierdzono obecność cząstek wirusowych nitkowatych o długości od 700 do 750 nm, charakterystycznych dla potywirusów (rys. 1). Rys. 1. Cząstki wirusa żółtej mozaiki cukinii Fig. 1. Particles of Zucchini yellow mosaic virus

5 146 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 46 (1) 2006 W warunkach szklarniowych wirusy (z cukinii żółtej i zielonej) porażały głównie rośliny z rodziny dyniowatych. Izolaty oznaczone jako Zuy i Zug nieznacznie różniły się typem powodowanych objawów. Generalnie izolat Zug powodował silniejsze objawy co szczególnie widoczne było na ogórku, na którym Zug powodował pomarszczenie i mozaikę blaszki liściowej, a Zuy występował bezobjawowo. Oba izolaty różniły się od wcześniej opisanego izolatu ogórkowego ZYMV-Cuc, bardziej od nich patogenicznego (Pospieszny i wsp. 2003). Badane izolaty wirusowe powodowały silne objawy chorobowe na cukinii w warunkach szklarniowych. Rośliny były zahamowane we wzroście, a blaszki silnie zniekształcone. Pełną identyfikację wirusa przeprowadzono techniką odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR). Pary starterów ZY-252F i ZY-253R oraz ZY1R i ZY2F dały w RT-PCR produkty o oczekiwanej długości czyli odpowiednio 1200bp i 300bp (rys. 2). Produkty te poddano sekwencjonowaniu, a otrzymane sekwencje porównano z sekwencjami zawartymi w banku genów Rys. 2. Produkty RT-PCR ze starterami specyficznymi dla ZYMV M marker pbr322 (AluI); ścieżki 1, 2 startery ZY 252F i ZY 253R; ścieżki 3, 4 startery ZY 252F i ZY 251R; ścieżki 5, 6 startery ZY 1R i ZY 2F Fig. 2. Products of RT-PCR with specific sterters to ZYMV M marker pbr322 (AluI); lines 1, 2 primers ZY 252F i ZY 253R; Lines 3, 4 primers ZY 250F and ZY 251R; lines 5, 6 primers ZY 1R and ZY 2F (GenBank), a także z sekwencją odpowiedniego fragmentu genomu polskiego izolatu ogórkowego wirusa żółtej mozaiki cukinii. Otrzymane wyniki pozwalały zidentyfikować badane izolaty jako ZYMV, przy czym były one genetycznie różne od dotąd opisanych izolatów europejskiego tego wirusa, biorąc pod uwagę dostępne sekwencje izolatów zawartych w GenBank. Z jednej strony potwierdza to dużą różnorodność genetyczną wirusa, a z drugiej strony powstaje pytanie o pochodzenie polskiego cukiniowego izolatu ZYMV. Jeżeli jest to rodzimy izolat ZYMV to powstaje pytanie, jakie gatunki roślin są jego rezerwuarem i na jakiej roślinie mszyce przed nalotem na cukinię naby-

6 Wirus żółtej mozaiki cukini 147 wają wirusa. Jeżeli wykluczymy zawleczenie wirusa z nasionami to jest to istotne pytanie w epidemiologii tego wirusa w Polsce i w poszukiwaniu sposobów ograniczania jego występowania. IV. LITERATURA Chod J., Jakes M The occurrence of zucchini yellow mosaic virus in Czechoslovakia. Ochr. Rostl. 27: Dikova B., Hristova D Detection of squash mosaic virus, zucchini yellow mosaic and cucumber mosaic virus in cucurbit seeds. Bulgar. J. Agri. Scien. 8: Lecoq H., Pitrat M., Clement M Identification et caracterisation d un potyvirus provoquant la maladie du rabougrissement jaune du melon. Agronomia 1: Lisa V., Boceardo G., D agostino G., Dellavalle G., D Aquilio M Characterisation of a potyvirus that cause zucchini yellow mosaic. Phytopathology 71: Pfosser M.F., Baumann H Phylogeny and geographical differentiation of Zucchini yellow mosaic isolates (Potyviridae) based on molecular analysis of the coat protein and part of the cytoplasmic inclusion protein genes. Arch. Virology 143: Pospieszny H., Cajza M., Plewa R First report of Zucchini yellow mosaic virus in Cucumber in Poland. Plant Dis. 87, s Provvidenti R., Gonsalves D., Hymaydan H.S Occurrence of zucchini yellow mosaic virus in cucurbits from Connecticut, New York, Florida and California. Plant Dis. 68: Riedle-Bauer M., Suarez B., Reinprecht M.J Seed transmission and natural reservois of Zucchini yellow mosaic virus in Cucurbita pepo var. styriaca. Zeitschr. Pflanzenkrank. Pflanzenschutz. 109: Swoboda J., Polak J Distribution, variability and overwintering of Zucchini yellow mosaic virus in the Czech Republic. Plant Prot. Sci. 38: Tobias J., Palkovics L Characterization of Hungarian isolates of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, potyvirus) transmitted of Cucurbita pepo var. styriaca. Pest Manag. Sci. 59: Tobias J., Sari L., Kuhlmann H Seed transmission of Zucchini yellow mosaic virus on Cucurbita pepo conv. Citrullinina var styriaca (oilseed Pumpkin). Cucurbit Genet. Cooperat. Report 26: Wisler M.F., Purcifull D.E., Hiebert E Characterization of the P1 protein and coding region of the zucchini yellow mosaic virus. J. Gen. Virol. 76: HENRYK POSPIESZNY, MIECZYSŁAW CAJZA MASSIVE INFECTION OF ZUCCHINI PLANTS GROWING IN THE FIELD BY VIRUSES SUMMARY In 2005 in Kujawsko-Pomorski Region of Poland, on zucchini plants growing in two fields virus infections were observed. On the basis of host range, symptoms, virus morphology and sequences of RT-PCR products the viruses were identified as Zucchini yellow mosaic virus. Studied viruses were genetically different from the most of European isolates of ZYMV. The viruses were not transmitted with seeds and the sources of the virus is not know yet. Key words: zucchini, identification, Zucchini yellow mosaic virus