Wpływ ekstraktu z owoców Sapindus mukorossi na biodegradację halogenowanych związków aromatycznych. mgr inż. Wojciech Smułek

POLITECHNIKA POZNAŃSKA WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ Instytut Technologii i Inżynierii Chemicznej Zakład Chemii Organicznej PRACA DOKTORSKA Wpływ ekstraktu z owoców Sapindus mukorossi na biodegradację halogenowanych związków aromatycznych mgr inż. Promotor: dr hab. inż. Ewa Kaczorek Poznań 2017

Składam wyrazy wdzięczności Pani dr hab. inż. Ewie Kaczorek za ogromną życzliwość i stworzenie wspaniałej atmosfery współpracy oraz za poświęcony czas i cenne uwagi okazane podczas realizacji badań i tworzenia tej pracy 2

Chciałbym gorąco podziękować Panu prof. dr. hab. Andrzejowi Olszanowskiemu oraz Pani dr hab. inż. Agnieszce Zgoła-Grześkowiak za pomoc i wskazówki udzielone podczas realizacji pracy doktorskiej Dziękuję serdecznie Koleżankom mgr inż. Agacie Zdarta i mgr inż. Amandzie Pacholak za okazaną pomoc i wsparcie w czasie realizacji badań Dziękuję Doktorantom i Pracownikom Zakładu Chemii Organicznej i całego Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej za cenne dyskusje, pomoc i życzliwość okazywane każdego dnia 3

SPIS TREŚCI Spis skrótów i oznaczeń 1 7 Wstęp 1 9 I. Część literaturowa 111 1. Halogenowane związki aromatyczne (HZA) 111 1.1. Obszary zastosowań HZA 112 1.2. Wpływ HZA na środowisko naturalne 113 1.3. Usuwanie HZA ze środowiska naturalnego 114 1.4. Biologiczny rozkład HZA 115 1.4.1. Reakcje dehalogenacji 116 1.4.2. Rozszczepienie pierścienia aromatycznego 119 1.4.3. Szlaki biodegradacji HZA 120 2. Biodegradacja wspomagana surfaktantami 123 2.1. Wpływ surfaktantów na procesy biodegradacji 124 2.2. Biodegradacja HZA wspomagana surfaktantami 127 3. Saponiny 129 3.1. Budowa chemiczna i rodzaje saponin 129 3.2. Występowanie saponin w środowisku 131 3.3. Zastosowania saponin 133 3.3.1. Wykorzystanie saponin w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym 133 3.3.2. Wykorzystanie saponin w przemyśle spożywczym i rolnictwie 134 3.3.3. Wykorzystanie saponin w wymywaniu jonów metali i związków arsenu 135 3.3.4. Wykorzystanie saponin w procesach wymywania węglowodorów 137 3.3.5. Wykorzystanie saponin w biodegradacji węglowodorów 138 3.3.6. Inne zastosowania saponin 139 Cel i zakres pracy 140 II. Część eksperymentalna 141 1. Odczynniki i aparatura 141 2. Przygotowanie szkła i roztworów do badań 143 2.1. Materiały do pracy z mikroorganizmami 143 2.2. Przygotowanie wody 143 4

2.3. Medium i suplementy do prowadzenia hodowli 144 3. Izolacja i charakterystyka szczepów bakteryjnych 145 3.1. Izolacja szczepów bakteryjnych 145 3.2. Charakterystyka wody rzecznej 145 3.3. Określenie profilu biochemicznego 146 3.4. Identyfikacja genetyczna i pokrewieństwo filogenetyczne 146 3.5. Określenie profilu kwasów tłuszczowych 147 3.6. Test hemolizy 148 4. Izolacja i charakterystyka ekstraktów roślinnych 148 4.1. Surowce roślinne 148 4.2. Ekstrakcja saponin z surowców roślinnych 148 4.3. Analizy spektroskopowe ekstraktów 149 4.4. Ocena całkowitej zawartości saponin 149 4.5. Wyznaczenie parametrów adsorpcji 150 4.6. Test emulsyfikacji 151 4.7. Skaningowa mikroskopia elektronowa 151 4.8. Toksyczność ekstraktów roślinnych wobec badanych szczepów 151 4.9. Identyfikacja struktury chemicznej saponin 152 5. Biodegradacja halogenowanych związków aromatycznych 153 5.1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego 153 5.2. Biodegradacja 4-halogenowanych fenoli 153 5.3. Biodegradacja izomerów chlorotoluenu 155 6. Właściwości powierzchniowe komórek 156 6.1. Przygotowanie zawiesiny komórek do pomiarów 156 6.2. Mikrobiologiczna adhezja do węglowodorów 157 6.3. Potencjał dzeta 157 6.4. Przepuszczalność wewnętrznej błony komórkowej 158 7. Analiza statystyczna wyników 158 III. Opis i dyskusja wyników 160 1. Charakterystyka szczepów bakteryjnych 160 1.1. Charakterystyka biochemiczna i identyfikacja genetyczna mikroorganizmów 160 1.2. Profil kwasów tłuszczowych 161 1.3. Test hemolizy 163 1.4. Dyskusja wyników 164 5

2. Charakterystyka ekstraktów roślinnych 168 2.1. Efektywność ekstrakcji materiału roślinnego 168 2.2. Analiza spektroskopowa i mikroskopowa ekstraktów 169 2.3. Właściwości powierzchniowo czynne ekstraktów 171 2.4. Właściwości emulgujące ekstraktów 173 2.5. Toksyczność ekstraktów wobec szczepów bakteryjnych 174 2.6. Dyskusja wyników 175 2.7. Wybór ekstraktu do dalszych badań 180 2.8. Identyfikacja saponin obecnych w ekstrakcie z owoców S. mukorossi 181 3. Biodegradacja 4-halogenowanych pochodnych fenolu 185 3.1. Biodegradacja przez czyste kultury bakteryjne 185 3.2. Biodegradacja przez konsorcjum bakteryjne 187 3.3. Dyskusja wyników 190 4. Biodegradacja izomerów chlorotoluenu 195 4.1. Biodegradacja przez czyste kultury bakteryjne 195 4.2. Biodegradacja przez konsorcjum bakteryjne 198 4.3. Dyskusja wyników 100 5. Zmiany właściwości powierzchniowych komórek 103 5.1. Mikrobiologiczna adhezja do węglowodorów 103 5.2. Potencjał dzeta 106 5.3. Przepuszczalność wewnętrznej błony komórkowej 109 5.4. Dyskusja wyników 111 Podsumowanie i wnioski 121 Literatura 125 Dorobek naukowy 148 Streszczenie 152 Abstract 154 Aneks 156 6

SPIS SKRÓTÓW I OZNACZEŃ Oznaczenia i skróty stosowane w tekście pracy Amin minimalna powierzchnia zajmowana przez statystyczną zaadsorbowaną cząsteczkę na nasyconej granicy faz [m 2 ] ASz, BSz współczynniki równania Szyszkowskiego [-] AKW adhezja komórek do węglowodorów [%] BDE-209 eter dekabromodifenylowy C stężenie surfaktantu [mol/dm 3, M] CMC krytyczne stężenie micelizacji DDD 1,1-dichloro-2,2-bis-(4-chlorofenylo)etan DDT 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(4-chlorofenylo)etan EDDS kwas etylenodiamino-n,n-dibursztynowy EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy g przyspieszenie ziemskie: 9,81 [m/s 2 ] HZA halogenowane związki aromatyczne jtk jednostka tworząca kolonię MRM monitorowanie wybranych reakcji fragmantacji (ang. multiple reaction monitoring) Na2EDTA sól sodowa kwasu (etylenodiamino)tetraoctowego OD0 gęstość optyczna zawiesiny komórek w fazie wodnej przy długości fali 600 nm, mierzona przed wytrząsaniem z heksadekanem [-] OD1 gęstość optyczna zawiesiny komórek w fazie wodnej przy długości fali 600 nm, mierzona po wytrząsaniu z heksadekanem [-] OD550 OPNG PBK p.p. R gęstość optyczna zawiesiny komórek w fazie wodnej przy długości fali 550 nm [-] orto-nitrofenylo-β-galaktozyd (ang. orto-nitrophenyl-β-galactoside) przepuszczalność błony komórkowej punkty procentowe uniwersalna stała gazowa: 8,314 [J/(mol K)] R1 R5 RNA SDS T roztwory odczynników wykorzystywane w izolacji kwasów tłuszczowych kwas rybonukleinowy dodecylosiarczan sodu temperatura [K] 7

Oznaczenia i skróty stosowane w tekście pracy c.d. t czas inkubacji próbki [min] WWA wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne nadmiar powierzchniowy na nasyconej granicy faz [mol/m 2 ] γ0 γ Sz Gads ζ napięcie powierzchniowe w układzie woda/powietrze [N/m] napięcie powierzchniowe roztworu surfaktantu o stężeniu c [N/m] energia swobodna adsorpcji [kj/mol] długość fali [nm] potencjał dzeta [mv] γcmc napięcie powierzchniowe przy stężeniu równym CMC [mn/m] Oznaczenia stosowane na wykresach przy prezentacji wyników badań e ekstrakt z owoców Sapindus mukorossi 2-ClT 2-chlorotoluen 2-ClT+e 2-chlorotoluen z ekstraktem z owoców S. mukorossi 3-ClT 3-chlorotoluen 3-ClT+e 3-chlorotoluen z ekstraktem z owoców S. mukorossi 4-ClT 4-chlorotoluen 4-ClT+e 4-chlortoluen z ekstraktem z owoców S. mukorossi BrF 4-bromofenol BrF+e 4-bromofenol z ekstraktem z owoców S. mukorossi ClF 4-chlorofenol ClF+e 4-chlorofenol z ekstraktem z owoców S. mukorossi FF 4-fluorofenol FF+e 4-fluorofenol z ekstraktem z owoców S. mukorossi Oznaczenia szczepów bakteryjnych DA2 Rahnella aquatilis DA2 KW1 Achromobacter sp. KW1 MChB Pseudomonas sp. MChB MChC Microbacterium resistens MChC OS4 Pseudomonas sp. OS4 SA1 Achromobacter sp. SA1 SA2 Raoultella planticola SA2 WS2 Raoultella planticola WS2 8

WSTĘP Ochrona otaczającego nas świata jest jednym z najważniejszych wyzwań stojących dzisiaj przed społeczeństwem. Niezanieczyszczone wody, gleby i powietrze są kluczowe dla zapewnienia wysokiej jakości życia, bezpieczeństwa i dobrej kondycji każdego człowieka. Działania mające na celu zapewnienie czystego środowiska naturalnego prowadzone są w trzech kierunkach. Pierwszym jest wdrażanie nowych technologii i produktów nieszkodliwych dla człowieka i przyrody. Drugim jest utrzymywanie wysokich standardów pracy z toksycznymi i niebezpiecznymi związkami, aby uniknąć ich przedostawania się do otoczenia. Trzeci kierunek stanowią działania mające na celu efektywne usuwanie zaistniałych skażeń środowiska naturalnego. Wśród metod oczyszczania skażonych wód i gleb duże znaczenie mają metody biologiczne. Opierają się one na zdolności części mikroorganizmów do metabolizowania różnych związków chemicznych, co w konsekwencji może prowadzić do ich mineralizacji. Procesy biodegradacji wielu związków organicznych są często długotrwałe. Jednym z czynników ograniczających biodegradację zanieczyszczeń jest ich dostępność dla komórek mikroorganizmów. Węglowodory i ich pochodne wykazują zwykle niską rozpuszczalność w wodzie, adsorbują się na cząstkach gleby, a ich migracja w środowisku jest ograniczona. Stąd tak istotne są metody pozwalające na zwiększenie dostępności biodegradowanych związków dla mikroorganizmów. Należy do nich biodegradacja wspomagana surfaktantami, które znacznie ułatwiają kontakt między komórkami a zanieczyszczeniami. Biodegradacji wspomaganej surfaktantami towarzyszy szereg zjawisk. Należą do nich zmiany we właściwościach powierzchniowych komórek, przepuszczalności błony komórkowej czy potencjału dzeta. Badania nad tymi modyfikacjami zachodzącymi na styku komórki i otaczającego ją środowiska mogą przynieść wiele cennych informacji. Dzięki nim będzie możliwe lepsze zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za biodegradację niebezpiecznych dla środowiska związków chemicznych. Ze względu na zagrożenia, jakie może nieść ze sobą wprowadzenie do środowiska związków powierzchniowo czynnych, w biodegradacji wspomaganej surfaktantami, korzystne może być wykorzystanie surfaktantów pochodzenia naturalnego. W wielu przypadkach pojęcie to utożsamia się z biosurfaktantami definiowanymi jako związki powierzchniowo czynne produkowane przez komórki bakterii i grzybów. Dużo mniejsze zainteresowanie wzbudzają związki produkowane przez rośliny, do których należą saponiny. Badania nad nimi skupiają się zwykle na ich aktywności biologicznej, czyniącej z nich związki atrakcyjne dla przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego. Niemniej prowadzone są również badania, które wykazały korzystny wpływ saponin na biodegradację związków organicznych. Dotyczyły one jednak tylko nielicznych grup 9

związków, takich jak niepodstawione węglowodory alifatyczne. Jak dotąd nie prowadzono badań nad wspomaganiem surfaktantami biodegradacji halogenowanych pochodnych związków aromatycznych, mimo że są związkami wykorzystywanymi w wielu gałęziach przemysłu oraz charakteryzującymi się wysoką toksycznością i stosunkowo niską biodegradowlanością. 10

I. CZĘŚĆ LITERATUROWA 1. Halogenowane związki aromatyczne (HZA) Do halogenowanych związków aromatycznych (HZA) należą związki organiczne posiadające jeden lub więcej pierścieni aromatycznych, podstawione pierwiastkami należącymi do 17 grupy układu okresowego (tzw. halogenów lub fluorowców). Spośród pierwiastków tej grupy najczęściej w HZA są obecne atomy chloru, bromu oraz fluoru, stąd dalsza część pracy będzie traktowała o związkach aromatycznych podstawionych tymi właśnie halogenami. Wśród HZA dominują jednopierścieniowe pochodne benzenu, fenolu czy toluenu. Liczne są również pochodne zawierające kilka pierścieni aromatycznych, głównie w formie nieskondensowanej (izolowanej), jak pochodne eteru difenylowego, bifenylu i in. Ponadto należy wyróżnić pochodne wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, np. naftalenu [1], [2]. Przeważająca część wykorzystywanych w przemyśle HZA to związki syntetyczne, które powstają w wyniku reakcji substytucji lub addycji do pierścienia aromatycznego atomów pierwiastków z grupy halogenów. Z kolei wprowadzenie atomu halogenu do cząsteczki w istotny sposób zmienia właściwości fizykochemiczne związku prowadząc m. in. do zmniejszenia lotności i podwyższenia temperatury wrzenia. Wysoka elektroujemność fluorowców wpływa na wzrost polarności cząsteczek w porównaniu do ich analogów nie zawierających halogenu [3]. Nieznaczne ilości HZA powstają w sposób naturalny w środowisku. Przykładem mikroorganizmów zdolnych do syntezy związków chloroaromatycznych (jak np. monoi dichloropochodne alkoholu i aldehydu 4-metoksybenzoesowego) są grzyby z rodzaju Bjerkandera wzrastające na martwej tkance drzewnej [4]. Wankomycyna, szeroko stosowany antybiotyk, syntezowany przez bakterię glebową Amycolatopsis orientalis, również zawiera pierścień aromatyczny podstawiony atomem chloru [5]. Niektóre organizmy morskie produkują związki bromoaromatyczne, jak np. dibromoindygo, główny składnik tzw. purpury królewskiej, wytwarzanej przez ślimaki morskie z rodzin Muricidae i Thaisidae [6]. Związki fluoroaromatyczne pochodzenia naturalnego są rzadko spotykane, jednak Aldemir i in. [7] zidentyfikowali szczep z rodzaju Streptomyces wytwarzający jako wtórny metabolit kwas 3-(3,5-di-tert-butylo-4-fluorofenylo)propanowy. HZA mogą również powstawać w środowisku w wyniku niekontrolowanych reakcji związków aromatycznych z czynnikami halogenującymi, jak np. chlor i chlorany, które są wprowadzane do wody celem jej dezynfekcji [8]. Również ozonowanie wody może prowadzić do powstawania z jonów bromkowych, obecnych w wodzie, reaktywnych form bromu. Mogą one reagować ze związkami aromatycznymi obecnymi w wodzie jako zanieczyszczenie 11

naturalne (materia organiczna) lub antropogeniczne [9]. Także spalanie odpadów zawierających węglowodory aromatyczne i związki chloru prowadzić może do tworzenia się HZA i ich emisji do atmosfery [10]. 1.1. Obszary zastosowań HZA Różnorodność halogenowanych związków aromatycznych wiąże się z ich szerokim wykorzystaniem w wielu gałęziach przemysłu, począwszy od przemysłu farmaceutycznego po metalurgiczny (rysunek I.1.). Rysunek I.1. Główne obszary zastosowań halogenowanych związków aromatycznych; opracowanie własne, źródła ilustracji [11], [12] Chlorotoluen, chloronaftalen i chlorobenzen są stosowane jako rozpuszczalniki i substraty w produkcji pestycydów, barwników i środków dezynfekujących. Światowa produkcja samych izomerów chlorotoluenu osiągnęła w 2000 r. 130 tys. ton, z czego połowę wykorzystywano w postaci mieszaniny wszystkich trzech izomerów [13], a w 2016 roku ich produkcja na świecie szacowana była na ponad 300 tys. ton [14]. 2-chlorotoluen oraz 4-chlorotoluen są prekursorami w syntezie substancji czynnych leków, pigmentów i środków czyszczących [3]. Związkiem chloroaromatycznym jest także powszechnie znany insektycyd dichlorodifenylotrichloroetan (DDT) [16]. Chlorowane pochodne fenolu są wykorzystywane jako biocydy, np. w środkach konserwacji drewna. Halogenowane kwasy fenoksyoctowe, jak kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy lub kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy, to substancje 12

czynne w herbicydach [1], [3], [15]. Ponadto szereg związków aromatycznych podstawionych atomem chloru stosowanych jest jako antybiotyki czy leki działające na układ nerwowy [17]. Bromowane pochodne bisfenylu i eteru difenylowego to szeroko stosowane substancje zmniejszające palność gotowych wyrobów, takich jak tkaniny, farby czy tworzywa sztuczne. Ich zawartość w gotowym produkcie może sięgać nawet 20%, a ich sprzedaż pod koniec XX w. osiągnęła poziom ponad 200 tys. ton i stale rośnie [18]. Bromowane pochodne fenolu są również wykorzystywane jako dodatki zmniejszające palność tworzyw sztucznych, a ponadto jako środki do konserwacji drewna [19]. Największa spośród wszystkich pierwiastków elektroujemność fluoru przyczynia się do silnego spolaryzowania cząsteczek związków fluoroaromatycznych. Stąd charakteryzują się one bardzo dobrą rozpuszczalnością w rozpuszczalnikach fluorofilnych oraz tlenku węgla(iv) w stanie nadkrytycznym. Dzięki temu znajdują one zastosowanie jako ligandy i katalizatory w syntezie organicznej [20]. Fluorowane pochodne związków aromatycznych odgrywają istotną rolę w tworzeniu ochronnych hydrofobowych powłok na powierzchni tkanin, drewna i papieru [1], [21]. Różnorodne leki, jak np. cyprofloksacyna, ofloksacyna i norfloksacyna, również zawierają w swojej cząsteczce pierścień aromatyczny postawiony atomem fluoru [22]. 1.2. Wpływ HZA na środowisko naturalne Wysoka aktywność biologiczna związków halogenoorganicznych przyczynia się do ich bardzo silnego oddziaływania na mikro- i makroorganizmy obecne w środowisku naturalnym. Przyjmuje się, że wzrost ilości atomów halogenu w cząsteczce zwiększa toksyczność związku, jednak innym istotnym parametrem jest wzajemne ułożenie podstawników [23]. Halogenowe pochodne benzenu i toluenu wykazują znaczną sorpcję na cząstkach gleby i osadach zbiorników wodnych, a ich nieznaczny rozkład biologiczny sprzyja akumulacji. Jednocześnie HZA mogą mieć toksyczny wpływ na mikroorganizmy obecne w środowisku [24]. Szkodliwym oddziaływaniem na środowisko i obecne w nim makro- i mikroorganizmy charakteryzują się również HZA stosowane jako leki [17] oraz pestycydy [16], [25]. W przypadku zwierząt, po wniknięciu do organizmu, HZA przyczyniają się do uszkodzenia nerek, wątroby i układu nerwowego. Powodują podrażnienia skóry, oczu i błon śluzowych. Kontakt z izomerami chlorotoluenu prowadzi do osłabienia organizmu, zaburzeń oddychania i koncentracji [3]. Wysoką szkodliwość względem organizmów żywych wykazują również polichlorowane bifenyle, które m.in. uszkadzają komórki nerwowe [26]. Cześć z HZA zaburzać może także gospodarkę hormonalną organizmów zwierzęcych [27]. Związki zawierające wiele atomów chloru, jak heksachlorobenzen są również kancerogenne. Podobny efekt ma kontakt z halogenowanymi wielopierścieniowymi węglowodorami aromatycznymi (WWA), przy czym wykazują one silniejsze oddziaływanie na komórki niż w przypadku WWA nie posiadających 13

podstawników należących do grupy fluorowców [28], [29]. Do trwałych zanieczyszczeń organicznych (ang. persistent organic pollutants) zalicza się także halogenowane pochodne fenolu [30]. Podobnie jak wiele innych związków organicznych łatwo się rozpuszczają w tłuszczach, ulegając akumulacji w tkance tłuszczowej i modyfikując strukturę błony fosfolipidowej komórek [31], [32]. Opisane powyżej negatywne oddziaływanie HZA na organizmy żywe jest przyczyną bardzo restrykcyjnych wytycznych dotyczących przechowywania, użycia i transportu tej grupy związków. Jednym z takich międzynarodowych rozporządzeń jest tzw. Konwencja Sztokholmska [33]. 1.3. Usuwanie HZA ze środowiska naturalnego Liczne zagrożenia, jakie niesie ze sobą obecność w środowisku HZA, przyczyniły się do opracowania szeregu metod, mających na celu usunięcie tych związków z gleby, wód powierzchniowych i ściekowych. Do usuwania zanieczyszczeń organicznych stosowane są techniki tzw. pogłębionego utleniania (ang. advanced oxidation processes), które są oparte na reakcji zanieczyszczeń z rodnikiem hydroksylowym, generowanym w środowisku reakcji. W tym celu stosuje się czynniki generujące wolne rodniki, takie jak ozon, promieniowanie nafioletowe czy nadtlenek wodoru [34]. Należy się jednak wówczas liczyć z możliwością powstawania produktów utleniania o nieznanej aktywności biologicznej. Alimoradzadeh i in. [35] uzyskali znaczną wydajność procesu utleniania 4-chlorofenolu w roztworze H2O2 pod wpływem promieniowania nadfioletowego w obecności NiO, jako katalizatora. Makgato i in. [36] wykorzystywali utlenianie H2O2 w fotoreaktorze jako pierwszy etap oczyszczania wód zanieczyszczonych 4-chlorotoluenem. Z kolei Sun i in. [37] badali utlenianie 4-chlorotoluenu w reaktorze plazmowym, uzyskując wśród produktów reakcji kwas 4-chlorobenzoesowy. Utlenianie może być także prowadzone z wykorzystaniem enzymów, np. chloroperoksydaz [38] lub monooksygenaz zawierających grupę flawinową [39]. Inne metody usuwania HZA ze środowiska oparte są na mechanizmach adsorpcji tych związków na węglu aktywnym, żywicach syntetycznych lub innych sorbentach. Skuteczność technik adsorpcyjnych jest ograniczona właściwościami fizykochemicznymi sorbentów, takimi jak ich stabilność termiczna, powierzchnia aktywna i selektywność [40]. Przykładem stosowania tych technik w usuwaniu HZA są badania Springman i in. [41], w których pentachlorofenol był adsorbowany na modyfikowanej krzemionce. Z kolei Ninković i in. [42] wykorzystywali węgiel aktywny do usuwania chloroorganicznych pestycydów z wód ściekowych. Desorpcja termiczna, np. parą wodną, jest także stosowana do usuwania trwałych zanieczyszczeń organicznych, jednak wysokie koszty metody ograniczają jej wykorzystanie do zanieczyszczeń trwałych o niewielkiej lotności i wolno biodegradowanych [43], [44]. Ponadto 14

oczyszczanie gleby skażonej zanieczyszczeniami węglowodorowymi prowadzi się poprzez jej przemywanie roztworami surfaktantów [45]. Do metod oczyszczania wód ściekowych, pozwalających na usunięcie z nich związków organicznych, należą także techniki membranowe, głównie mikro- i nanofiltracja [46], [47]. Często membrana stanowi element bioreaktora membranowego, gdzie jednocześnie zatęża się zanieczyszczenia i prowadzi ich biologiczny rozkład [48]. Wśród metod usuwania trwałych zanieczyszczeń HZA szczególny nacisk kładzie się na rozwój metod biologicznych, wykorzystując procesy biodegradacji tych związków przez mikroorganizmy. Zostaną one szerzej opisane w kolejnym rozdziale. 1.4. Biologiczny rozkład HZA Biodegradacja jest procesem szczególnie korzystnym w usuwaniu halogenowanych związków aromatycznych. Wykorzystanie biodegradacji prowadzi nie tylko do usunięcia szkodliwych substancji ze środowiska, ale pozwala również przekształcić je w związki nietoksyczne lub całkowicie je zmineralizować do związków nieorganicznych [15]. Metody biologiczne obejmują przede wszystkim rozkład zanieczyszczeń przez mikroorganizmy, choć prowadzono również badania nad wykorzystaniem fitoremediacji w usuwaniu chlorowych pochodnych benzenu [49]. Część naturalnie występujących mikroorganizmów jest zdolna do degradacji trwałych zanieczyszczeń organicznych, jednak zwykle ich ilość w środowisku jest stosunkowo niewielka w porównaniu do innych mikroorganizmów. Występują one w glebach i wodach wszystkich stref klimatycznych. Spośród bakterii biodegradację HZA prowadzą m.in. wybrane szczepy z rodzajów Pseudomonas [50], [51], Burkholderia [51], [52], Alcaligenes [53], Achromobacter [54], Rhodococcus [13], [55] i Raoultella [56]. Do problemów związanych z wykorzystaniem procesów biodegradacji należą stosunkowo długi czas ich trwania i ograniczenia wynikające z wrażliwości mikroorganizmów na czynniki środowiskowe, takie jak temperatura czy ph. Parametry środowiskowe, podobnie jak sorpcja związków organicznych na cząstkach gleby lub osadach dennych, są istotnymi czynnikami limitującymi procesy biodegradacji [57], [58]. Różnorodność czynników wpływających na biodegradację HZA została przedstawiona na rysunku I.2. Głównym kryterium podziału metod biologicznego rozkładu zanieczyszczań jest dostępność tlenu, która pozwala wyróżnić biodegradację beztlenową (anaerobową) oraz tlenową (aerobową). W warunkach beztlenowych biodegradacja zachodzi głównie w osadach dennych zbiorników wodnych i niżej położonych warstwach gleby. Biodegradacja prowadzona przez mikroorganizmy beztlenowe zachodzi zwykle z mniejszą wydajnością niż biodegradacja w warunkach tlenowych [2], [59]. Ze względu na charakter badań prowadzonych w ramach 15

niniejszej pracy, w kolejnych rozdziałach uwaga będzie skupiona głównie na bakteryjnej biodegradacji zachodzącej w warunkach tlenowych. Rysunek I.2. Główne czynniki wpływające na efektywność procesu biodegradacji halogenowanych związków aromatycznych (HZA) przez komórki mikroorganizmów; opracowanie własne na podstawie [15], [60], [61] 1.4.1. Reakcje dehalogenacji Wiele szczepów bakteryjnych (np. z rodzajów Burkholderia i Sphingomonas) rozpoczyna biodegradację HZA od przeprowadzenia ich dehalogenacji, czyli usunięcia z cząsteczki związku atomu halogenu [54]. W zależności od obecności tlenu w środowisku biodegradacji, jej poszczególne etapy przebiegają w różny sposób. W warunkach beztlenowych w miejsce halogenu przyłączany jest atom wodoru, a wśród ostatecznych produktów biodegradacji znajdują się wolna cząsteczka halogenu lub halogenowodór oraz metan. Podczas biodegradacji w warunkach tlenowych atom halogenu jest wymieniany na grupę hydroksylową, a w wyniku mineralizacji (rozumienej jako biodegradacja zakończona utworzeniem związków nieorganicznych) powstają tlenek węgla(iv), woda i jony halogenkowe (np. chlorkowe) [50], [62]. 16

Dehalogenacja jest reakcją, która w konsekwencji znacznie ułatwia dalszą biodegradację i zmniejsza ryzyko powstawania toksycznych (dla samych mikroorganizmów oraz innych organizmów obecnych w środowisku) półproduktów na jej dalszych etapach. Co więcej, jej produkty pozbawione atomów halogenów mogą być biodegradowane przez większą ilość mikroorganizmów [63], [64]. Za katalizę reakcji odłączenia halogenu odpowiadają enzymy określane jako dehalogenazy należące do kilku klas enzymów, co wiąże się z różnymi mechanizmami dehalogenacji prowadzonej przez mikroorganizmy środowiskowe [60]. Podczas dehalogenacji hydrolitycznej atom halogenu (np. chloru) jest zastępowany nukleofilem w reakcji z cząsteczką wody. W rezultacie powstają halogenowodór i alkohol (rysunek I.3). Ten mechanizm występuje m. in. podczas biodegradacji kwasu 4-chlorobenzoesowego przez szczepy z rodzaju Nocardia [60]. Cząsteczka wody bierze również udział w dehalogenacji kwasu 3-chloroakrylowego, według mechanizmu zaproponowanego przez van Hylckama Vlieg i in. [65]. W tym przypadku cząsteczka wody jest przyłączana do podwójnego wiązania, z którym sąsiaduje atom chloru. Jako jeden z produktów powstaje chlorowodór (rysunek I.4). Innym typem dehalogenacji, w której także uczestniczy cząsteczka wody, jest dehalogenacja tiolityczna. Reakcja jest katalizowana przez enzym (np. S-transferazę glutationową), a powstający produkt pośredni zawiera wiązanie węgielsiarka. Mechanizm ten znany jest z utleniania dichlorometanu do formaldehydu przez szczepy Methylofilus sp. lub Hyphomicrobium sp. (rysunek I.5) [66]. Rysunek I.3. Ogólna postać reakcji dehalogenacji hydrolitycznej wg [60]; R 1, R 2 i R 3 oznaczają podstawniki alkilowe, arylowe lub atom wodoru Rysunek I.4. Dehalogenacja kwasu 3-chloroakrylowego wg [65] Rysunek I.5. Dehalogenacja tiolityczna dichlorometanu katalizowana przez S-transferazę glutationową wg [60] 17

Dehalogenacja może zachodzić również poprzez substytucję wewnątrzcząsteczkową. Dochodzi podczas niej do reakcji, w której bierze udział atom halogenu i sąsiadująca z nim w cząsteczce grupa hydroksylowa. Wymagana jest przy tym obecność dehalogenazy haloalkoholowej produkowanej np. przez Arthrobacter sp. Produktem reakcji jest związek zawierający grupę epoksydową (rysunek I.6) [65]. Z kolei podczas dehydrohalogenacji zachodzi eliminacja cząsteczki halogenowodoru, np. chlorowodoru, z utworzeniem wiązania podwójnego. Proces ten, katalizowany przez dehydrohalogenazy, był obserwowany m. in. podczas pierwszych etapów degradacji 1,2,3,4,5,6-heksachlorocykloheksanu (lindanu) przez Pseudomonas paucimobilis (rysunek I.7) [67]. Rysunek I.6. Dehalogenacja 1,3-dichloropropan-2-olu wg [65] Jedną z reakcji najczęściej występujących podczas biodegradacji HZA jest tzw. dehalogenacja utleniająca [54], [60]. Polega ona na przyłączeniu do dehalogenowanego związku atomów tlenu. Reakcję tę katalizują monooksygenazy lub dioksygenazy. Miejsce halogenu zajmuje wówczas grupa hydroksylowa. Ten mechanizm występuje m. in. podczas degradacji kwasu 4-chlorofenylooctowego (rysunek I.8) [60]. Wyróżnia się także tzw. dehalogenację redukcyjną. Atom halogenu jest wtedy podstawiany atomem wodoru. Może ona zachodzić zarówno w warunkach tlenowych (rysunek I.9) jak i beztlenowych, kiedy następuje tzw. halorespiracja, która jest obserwowana np. u Dehalococcoides ethenogenes (rysunek I.10) [68]. Rysunek I.7. Początkowe etapy degradacji lindanu, które są reakcjami dehydrohalogenacji wg [67] Rysunek I.8. Dehalogenacja utleniająca kwasu 4-chlorofenylooctowego wg [60] 18

Rysunek I.9. Dehalogenacja redukcyjna w warunkach tlenowych dla kwasu 2-chloromaleinooctowego wg [68] Rysunek I.10. Dehalogenacja redukcyjna tetrachloroetenu (TCE) w warunkach beztlenowych wg [60] 1.4.2. Rozszczepienie pierścienia aromatycznego Obok dehalogenacji jednym z kluczowych etapów biodegradacji HZA jest rozszczepienie pierścienia aromatycznego i ostatecznie powstanie związków acyklicznych, które mogą być włączone w cykl kwasu cytrynowego. Centralnymi półproduktami tlenowej biodegradacji HZA są pochodne benzeno-1,2-diolu (katecholu). Zanim dojdzie do rozszczepienia pierścienia, większość związków aromatycznych ulega przekształceniu w katechol lub kwas protokatechowy. Jeśli etap dehalogenacji poprzedzony jest rozszczepieniem pierścienia, wówczas produktami pośrednimi biodegradacji HZA są pochodne katecholu, zawierające atom halogenu [50], [62]. Pierścień ulega rozszczepieniu dzięki katalitycznemu działaniu enzymów z grupy dioksygenaz, które pozwalają na przyłączenie cząsteczki tlenu. Najczęściej spotykane są dwa różne szlaki metaboliczne różniące się miejscem rozerwania pierścienia typu orto i typu meta [69]. Rozszczepienie typu orto (intradiolowe) zachodzi między dwoma sąsiednimi atomami węgla, do których przyłączone są grupy hydroksylowe. Kiedy wyjściowym związkiem jest katechol, w obecności 1,2-dioksygenazy katecholowej powstaje dikarboksylowy kwas cis,cis-mukonowy (rysunek I.11.). Rozszczepienie pierścienia aromatycznego w cząsteczce kwasu protokatechowego zachodzi przy udziale 3,4-dioksygenazy protokatechowej i prowadzi do powstania kwasu 3-karboksy-cis,cis-mukonowego. W obu przypadkach dalsza biodegradacja przebiega w kierunku utworzenia kwasu 3-ketoadypinowego, którego produkty rozkładu są włączane w cykl kwasu cytrynowego [50], [70]. Rozszczepienie typu meta (ekstradiolowe) zachodzi między dwoma atomami węgla, w pozycji α względem ugrupowania diolowego. W reakcji katalizowanej przez 2,3-dioksygenazę katecholową z katecholu powstaje semialdehyd kwasu 2-hydroksymukonowego (rysunek I.12), a w przypadku rozszczepienia 19

kwasu protokatechowego, które zachodzi w obecności 4,5-dioksygenazy protokatechowej, również powstaje odpowiedni semialdehyd będący pochodną kwasu mukonowego. Dalsze reakcje biodegradacji prowadzą do powstania cząsteczek włączanych następnie w cykl kwasu cytrynowego komórki [50], [70]. Rysunek I.11. Rozszczepienie pierścienia aromatycznego typu orto [69] Rysunek I.12. Rozszczepienie pierścienia aromatycznego typu meta [69] 1.4.3. Szlaki biodegradacji HZA Różnorodność mikroorganizmów biodegradujących HZA wiąże się ze zróżnicowaniem szlaków biodegradacji tych związków. Można wskazać jednak główne strategie, jakie wykorzystują mikroorganizmy, aby przeprowadzić mineralizację HZA. Haigler i Spain badali biodegradację 4-chlorotoluenenu przez szczep Pseudomonas sp. JS6 [71]. Na podstawie analizy produktów pośrednich, zaproponowali szlak metaboliczny (rysunek I.13.), w którym pierwszy etap obejmuje utlenienie do 3-chloro-6-metylokatecholu, a następnie rozszczepienie pierścienia typu orto. Dopiero wtedy następuje dehalogenacja powstałego nienasyconego kwasu dikarboksylowego, który jest dalej utleniany, a jednym z produktów pośrednich jest kwas 2-metylomaleinooctowy. Z kolei Brinkmann i in. [72] przedstawili szlak degradacji 4-chlorotoluenu, który rozpoczyna się od utlenienia podstawnika alkilowego (rysunek I.14.). Dopiero po jego zastąpieniu grupą hydroksylową powstaje odpowiedni chlorokatechol, którego pierścień aromatyczny ulega następnie rozszczepieniu [72]. Analogiczny szlak metaboliczny zaproponowali Lehning i in. dla biodegradacji 2-chlorotoluenu i 3-chlorotoluenu przez szczepy Pseudomonas putida F1 i Burkholderia sp. PS12 [52]. Z kolei badania nad biodegradacją 4-chlorofenolu, przeprowadzone przez Nordin i in. [73], wskazały na dwa główne szlaki metaboliczne, których cechą wspólną jest dehalogenacja poprzedzająca rozszczepienie pierścienia aromatycznego typu orto (rysunek I.15). W rezultacie powstaje kwas maleinooctowy, którego produkty utleniania mogą być włączone do cyklu kwasu cytrynowego [73]. 20

Rysunek I.13. Szlak biodegradacji 4-chlorotoluenu (przez szczep Pseudomonas sp. JS6) zaproponowany przez Haigler i Spain [71] Rysunek I.14. Szlak biodegradacji 4-chlorotoluenu (przez szczep z rodzaju Pseudomonas) zaproponowany przez Brinkmann i in. [72] Rysunek I.16 przedstawia pierwsze etapy biodegradacji 4-fluorofenolu przez szczep Arthrobacter sp. IF1. Ferreira i in. zidentyfikowali hydrochinon oraz kwas maleinooctowy jako główne produkty pośrednie procesu. Jako produkty uboczne, powstają fluorowodór i jony fluorkowe, które mogą wykazywać znaczną toksyczność wobec mikro- i makroorganizmów środowiskowych [74]. 21

Rysunek I.15. Schemat szlaków biodegradacji 4-chlorofenolu (przez Arthrobacter chlorophenolicus A6) przedstawiony przez Nordin i in. [73] Rysunek I.16. Biodegracja 4-fluorofenolu (przez szczep Arthrobacter sp. IF1) wg [74] Na rysunku I.17 przedstawiono, zaproponowane przez Chaudhry i Chapalamadugu [54], szlaki degradacji (przez szczep Pseudomonas sp. B13) czterech często stosowanych w przemyśle HZA: 4-chloro-2-nitrofenolu, 2-chlorofenolu, 4-chlorofenolu oraz kwasu 3-chlorobenzoesowego. We wszystkich przypadkach dehalogenacja następuje po rozszczepieniu pierścienia aromatycznego a wspólnym produktem pośrednim jest, podobnie jak w innych opisywanych wyżej przykładach, kwas maleinooctowy. 22

Rysunek I.17. Szlaki degradacji wybranych HZA (przez Pseudomonas sp. B13) wg [54] Szlaki degradacji HZA są złożone i wieloetapowe. Analizując efektywność biodegradacji tych związków, poza oceną szybkości poszczególnych reakcji enzymatycznych składających się na proces biodegradacji, należy jednak mieć na uwadze także ograniczenia wynikające z niewielkiej dostępności zanieczyszczeń dla biodegradujących je mikroorganizmów. 2. Biodegradacja wspomagana surfaktantami Niezależnie od wykorzystywanego przez bakterie szlaku metabolicznego, jednym z głównych czynników ograniczających szybkość biodegradacji, jest biodostępność zanieczyszczeń dla komórek biodegradujących je mikroorganizmów. W obszarze ochrony środowiska biodostępność jest rozumiana jako ilość związku chemicznego, będącego zanieczyszczeniem, która może być przez mikroorganizmy pobrana i poddana biodegradacji. Jeśli więc w danych warunkach biodostępność związku jest wysoka, to jego biodegradacja jest limitowana tylko szybkością reakcji chemicznych składających się na szlak biodegradacji [75]. Ważną cechą trwałych zanieczyszczeń organicznych, w tym HZA, z punktu widzenia efektywności ich biodegradacji, jest ich ograniczona biodostępność [76]. Związki te, często mające charakter hydrofobowy, wykazują duże powinowactwo do cząstek stałych gleby, 23

osadów, czy martwej materii organicznej, a ponadto ich rozpuszczalność w wodzie jest względnie niewielka [77]. Z kolei funkcjonowanie komórek mikroorganizmów jest w znacznym stopniu uzależnione od środowiska wodnego [78]. Jedną z cech adaptacyjnych mikroorganizmów, biodegradujących związki o charakterze hydrofobowym, może być produkcja przez nie związków powierzchniowo czynnych biosurfaktantów [79], [80]. Są to substancje zewnątrzkomórkowe, należące głównie do grup glikolipidów i lipopeptydów. Ilość syntezowanych biosurfaktantów jest jednak niewielka, a tylko niektóre szczepy są zdolne do ich produkcji [81], [82]. Niemniej, wzorując się na tych naturalnych procesach zwiększania biodostępności przez mikroorganizmy, możliwe jest wprowadzanie do układu biodegradacyjnego surfaktantów z innych źródeł [83]. 2.1. Wpływ surfaktantów na procesy biodegradacji Obecność surfaktantów w środowisku, w którym odbywa się biodegradacja zanieczyszczeń przez mikroorganizmy, przyczynia się do istotnej zmiany oddziaływań między komórkami a związkami przez nie degradowanymi [84], [85]. Pierwsza grupa zjawisk ma charakter fizykochemiczny, obejmujący procesy zachodzące na granicy faz, m.in. na powierzchni komórek czy kropel emulsji w roztworze. Druga grupa obejmuje zmiany w funkcjonowaniu komórek, ich metabolizmie i budowie warstw zewnętrznych, indukowane przez surfaktanty [86]. Głównym procesem zachodzącym w środowisku wodnym, do którego zostały wprowadzone surfaktanty, jest tworzenie się emulsji. Związki powierzchniowo czynne pozwalają na rozproszenie w roztworze wodnym substancji słabo lub praktycznie nie mieszających się z fazą wodną [87]. Wielokrotnie rośnie wówczas międzyfazowa powierzchnia wymiany masy, co przekłada się na zwiększenie przenikania cząsteczek związku organicznego do roztworu i tym samym następuje zwiększenie dostępności biodegradowanych związków dla komórek [86]. Jednocześnie zmniejszenie napięcia międzyfazowego pozwala na zwiększoną penetrację materiałów porowatych (np. gleby, osadów dennych) przez fazę wodną. Towarzyszy jej odłączanie się od matrycy cząstek zanieczyszczenia i ich rozproszenie w roztworze [88]. Zwiększona desorpcja zanieczyszczeń z powierzchni stałych ma istotne znaczenie szczególnie podczas bioremediacji gruntów [89], [90]. Tworzenie przez surfaktant micel i zamykanie w nich zanieczyszczeń może mieć charakter ambiwalentny. Z jednej strony obserwowany jest wówczas łatwiejszy transport cząstek zanieczyszczenia w roztworze wodnym do komórek mikroorganizmów [90], co przyczynia się do zwiększenia biodostępności [88], [89]. Możliwe jest również bezpośrednie pobieranie przez komórki biodegradowanego związku z micel [91]. Z drugiej strony może dojść do długotrwałego zamknięcia biodegradowanej substancji w micelach. Wówczas jej 24

przenikanie do komórek jest znacznie ograniczone, szczególnie wówczas, kiedy dochodzi do łączenia się micel i wzrostu ich masy, co wiąże się ze wzrostem szybkości sedymentacji [92], [93]. Ponadto surfaktant, adsorbując się na powierzchni międzyfazowej, może utrudnić dostęp komórek do hydrofobowego substratu [94]. Innym niekorzystnym zjawiskiem jest tworzenie się piany na powierzchni układu, np. zbiornika wodnego, w którym zachodzi biodegradacja. Jej obecność może w istotnym stopniu ograniczyć wymianę gazów między fazą wodną a otaczającym powietrzem. Zmniejsza się wówczas ilość wnikającego do roztworu tlenu i uwalnianego z niego tlenku węgla(iv) [95], [96]. Omawiając procesy zachodzące w ekosystemie (na poziomie mikrobiologicznym) pod wpływem surfaktantów należy zwrócić również uwagę na modyfikację powierzchni komórek. Kontakt ze związkami powierzchniowo czynnymi może skutkować zmianami w budowie ściany komórkowej, czy charakterze uwalnianych substancji zewnątrzkomórkowych. Wpływ na wymienione cechy komórki jest uwarunkowany również rodzajem przyswajanego źródła węgla i czynnikami środowiskowymi, takimi jak temperatura i ph [97]. Modyfikacje właściwości powierzchniowych komórek mogą być określane ilościowo np. poprzez pomiary mikrobiologicznej adhezji komórek do węglowodorów (AKW) czy potencjału dzeta. Mikrobiologiczna adhezja do węglowodorów, określana również jako hydrofobowość powierzchni komórek (ang. cell surface hydrophobicity), opisuje skłonność komórek do przylegania do powierzchni międzyfazowej o charakterze hydrofobowym, np. kropel emulsji [98]. Dzięki zwiększeniu hydrofobowości swojej powierzchni, co następuje poprzez przebudowę zewnętrznych warstw komórki, mikroorganizmy mogą adsorbować się na powierzchni zanieczyszczeń organicznych. Także cząsteczki biodegradowalnego zanieczyszczenia mają większą skłonność do przylegania do ściany komórkowej [99]. Potencjał dzeta opisuje skłonność cząstek stałych lub kropel emulsji, obecnych w układzie koloidalnym, do sedymentacji i agregacji. Im wyższa bezwzględna wartość potencjału dzeta tym stabilniejszy jest układ, np. zawiesina komórek bakteryjnych [100]. Wartość potencjału dzeta stanowi wypadkową oddziaływań między grupami funkcyjnymi zewnętrznych warstw komórki a substancjami obecnymi w otaczającym ją środowisku [101]. Stabilność układu, w którym zachodzi biodegradacja, jest kluczowa dla zachowania wysokiej szybkości wymiany masy miedzy komórkami, roztworem a biodegradowanym związkiem. Zmiany właściwości powierzchniowych komórek mogą wskazywać na wzrost lub zmniejszenie powinowactwa komórek do biodegradowanych związków w obecności surfaktantów [102]. Surfaktanty silnie oddziałują na fosfolipidową błonę komórek. Zmiany przepuszczalności błony komórkowej w obecności związków powierzchniowo czynnych są związane z wnikaniem w nią cząsteczek surfaktantu [103]. Może to przyczyniać się do 25

niekontrolowanego uwalniania z komórki małocząsteczkowych metabolitów, jonów czy cząsteczek gazów. Dotyczy to także cząsteczek biodegradownych substancji [83]. Oddziaływanie surfaktantów na błonę komórkową to także jeden z czynników warunkujących toksyczne działanie związków powierzchniowo czynnych na mikroorganizmy [104]. Wraz ze wzrostem przepuszczalności mogą wnikać do wnętrza komórki związki małocząsteczkowe zaburzając jej metabolizm. Z drugiej strony przez upłynnioną błonę mogą wydostawać się z komórki istotne dla niej enzymy czy substancje zapasowe [103]. Toksyczność surfaktantów i ich niekorzystny wpływ na środowisko jest głównym czynnikiem ograniczającym ich stosowanie w technologiach oczyszczania środowiska [105]. Związki powierzchniowo czynne wykazują znaczą aktywność biologiczną, mogą łączyć się z cząsteczkami takimi jak np. kwas deoksyrybonukleinowy, enzymy, zmieniając ich właściwości i uniemożliwiając im pełnienie ich funkcji w komórkach [106]. Wiele spośród stosowanych powszechnie surfaktantów jest stosunkowo trudno biodegradowalnych, a wykorzystywane metody oczyszczania ścieków często nie są wobec nich skuteczne. W rezultacie akumulują się one w środowisku, stwarzając zagrożenie dla obecnych w nim makro- i mikro-organizmów [107]. Rozpatrując biodegradację zanieczyszczeń wspomaganą związkami powierzchniowo czynnymi nie może być ten aspekt pomijany. Dodawany do układu biodegradacyjnego surfaktant nie może stać się obciążeniem dla środowiska i powinien być w nim rozkładany odpowiedni szybko [105]. Należy przy tym zwrócić uwagę, że dany surfaktant może stać się atrakcyjnym źródłem węgla dla mikroorganizmów, które będą go wykorzystywać w pierwszej kolejności, rezygnując z rozkładu trudnodostępnych zanieczyszczeń [87]. Wówczas surfaktant nie spełni swojej funkcji, jako emulgator związków hydrofobowych, czy związek zwiększający ich desorpcję z gleby. W całościowym bilansie niekoniecznie musi to się wiązać z zmniejszeniem wydajności procesu biodegradacji zanieczyszczeń. Dzięki dodanemu surfaktantowi mikroorganizmy mogą się namnożyć, a następnie większa ilość biomasy szybciej będzie mogła przeprowadzić biodegradację trudniej dostępnych związków [105]. Biorąc pod uwagę wszystkie korzystne i niekorzystne zjawiska towarzyszące biodegradacji wspomaganej surfaktantami, stosowane powinny być w niej związki nietoksyczne, stosunkowo łatwo biodegradowalne [108]. Wymogi te spełnia wiele surfaktantów pochodzenia naturalnego, np. wspomniane już biosurfaktanty, produkowane przez niektóre mikroorganizmy. Ich produkcja jest jednak kosztowna i wieloetapowa oraz charakteryzuje się niską wydajnością [81], [109]. Korzystniejszym rozwiązaniem, z punktu widzenia technologii i kosztów, mogą być surfaktanty pochodzenia roślinnego, do których należą między innymi saponiny [110], które zostaną szerzej omówione w rozdziale 3. 26

2.2. Biodegradacja HZA wspomagana surfaktantami Spośród licznych badań poświęconych biodegradacji halogenowanych związków aromatycznych (HZA), stosunkowo niewiele z nich poświęconych jest biologicznemu rozkładowi tej grupy związków wspomaganemu surfaktantami. Berselli i in. [111] prowadzili bioremediację gleby skażonej mieszaniną związków chloroaromatycznych, m.in. polichorowanych pochodnych benzenu i aniliny, badając rolę w procesie związków humusowych, cyklodekstryn, Tritonu X-100 oraz ramnolipidów. Surfaktanty kilkukrotnie zwiększyły wymywanie zanieczyszczeń z gleby, jednak nie zaobserwowano w ich obecności różnic w szybkości biodegradacji polichorowanych pochodnych benzenu i aniliny przez autochtoniczne mikroorganizmy glebowe. Biodegradacja chlorobenzenu i 1,2-dichlorobenzenu przez szczep Escherichia coli JMI09(MI) w obecności Tritonu X-100 pozwoliła na ponad ośmiokrotne zwiększenie biokonwersji tych związków. Autorzy publikacji uzyskane wyniki tłumaczyli zwiększeniem rozpuszczalności biodegradowanych związków w medium hodowlanym zawierającym związki powierzchniowo czynne, na co wskazują również Randazzo i in. [112]. Surfaktanty z serii preparatów Tween (zawierające niejonowe polioksy-etylenowane estry sorbitolu i kwasów tłuszczowych) były wykorzystywane przez Yeh i in. [113] w biodegradacji heksachlorobenzenu w warunkach beztlenowych przez konsorcjum mikroorganizmów. Niezależnie od rodzaju surfaktantu, we wszystkich przypadkach zanotowano zmniejszenie biodegradacji, co jest tłumaczone ich toksycznym oddziaływaniem na mikroorganizmy biorące udział w procesie. Chrzanowski i in. [114] wykorzystali ramnolipidy we wspomaganiu biodegradacji fenolu i jego pochodnych, 4-chlorofenolu oraz 2,4-chlorofenolu, przez konsorcjum mikroorganizmów wyizolowane z gleby. W hodowlach z niepodstawionym fenolem zaobserwowano wzrost efektywności biodegradacji w przeciwieństwie do hodowli z jego chlorowymi pochodnymi. Autorzy pracy tłumaczą mniejsze wartości biodegradacji bardziej polarnym charakterem cząsteczek 4-chlorofenolu oraz 2,4-chlorofenolu. Bardziej polarne związki wykazywały zwiększone powinowactwo do surfaktantów, które tworzyły micele, w których ulegały uwięzieniu wymienione pochodne fenolu. W innej pracy Chrzanowskiego i in. [115] opisana zaostała biodegradacja 2,4,5-trichlorofenolu przez szczep Pseudomonas putida DOT-T1E. Autorzy stwierdzili, że w obecności ramnolipidów biodegradacja tej pochodnej fenolu była wolniejsza niż w hodowlach nie zawierających surfaktantu. Jednocześnie w obu wymienionych pracach zwrócona jest uwaga na zmniejszenie toksyczności chlorofenoli w obecności ramnolipidów, co również jest tłumaczone wiązaniem pochodnych fenolu w tworzonych przez surfaktant micelach. 27

Kilka prac poświęconych zostało biodegradacji pestycydów, będących związkami chloroaromatycznymi. Baczyński i Pleissner [116] prowadzili bioremediację gleby skażonej insektycydami, w tym DDT (1,1,1-trichloro-2,2-bis-(4-chlorofenylo)etanu). W zrealizowanych przez nich badaniach gleba została zaszczepiona inokulum przygotowanym na bazie osadu czynnego, a proces prowadzono w warunkach beztlenowych. W obecności niejonowego surfaktantu Tween 80 biodegradacja DDT wzrosła w porównaniu do próby nie zawierających surfaktantu i osiągnęła wartość 77% (przy ok. 65% w próbie bez surfaktantu) po 16 tygodniach prowadzenia eksperymentu. W obecności Tween 80 malała również akumulacja w bioreaktorze jednego z metabolitów, 1,1-dichloro-2,2-bis-(4-chlorofenylo)etanu (DDD). Korzystne działanie surfaktantów było jednak obserwowane tylko przy stężeniu surfaktantu równym 0,5 mm. Przy jego większym stężeniu (1,25 mm) wydajność procesu była mniejsza [116]. Przeprowadzone badania pozwoliły zaobserwować, że również w obecności niejonowych surfaktantów Brij 35 i Triton X-114 [117] oraz Brij 30 [118] nastąpiło zmniejszenie akumulacji produktów pośrednich rozkładu DDT. Autorzy badań tłumaczą to inhibicją biodegradacji wspomaganej surfaktantami przy stężeniach powyżej krytycznego stężenia micelizacji, powołując się przy tym na badania prowadzone przez Cuypers i in. [119] nad biodegradacją wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. Polichlorowane bifenyle (PCB) są wysoce hydrofobowe, co rzutuje na ich niską biodostępność dla mikroorganizmów. Wspomaganiu surfaktantami tlenowej biodegradacji PCB poświęcone były badania Billingsley i in. [120]. Wśród testowanych surfaktantów znalazły się preparaty handlowe zawierające związki należące do alkilowych sulfonianów i etoksylanów alkoholi tłuszczowych. Uzyskane dla poszczególnych preparatów wyniki biodegradacji znacznie się różniły, od wyraźnej inhibicji w obecności preparatu Bio-Soft EN 600 po niemal całkowitą biodegradację wybranych PCB wobec preparatu Hostapur SAS 60. Prezentowane w pracy badania wskazywały również na zmniejszenie efektywności biodegradacji przy stężeniach surfaktantów powyżej krytycznego stężenia micelizacji. Biologiczny rozkład eteru dekabromodifenylowego (BDE-209) był przedmiotem badań Lu i in. [121]. Szczep Bacillus cereus JP12 w ciągu 12 dni biodegradował 45% początkowej ilości (20 mg/dm 3 ) BDE-209. Wprowadzenie Tritonu X-100 nie miało istotnego wpływu na biodegradację BDE-209, w obecności Tergitolu NP-10 efektywność procesu nieznacznie malała (do ok. 40%) w przeciwieństwie do prób z Tween 80, w których biodegradacja w tym samym czasie osiągała niecałe 50%. Tang i in. [122] również badali biodegradację BDE-209 przez szczep Brevibacillus brevis. Użycie przez nich saponin z herbaty (Camelia sinensis) 28

pozwoliło po siedmiu dniach prowadzenia hodowli na zwiększenie biodegradacji z ok. 43% do 53%, przy początkowym stężeniu BDE-209 0,5 mg/dm 3. Wyniki przedstawione w przytoczonych publikacjach świadczą o niejednoznacznym wpływie surfaktantów na biodegradację różnych przedstawicieli HZA. Większość badaczy wykorzystywała dostępne na rynku surfaktanty, m. in. z serii Tween czy Brij. Wpływ na biodegradację HZA surfaktantów roślinnych z grupy saponin praktycznie nie był dotąd szerzej analizowany. 3. Saponiny Saponiny to grupa związków powierzchniowo czynnych pochodzenia naturalnego należących do glikozydowych pochodnych steroidów lub policyklicznych triterpenów. Występują one powszechnie jako metabolity wtórne w wielu gatunkach roślin i niektórych gatunkach zwierząt morskich i owadów. Mają one charakter amfifilowy, co wiąże się z ich właściwościami powierzchniowo czynnymi, w tym zdolnością do obniżania napięcia powierzchniowego, co jest związane z ich wysoką aktywnością biologiczną [123]. W czystej formie saponiny są bezbarwnymi substancjami, o strukturze amorficznej lub w niewielkim stopniu krystalicznej [124]. Saponiny są nielotnymi związkami, które w roztworach wodnych ulegają hydrolizie w obecności silnych kwasów i zasad oraz pod wpływem wysokiej temperatury (powyżej 90 C) [125]. Są dobrze rozpuszczalne w wodzie i niższych alkoholach, a słabo lub praktycznie nierozpuszczalne w heksanie i dichlorometanie. Większość metod izolacji saponin opiera się na ekstrakcji rozdrobnionego surowca, jako ekstrahent stosując zwykle etanol, metanol lub wodę [126]. 3.1. Budowa chemiczna i rodzaje saponin W cząsteczce saponin wyróżnia się dwie główne struktury, pierwszą stanowi część aglikonowa (tzw. sapogenina), zawierającą szkielet steroidowy lub triterpenowy, a drugą część glikonowa (sacharydowa). Aglikon ma charakter hydrofobowy, natomiast glikon hydrofilowy Obie części cząsteczki saponin połączone są ze sobą najczęściej wiązaniem eterowym, rzadziej estrowym [123], [127]. Opracowano szereg systemów klasyfikacji saponin, przyjmując za kryterium ich właściwości fizykochemiczne, aktywność biologiczną lub sposób syntezy czy funkcję pełnioną w wytwarzających je organizmach. Najczęściej stosowany podział tej grupy związków opiera się na ich strukturze chemicznej (rysunek I.18.) [128]. Podstawowym kryterium podziału saponin jest budowa części niecukrowej. Ze względu na strukturę części aglikonowej wyróżnia się saponiny triterpenowe oraz steroidowe (rysunek I.19). Szkielet triterpenowy składa się z 30 atomów węgla, najczęściej typu α-amyryny [128]. Saponiny triterpenowe (rysunek I.20) obejmują związki typu oleanu (pochodne β-amyryny), 29

ursanu (pochodne α-amyryny) i dammaranu. Szkielet steroidowy zbudowany jest z 27 atomów węgla, tworzących sześciopierścieniowy (heksacykliczny) układ spirostanu lub pięciopierścieniowy (pentacykliczny) układ furostanu [127]. W przypadku zarówno saponin steroidowych, jak i triterpenowych, do aglikonu mogą być przyłączone grupy wodorotlenowe, karboksylowe lub metylowe [124], a w części glikonowej niektóre grupy hydroksylowe mogą występować w postaci zacylowanej [128]. Rysunek I.18. Podział saponin ze względu na budowę chemiczną; opracowanie własne na podstawie [129] Część hydrofilową saponin, tzw. glikon, stanowi rozgałęziony lub prosty łańcuch cukrowy, zbudowany od jednego do trzech monosacharydów. Wśród monosacharydów zidentyfikowanych w cząsteczkach saponin dominują glukoza, D-galaktoza, L-ramnoza, D-ksyloza, L-arabinoza i kwas D-glukuronowy. Rzadziej występuje D-apioza i kwas D-galakturonowy [110]. Biorąc pod uwagę ilość łańcuchów sacharydowych w glikonie, wyróżnia się saponiny o jednym (monodesmozydy), o dwóch (bidesmozydy) lub trzech łańcuchach (tridesmozydy) [129]. Poszczególne monosacharydy są połączone najczęściej wiązaniem glikozydowym, a z częścią niecukrową łączą się zwykle poprzez grupę hydroksylową przyłączoną do węgla C-3 części aglikonowej lub wiązaniem estrowym poprzez grupę karboksylową przy węglu C-29 [123]. 30

a) b) Rysunek I.19. Ogólna postać aglikonów saponin steroidowych: a) typu furostanu, b) typu spirostanu wg [127] a) b) c) Rysunek I.20. Ogólna postać aglikonów saponin triterpenowych: a) typu oleanu, b) typu ursanu, c) typu dammaranu [127] 3.2. Występowanie saponin w środowisku Saponiny występują w naturze przede wszystkim w roślinach i są obecne we wszystkich ich organach, takich jak liście, kwiaty, łodygi, kora, korzenie i owoce. W tkankach roślin saponiny pełnią głównie funkcje obronne. Saponiny powstrzymują infekcje grzybicze i bakteryjne oraz zniechęcają, ze względu na swój gorzki smak, zwierzęta przez zjadaniem tkanek roślinnych [124]. Saponiny są obecne w roślinach z ponad 100 rodzin systematycznych, należących głównie do roślin okrytonasiennych, ale potwierdzona została również ich obecność w niektórych gatunkach roślin nagonasiennych z rodziny Polypodium (paprotkowatych) [130]. Wśród roślin okrytonasiennych występują głównie u jednoliściennych (Monocotyledones) w rodzinach: pochrzynowate (Dioscoreaceae), liliowate (Liliaceae), agawowate (Agavaceae) oraz u roślin dwuliściennych (Dicotyledones) w rodzinach: trędownikowate 31

(Scrophulariaceae), motylkowate (Fabaceae), psiankowate (Solanaceae), jaskrowate (Ranunculaceae), astrowate (Asteraceae) [129]. Związki z grupy saponin występują również w niektórych organizmach morskich, jak na przykład rozgwiazda Asterias amurensis [131], [132]. Spośród roślin występujących na obszarze Polski względnie wysokie ilości saponin triterpenowych są obecne m. in. w liściach bluszczu pospolitego (Hedera helix L.), kłączu mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis L.) i kwiecie pierwiosnka lekarskiego (Primula veris L.) (rysunek I.21). Z kolei saponiny steroidowe zostały zidentyfikowane wśród krajowych roślin, np. w owocach kokoryczki wielokwiatowej (Polygonatum multiflorum), czy owocach konwalijki dwulistnej (Mayanthemum bifolium) [124] (rysunek I.22). Rysunek I.21. Przykłady roślin występujących w Polsce zawierających saponiny triterpenowe: a) bluszcz pospolity (Hedera helix L.) [133], b) mydlnica lekarska (Saponaria officinalis L.) [134], c) pierwiosnek lekarski (Primula veris L.) [135] Rysunek I.22. Przykłady roślin występujących w Polsce zawierających saponiny steroidowe: a) kokoryczka wielokwiatowa (Polygonatum multiflorum) [143], b) konwalijka dwulistna (Mayanthemum bifolium) [144] Spośród roślin z innych stref klimatycznych, ze względu na wysoką zawartość substancji aktywnych, wiele badań jest poświęconych saponinom z kory mydłodrzewu właściwego (Quillaja saponaria) [136], liści herbaty chińskiej (Camelia sinensis) [137], [138], 32

korzenia żeń-szenia właściwego (Panax ginseng) [139], [140] czy owoców roślin z gatunku Sapindus (Sapindus mukorossi oraz Sapindus saponaria) [141], [142] (rysunek I.23). Rysunek I.23. Przykłady bogatych w saponiny roślin ze stref klimatu subtropikalnego i tropikalnego: a) mydłodrzew właściwy (Quillaja saponaria) [145], b) herbata chińska (Camellia sinensis) [146], c) Sapindus mukorossi [147] Zawartość saponin w roślinach podlega zmianom także w obrębie poszczególnych gatunków, różniąc się w zależności od warunków środowiskowych, jednak niezależnie od gatunku nie przekracza kilku procent suchej masy. Zwykle w danej roślinie występuje mieszanina saponin, należących do jednej grupy jednak różniących się położeniem podstawników i grup funkcyjnych czy ilością reszt cukrowych [148]. 3.3. Zastosowania saponin Saponiny pozyskiwane z różnych surowców roślinnych są obecnie wykorzystywane w kilku gałęziach przemysłu (rysunek I.23). Najwcześniejsze zastosowania saponin wiążą się z medycyną, przemysłem farmaceutycznym i kosmetycznym. Ponadto należy wskazać na ich użycie w przemyśle spożywczym. Nieliczne prace opisują możliwości wykorzystania saponin w ochronie środowiska, zarówno w technikach wymywania zanieczyszczeń z gleby, jak i biodegradacji węglowodorów wspomaganej surfaktantami [125], [127]. 3.3.1. Wykorzystanie saponin w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym Wysoka aktywność biologiczna i właściwości lecznicze saponin rzutują na ich szerokie zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym. Jako suplement diety saponiny mogą mieć korzystny wpływ na poziom cholesterolu [149] oraz cukru we krwi [150], czy też wykazywać właściwości przeciwutleniające [151]. Inne badania pokazują działanie 33

hemolityczne [152] oraz przeciwzapalne [153] ekstraktów roślinnych bogatych w saponiny. Jedną z głównych cech saponin jest ich antybakteryjne i antygrzybicze działanie względem wielu szczepów chorobotwórczych. Saponiny, m. in. z Agave sisalana i Ziziphus joazeiro, wykazują toksyczny wpływ na Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Salmonella choleraesuis i Bacillus cereus [151], [154]. Duże zainteresowanie badaczy zwracają również przeciwnowotworowe właściwości saponin [152], [155], [156]. Przykładem są badania prowadzone przez Note i in. [157], którzy zaobserwowali inhibicję wzrostu komórek rakowych ośrodkowego układu nerwowego pod wpływem triterpenowych saponin z Albizia lebbeck. Badania pokazują m. in. cytotoksyczne działanie saponin z Erythrina abyssinica [158], jak i Paris polyphylla var. yunnanensis [159]. W przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym wytwarzanie stabilnych emulsji, także nanoemulsji, ma bardzo duże znaczenie. Także i w tym obszarze saponiny mogą pełnić rolę wydajnego i bezpiecznego czynnika emulgującego i dyspergującego [160], [161]. Ozturk i in. [162] zaproponowali użycie saponin z Quillaja saponaria do tworzenia nanoemulsji niezbędnych do efektywnego dostarczania witaminy E. Rysunek I.24. Główne obszary zastosowań saponin; opracowanie własne na podstawie [110], [125], [129] 3.3.2. Wykorzystanie saponin w przemyśle spożywczym i rolnictwie W przemyśle spożywczym spośród saponin największe znaczenie ma ekstrakt z kory mydłodrzewu (Quillaja saponaria), który jest zaakceptowanym do powszechnego stosowania dodatkiem do żywności oznaczanym jako E999 [163]. Jest on wykorzystywany w browarnictwie i produkcji napojów gazowanych, jako czynnik zwiększający objętość i jakość piany. Podobną rolę mogą pełnić saponiny z Chenopodium quinoa [164]. Ekstrakt 34

z Q. saponaria znajduje również zastosowanie w cukiernictwie [127]. Ponadto dla przemysłu spożywczego atrakcyjne jest łączenie przez saponiny, jak te obecne np. w ekstrakcie z owoców Sapindus mukorossi, dobrych właściwości emulgujących i pianotwórczych ze zdolnościami bakteriostatycznymi [165]. Badania nad wykorzystaniem saponin jako emulgatora w produktach spożywczych prowadzili m. in. Ozturk i McClements [166]. Biobójcze właściwości wielu ekstraktów zawierających saponiny przyczyniają się do szukania w nich przyjaznych dla środowiska pestycydów. Mølgaard i in. [167] wykazali ślimakobójcze właściwości saponin z Phytolacca dodecandra. Podobnymi właściwościami charakteryzował się także ekstrakt z S. mukorossi [168]. Aktywność saponin przeciwko grzybom była opisywana m. in. przez Sadeghi i in. [169], Saniewską i in. [170] oraz De Lucca i in. [171]. Są również doniesienia o możliwości wykorzystania saponin jako insektycydy, np. przeciwko wołkowi ryżowemu [172] oraz gąsienicom Spodoptera littoralis i mszycom Acyrthosiphon pisum [173]. Odpady biologiczne z przetwórstwa żywności mają największy udział w światowej produkcji odpadów, a ich efektywne zagospodarowanie stanowi duże wyzwanie [174]. Istotne jest przy tym maksymalne zwiększenie powierzchni wymiany masy, na co pozwala użycie surfaktantów. Obecność saponin pozwalała m. in. na zwiększoną akumulację, w osadzie czynnym oczyszczalni ścieków, lotnych kwasów tłuszczowych podczas beztlenowej fermentacji odpadów biologicznych. Otrzymywane w procesie kwasy tłuszczowe mogą być wykorzystywane w produkcji np. polihydroksyalkanianów [175]. Saponiny mogą również być stosowane we wspomaganiu rozkładu przez enzymy celulolityczne odpadów rolniczych, zawierających materiały ligninocelulozowe. Ma to bezpośrednie przełożenie na zwiększenie wydajności biologicznej produkcji etanolu do celów przemysłowych [176]. Suplementacja pasz saponinami może pozytywnie wpłynąć na ograniczenie ilości metanu produkowanego przez mikroorganizmy obecne w żołądkach przeżuwaczy. Patra i Yu [177] zaobserwowali, że dodanie do paszy saponin z kory Q. saponaria przy jednoczesnym zbilansowaniu zawartości jonów azotanowych pozwoliło na istotne zmniejszenie emisji metanu, przy zachowaniu efektywności rozkładu pożywienia, jak przy niesuplementowanej paszy. 3.3.3. Wykorzystanie saponin w wymywaniu jonów metali i związków arsenu Przemysł metalurgiczny, elektroniczny oraz odpady komunalne to główne źródła skażenia środowiska toksycznymi metalami i półmetalami. Ich wysoce szkodliwe działanie na zdrowie ludzi i zwierząt powoduje, że opracowuje się szereg metod ich usuwania ze środowiska. Wśród tych metod dominują te związane z przemywaniem skażonej gleby. Roztwory przemywające mogą zawierać związki chelatujące, adsorbenty i surfaktanty [178], 35

[179]. Ze względu na większą biokompatybilność i mniejszą toksyczność w porównaniu do surfaktantów sysntetycznych w wielu metodach związanych z wymywaniem jonów metali wykorzystywane są saponiny [180]. Chen i in. [181] wykorzystali roztwór saponin z Quillaja saponaria do wymywania jonów miedzi(ii) i niklu(ii) z kaolinu, uzyskując bardzo dobrą wydajność, porównywalną z wartościami uzyskanymi dla kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) oraz dodecylosiarczanu sodu (SDS). Także Gusiatin i Klimiuk [178] użyli saponin w wielokrotnym płukaniu gleby skażonej kadmem, miedzią i cynkiem. Szczególnie wysokie współczynniki wymywania były obserwowane dla cynku. Yuan i in. [182] wykorzystali saponiny z herbaty chińskiej we flotacji jonowej do usuwania kadmu, ołowiu i miedzi z wód ściekowych. Maity i in. [183] stosowali roztwór saponin do usuwania niklu, chromu oraz manganu, jednak jony tego ostatniego metalu były wymywane z relatywnie niską efektywnością, wynoszącą 25%. Z kolei Pekdemir i in. [184] użyli saponin do usuwania ołowiu z zanieczyszczonych nim wód ściekowych. Oprócz wymienionych wyżej metali, Polettini i in. [185] badali również wymywanie roztworami saponin jonów żelaza. W procesach wymywania istotną rolę pełniła kwasowość roztworu płuczącego. Najlepsze rezultaty uzyskiwano przy niskich wartościach ph [186]. Jony chromu(iii) były wymywane z odpadów z przemysłu garbarskiego 3% roztworem saponin z Q. saponaria, co pozwalało na kilkakrotne zwiększenie wydajności usuwania jonów metalu w porównaniu do płukania wodą nie zawierającą surfaktantu [187]. Chrom był wymywany z gleby również za pomocą zawiesiny mikropęcherzyków powietrza utworzonych dzięki micelom saponin z S. mukorossi [188]. Saponiny mogą również pełnić rolę czynnika modyfikującego powierzchnię komórek mikroorganizmów, co rzutuje na ich zdolność do adsorpcji metali ciężkich. Przykładem takiego rozwiązania było wykorzystanie saponin do modyfikacji komórek Penicillium simplicissimum, które skutkowało zwiększoną przez nie sorpcją jonów kadmu(ii) [189]. Cao i in. [180] do usuwania z gleby kadmu i ołowiu zastosowali roztwór zwierający saponiny oraz czynnik chelatujący, tj. kwas etylenodiamino-n,n -dibursztynowy. Połączenie surfaktantu i wymienionego kwasu pozwoliło na bardzo wydajne jednoczesne usuwanie nie tylko wymienionych metali, ale również polichlorowanych bifenyli (PCB). Współwymywanie pirenu i kadmu z gleby było przedmiotem badań prowadzonych przez Wang i in. [190]. Badania nad usuwaniem kadmu i PCB przez kukurydzę zwyczajną (Zea mays L.) i trzcinę cukrową (Saccharum officinarum L.) prowadzili Xia i in. [191], którzy zaobserwowali zwiększone pobieranie obu typów zanieczyszczeń przez rośliny w obecności saponin z liści herbaty chińskiej. Wymywaniu arsenu z gleby były poświęcone natomiast 36

badania prowadzone przez Gusiatina [192]. Zwiększenie mobilności arsenu podczas płukania gleby roztworem saponin z Q. saponaria było związane z kompleksowaniem przez nie jonów żelaza zawartych w arsenianach. 3.3.4. Wykorzystanie saponin w procesach wymywania węglowodorów Do strategii powszechnie stosowanych w oczyszczaniu skażonej gleby zaliczane jest wymywanie zawartych w niej zanieczyszczeń roztworami surfaktantów. Następnie zanieczyszczenia mogą zostać wydzielone z roztworu albo poddane biodegradacji w wyniku wprowadzenia do roztworu biodegradujących zanieczyszczenia mikroorganizmów [193], [194]. Cao i in. [180] poświęcili swoją pracę badaniom nad wykorzystaniem roztworów saponin w usuwaniu polichlorowanych bifenyli (PCB). Autorzy wykorzystali mieszaninę czynnika chelatującego EDDS (kwasu etylenodiamino-n,n-di-bursztynowego) i saponin do wymywania PCB i metali ciężkich. Dobre rezultaty uzyskali Ye i in. [179] przy jednoczesnej desorpcji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), PCB, polibromowanych difenyli oraz metali ciężkich roztworami saponin zmieszanymi z olejem palmowym. Z kolei Gomes i in. [195] wykorzystali roztwór saponin w elektrodialitycznej remediacji PCB z gleby, wskazując na synergistyczny efekt naturalnego surfaktantu i działania pola elektrycznego. Wpływ roztworu saponin na desorpcję heksachlorobenzenu był z kolei analizowany przez Kommalapati i in. [196], którzy zauważyli, że rozpuszczalność węglowodoru wzrastała wraz ze wzrostem stężenia saponin. Ponadto uzyskane wartości stopnia desorpcji heksachlorobenzenu roztworami saponin były porównywalne z wynikami uzyskanymi stosując roztwór dodecylosiarczanu sodu. Według badań Kobayashi i in. [197] roztwór saponin z Q. saponaria o stężeniu przekraczającym krytyczne stężenie micelizacji okazał się bardzo dobrym czynnikiem zwiększającym wymywanie benzo[a]pirenu, pirenu i fenantrenu. Wu i in. [198] zaproponowali do usuwania z gleby WWA roztwory zwierające mieszaninę saponin (z Q. saponaria) z preparatami z serii Brij i Triton. Spośród stosowanych roztworów poszczególnych surfaktantów, saponiny w największym stopniu zwiększały rozpuszczalność WWA. Ten korzystny efekt obserwowano jednak tylko przy stężeniach poniżej krytycznego stężenia micelizacji. Powyżej tego stężenia lepszym surfaktantem okazał się Brij 35. Połączenie tych dwóch surfaktantów wykazało bardzo dobry efekt synergistyczny pozwalając na znaczne wymywanie WWA z badanych próbek gleby. Także saponiny z owoców S. mukorossi były z powodzeniem wykorzystywane w wymywaniu WWA [199]. Urum i Pekdemir [200] zajmowali się remediacją gleby skażonej ropą naftową z wykorzystaniem roztworów płuczących różnych surfaktantów, uzyskując ponad 79% 37

desorpcję ropy przy wykorzystaniu roztworu saponin z Q. saponaria, co było na podobnym poziomie jak przy użyciu ramnolipidów oraz dodecylosiarczanu sodu. Jednak inne badania prowadzone przez Urum i in. [201] pokazały, że w przypadku innego typu gleby saponiny nie były już tak skuteczne w wymywaniu ropy naftowej. Jednocześnie autorzy publikacji zwrócili uwagę, że w przeciwieństwie do roztworów ramnolipidów oraz dodecylosiarczanu sodu, roztwór saponin wymywał węglowodory aromatyczne w dużo większym stopniu niż związki alifatyczne. 3.3.5. Wykorzystanie saponin w biodegradacji węglowodorów Saponiny, jako surfaktanty pochodzenia naturalnego, są uważane za związki o względnie niskiej toksyczności i wysokiej biodegradowalności. Cechy te stanowią istotną zaletę z perspektywy wykorzystania saponin w biodegradacji wspomaganej surfaktantami [202]. W porównaniu z liczbą prac opisujących wykorzystanie surfaktantów produkowanych przez mikroorganizmy w procesach biodegradacji węglowodorów, ilość publikacji opisujących biodegradację zanieczyszczeń w obecności saponin jest jednak stosunkowo niewielka. Jedną z grup zanieczyszczeń, charakteryzującą się wysoką toksycznością, stanowią wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA). Część prac nad ich usuwaniem ze środowiska naturalnego poświęcono biodegradacji WWA w obecości surfaktantów pochodzenia roślinnego. Kobayashi i in. [197] stwierdzili dwukrotne zwiększenie degradacji pirenu przez szczep Sphingomonas sp. w obecności saponin osiągając ponad 60% biodegradację w ciągu 60 godzin. Także podczas biodegradacji WWA przez szczepy z rodzajów Pseudomonas i Mycobacterium zauważalny był pozytywny efekt wprowadzenia do hodowli saponin z Q. saponaria [203]. Choi i in. [204] potwierdzili wzrost wydajności biologicznego rozkładu fenantrenu w obecności saponin w warunkach ograniczonego dostępu tlenu, ze względu na tworzenie przez surfaktant zawiesiny mikropęcherzyków powietrza. Rao i in. [205] opisują badania dotyczące biodegradacji naftalenu przez konsorcja bakteryjne, które suplementowano ekstraktem z S. mukorossi i ich mieszaniną z syntetycznymi surfaktantami. Wzrost biodegradowalności naftalenu w obecności saponin autorzy publikacji wiążą z zmniejszeniem wartości potencjału dzeta komórek mikroorganizmów w prowadzonych hodowlach. Pozytywny efekt saponin z Q. saponaria na bakteryjną biodegradację oleju napędowego opisywała Kaczorek i in. [206]. Jednak w przypadku innych szczepów, jak Pseudomonas stutzeri, dużo korzystniejszy wpływ od saponin miały inne surfaktanty, np. ramnolipidy [207]. Fava i di Gioia [208] wykorzystali saponiny z Q. saponaria w biodegradacji PCB przez bakterie autochtoniczne obecne w skażonej glebie, obserwując jedynie niewielki wzrost biodegradacji, podczas gdy w analogicznych warunkach Triton X-100 wyraźnie obniżył 38

wydajność biologicznego rozkładu PCB. W pracy Tang i in. [122], cytowanej już wcześniej w rozdziale 2.2, wprowadzenie do hodowli mikroorganizmów saponin z herbaty chińskiej (Camelia sinensis) pozwolił na zwiększenie biodegradacji tego związku, która po siedmiu dniach wyniosła 53%, przy biodegradacji na poziomie 43% w hodowlach nie zawierających surfaktantów. Saponiny wyizolowane z liści herbaty chińskiej były również z powodzeniem stosowane we wspomaganiu biodegradacji fenylocyn [209]. Podczas biodegradacji tych związków w obecności roślinnych surfaktantów zaobserwowano również znaczące zmiany w przepuszczalności błony komórkowej szczepu Bacillus thuringiensis. Prowadzono również badania mające na celu określenie wpływu saponin na biodegradację węglowodorów przez grzyby. Dodanie saponin z herbaty chińskiej do hodowli Penicillium simplicissimum pozwoliło na wzrost biodegradacji fenolu z 40% do 75% po 15 dniach [202]. Z kolei podczas biodegradacji fenantrenu przez Pleurotus eryngii [210] obecność w hodowli saponin działała inhibitująco na biodegradację, która w obecności Tritonu X-100 była jednak większa niż w próbach nie zawierających surfaktantu. 3.3.6. Inne zastosowania saponin Inne zastosowania saponin wiążą się przede wszystkim z wykorzystaniem ich właściwości fizykochemicznych. Chen i in. [211] wskazali na aktywność powierzchniową ekstraktów z Camellia oleifera oraz Sapindus mukorossi, pokazując możliwości wykorzystania ich jako zamienników detergentów zawierających syntetyczne surfaktanty. Sharma i in. [212] wykorzystywali z powodzeniem saponiny z S. mukorossi w tworzeniu biokompatybilnych nanocząsteczek złota. Golemanov i in. [213] zwrócili uwagę na interesujące właściwości warstw adsorpcyjnych tworzonych przez saponiny na granicy faz. Wyróżnia je wysoka elastyczność powierzchniowa i lepkość. Także tworzenie przez saponiny kompleksów z barwnikami otwiera nowe możliwości wykorzystania tych naturalnych surfaktantów [214]. 39

CEL I ZAKRES PRACY Dokonany przegląd literatury wskazał na zagrożenia związane z szerokim stosowaniem halogenowanych związków aromatycznych i ich negatywnym wpływem na środowisko naturalne. Pozwolił ponadto na dostrzeżenie potencjału saponin, jako czynnika zwiększającego efektywność biodegradacji węglowodorów. Jednocześnie stwierdzono bardzo niewielką ilość informacji o wpływie saponin na biodegradację halogenowanych związków aromatycznych prowadzoną w warunkach tlenowych przez bakterie. Przeprowadzenie badań w tym zakresie pozwoli na znaczące wzbogacenie wiedzy o procesach biodegradacji oraz możliwościach zastosowania saponin w technologiach związanych z ochroną środowiska naturalnego. Celem podjętych badań było określenie wpływu ekstraktu z owoców Sapindus mukorossi, zawierającego saponiny, na biodegradację wybranych halogenowanych związków aromatycznych: trzech izomerów chlorotoluenu (2-chlorotoluenu, 3-chlorotoluenu, 4-chlorotoluenu) i 4-halogenowanych fenoli (4-fluorofenolu, 4-chlorofenolu, 4-bromofenolu), prowadzoną przez szczepy bakteryjne w warunkach tlenowych. Cel pracy obejmował również określenie towarzyszących biodegradacji zmian we właściwościach powierzchniowych komórek bakteryjnych. Badania realizowano zarówno z wykorzystaniem wyizolowanych z próbek środowiskowych szczepów bakteryjnych, a także stosując konsorcjum mikroorganizmów autochtonicznych zawartych w wodzie rzecznej. Wypełnienie celu badań było związane z realizacją czterech głównych zadań badawczych, opisanych poniżej. 1) Izolacją z próbek środowiskowych oraz charakterystykę mikroorganizmów zdolnych do wzrostu w obecności izomerów chlorotoluenu oraz trzech 4-halogenowanych pochodnych fenolu. 2) Wyborem ekstraktu roślinnego, o najkorzystniejszych właściwościach z punktu widzenia prowadzenia biodegradacji HZA, spośród ekstraktów z kłącza mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis L.), kory kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum L.) i owoców Sapindus mucorossi Gaertn. 3) Określeniem wpływu ekstraktu roślinnego na biodegradację izomerów chlorotoluenu oraz trzech 4-halogenowanych pochodnych fenolu przez wyizolowane szczepy bakteryjne oraz konsorcjum mikroorganizmów obecnych w wodzie rzecznej. 4) Analizą zmian właściwości powierzchniowych komórek bakteryjnych zachodzących podczas biodegradacji izomerów chlorotoluenu oraz trzech 4-halogenowanych pochodnych fenolu. 40

II. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA 1. Odczynniki i aparatura Tabela II.1., zawiera zestawienie odczynników, które były stosowane podczas przeprowadzonych badań. W tabeli II.2. zestawiony został wykaz ważniejszej aparatury analitycznej oraz wykorzystywanego sprzętu laboratoryjnego. Tabela II.1. Odczynniki chemiczne wykorzystywane w trakcie przeprowadzonych badań 2-chlorotoluen 99% nazwa odczynnika 2-nitrofenylo-β-D-galaktozyd (OPNG) 98% 3-chlorotoluen 98% 4-chlorotoluen 98% aceton (do GC) agar agar agar Columbia (z 5% dodatkiem krwi baraniej) agar Mueller-Hinton agar tryptozowo-sojowy agar wzbogacony azotan(v) wapnia(ii) 7 hydrat cz.d.a. bromek 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2Htetrazoliowy bromek potasu(i) cz.d.a. bulion odżywczy bursztynian sodu(i) 7 hydrat cz.d.a. chlorek kobaltu(ii) 6 hydrat cz.d.a. chlorek magnezu(ii) 4 hydrat cz.d.a. chlorek manganu(ii) 4 hydrat cz.d.a. chlorek miedzi(ii) 2 hydrat cz.d.a. chlorek niklu(ii) 6 hydrat cz.d.a. chlorek sodu(i) cz.d.a. chlorek wapnia(ii) 2 hydrat cz.d.a. cytrynian amonu żelaza(iii) cz.d.a. dichlorometan (do GC) diwodorofosforan(v) potasu(i) cz.d.a. ekstrakt drożdżowy etanol 99,5% etanol cz.d.a. eter tert-butylo-metylowy etylobenzen 99% producent AlfaAesar, Wielka Brytania Fluka, Niemcy AlfaAesar, Wielka Brytania AlfaAesar, Wielka Brytania POCH, Polska BTL sp. z o.o., Polska biomeriueux, Polska BTL sp. z o.o., Polska BTL sp. z o.o., Polska BTL sp. z o.o., Polska POCH, Polska Sigma Aldrich, Niemcy POCH, Polska BTL sp. z o.o., Polska Sigma Aldrich, Niemcy POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska Chempur, Polska Chempur, Polska POCH, Polska Sigma Aldrich, Niemcy POCH, Polska Sigma Aldrich, Niemcy BTL sp. z o.o., Polska POCH, Polska POCH, Polska Sigma Aldrich, Niemcy AlfaAesar, Wielka Brytania 41

Tabela II.1. Odczynniki chemiczne wykorzystywane w takcie badań c.d. nazwa odczynnika glukoza cz.d.a. heksadekan cz.d.a. kwas borowy cz.d.a. kwas chlorowodorowy 35-38%, cz.d.a. kwas siarkowy(vi) 98% metanol cz.d.a metanol do HPLC molibdenian(vi) sodu(i) 2 hydrat cz.d.a. octan amonu cz.d.a. propan-1-ol saponiny z kory Quillaja saponaria ( 10%) siarczan(vi) amonu cz.d.a. siarczan(vi) cynku(ii) 7 hydrat cz.d.a. siarczan(vi) magnezu(ii) cz.d.a. siarczan(vi) żelaza(ii) 7 hydrat cz.d.a. wanilina (99%) wersenian sodu cz.d.a. wodorofosforan(v) di-sodu(i) cz.d.a. wodorotlenek sodu(i) cz.d.a. producent POCH, Polska Sigma Aldrich, Niemcy POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska POCH, Polska Sigma Aldrich, Niemcy Sigma Aldrich, Niemcy POCH, Polska POCH, Polska Chempur, Polska Sigma Aldrich, Niemcy Chempur, Polska Sigma Aldrich, Niemcy Chempur, Polska Tabela II.2. Spis aparatury i sprzętu wykorzystywanych podczas prowadzonych badań Nazwa model/typ producent analizator genetyczny AbiPrism 3100 analizator potencjału dzeta aparat do otrzymywania wody ultraczystej aparat do pomiaru napięcia powierzchniowego autoklaw elektryczno parowy bioreaktor 1,5 dm 3 chromatograf gazowy sprzężony ze spektrometrem mas chromatograf gazowy z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym Zetasizer Nano ZS Arium pro ASTM Typ 1 K20 typ A6 BIOSTAT B Plus Pegasus 4D GCxGC TOF MS HP6890 Applied Biosystem, Stany Zjednoczone Malvern Instruments Ltd., Wielka Brytania Sartorius Stedim Biotech SA, Polska Krüss, Niemcy SMS Spółdzielnia Pracy Mechaników, Polska Sartorius Stedim, Niemcy Leco, Stany Zjednoczone Hewlett-Packard, Stany Zjednoczone homogenizator ultradźwiękowy Sonopuls HD 3100 Bandelin, Niemcy inkubator z wytrząsaniem KS 4000 ic control IKA Werke GmbH, Niemcy 42

Tabela II.2. Spis aparatury i sprzętu wykorzystywanych podczas badań c.d. komora laminarna Nazwa model/typ producent Labculture Class II Type A2 ESCO Micro Pte. Ltd., Singapur liofilizator Alpha 1 2 LDplus Christ, Niemcy ph metr laboratoryjny 1000 L, phenomenal VWR, Polska skaningowy mikroskop elektronowy S-3400N Hitachi, Japonia spektrofotometr podczerwieni z transformacją Fouriera Vertex 70 Bruker, Niemcy spektrofotometr UV Vis V 650 Jasco Inc, Japonia spektrometr dyspersji energii 4481B-1UES-SN spektrometr mas QTRAP 4000 Thermo Electron Corp., Stany Zjednoczone ABSciex, Stany Zjednoczone spektrometr mas microtof-q Bruker, Niemcy ultra wysokosprawny chromatograf cieczowy wirówka z chłodzeniem 3 18K Acquity UPLC wyparka rotacyjna Rotavapor R 210 wysokosprawny chromatograf cieczowy Ultimate 3000 wytrząsarka laboratoryjna typu Vortex Infrared Vortex Mixer WIZARD Waters, Stany Zjednoczone Sigma Laborzentrifugen GmbH, Niemcy Buchi Labortechnik AG, Szwajcaria Dionex, Sunnyvale, Stany Zjednoczone VELP Scientifica, Włochy 2. Przygotowanie szkła i roztworów do badań 2.1. Materiały do pracy z mikroorganizmami Jałowienie szkła laboratoryjnego i innych materiałów trwałych wykorzystywanych do pracy z mikroorganizmami odbywało się na sucho, gorącym powietrzem, w suszarce przez 15 min w temperaturze 180 ºC. Części z tworzyw sztucznych, nieodporne na tak wysoką temperaturę jałowiono w autoklawie na mokro, parą wodną, przy nadciśnieniu 0,1 MPa w temperaturze 121 ºC przez 15 min. Po zakończeniu pracy z mikroorganizmami powierzchnie stołów laboratoryjnych myto środkami dezynfekującymi. Sterylizację przyborów i szkła laboratoryjnego prowadzono w autoklawie na mokro, przy nadciśnieniu 0,1 MPa, w temperaturze 121 ºC przez 45 min. 2.2. Przygotowanie wody Wszystkie roztwory wodne, jeśli nie zostało to wskazane inaczej, były sporządzane w oparciu o wodę o oporności 18 MΩ/cm, oczyszczaną za pomocą aparatu do otrzymywania wody ultraczystej, Arium pro ASTM Typ 1. 43

2.3. Medium i suplementy do prowadzenia hodowli Do prowadzenia hodowli bakteryjnych stosowano medium hodowlane zaproponowane przez Dobslaw i Engessera [13] wykorzystywane przez nich w badaniach nad biodegradacją halogenowanych węglowodorów aromatycznych. Skład medium przedstawiono w tabeli II.3., a roztworu mikroelementów stanowiącego uzupełnienie medium został zamieszczony w tabeli II.4. Medium poddawano wyjaławianiu w autoklawie przy nadciśnieniu 0,1 MPa w temperaturze 121 C przez 15 minut. Tabela II.3. Skład medium hodowlanego Odczynnik stężenie [g/dm 3 ] wodorofosforan(v) disodu(i) 2,79 diwodorofosforan(v) potasu(i) 1,00 siarczan(vi) amonu 1,00 siarczan(vi) magnezu(ii) 1 hydrat 0,20 azotan(v) wapnia(ii) 7 hydrat 0,01 cytrynian amonu żelaza(iii) 0,01 roztwór mikroelementów 1,00 cm 3 Tabela II.4. Skład roztworu mikroelementów Odczynnik stężenie [g/dm 3 ] kwas borowy 0,30 chlorek kobaltu(ii) 6 hydrat 0,20 siarczan(vi) cynku(ii) 7 hydrat 0,10 molibdenian(vi) sodu(i) 2 hydrat 0,03 chlorek manganu(ii) 4 hydrat 0,03 chlorek niklu(ii) 2 hydrat 0,02 chlorek miedzi(ii) 2 hydrat 0,01 Roztwór ekstraktu drożdżowego sporządzono poprzez rozpuszczenie 20 g suchego ekstraktu drożdżowego w 80 cm 3 wody dejonizowanej, a po uzyskaniu jednorodnej mieszaniny roztwór pasteryzowano w 65 ºC przez 20 min. Analogicznie przygotowano 20% roztwóry glukozy i bursztynianu sodu. Roztwór ekstraktu roślinnego sporządzono poprzez umieszczenie w kolbie miarowej 1 g zliofilizowanego ekstraktu roślinnego, który następnie rozpuszczono 44

w 50 cm 3 wody demineralizowanej i pasteryzowano w 65 ºC przez 20 min, otrzymując ostatecznie roztwór o stężeniu 20 g/dm 3. Do hodowli bakteryjnych izomery chlorotoluenu dodawano w postaci 10% roztworów w acetonie, przygotowanych w kolbach miarowych. Analogicznie sporządzono roztwór etylobenzenu, stosowanego jako standard wewnętrzny podczas analiz chromatograficznych. 4-halogenowe pochodne fenolu do hodowli bakteryjnych dodawano w postaci wodnych roztworów o stężeniu 5 g/dm 3, przygotowanych w kolbach miarowych. Jałowość roztworu zapewniono przez filtrowanie przez jałowy filtr nylonowy 0,2 μm. Analogicznie sporządzono roztwór fenolu, stosowanego jako standard wewnętrzny podczas analiz chromatograficznych. Wszystkie opisane roztwory po przygotowaniu były przechowywane w lodówce w temperaturze 4 C. 3. Izolacja i charakterystyka szczepów bakteryjnych 3.1. Izolacja szczepów bakteryjnych W celu wyizolowania szczepów bakteryjnych zdolnych do degradacji HZA pobrano próbki środowiskowe reprezentujące różne ekosystemy, m. in. glebę z terenu sąsiadującego ze zbiornikami paliw płynnych, glebę z magazynów odpadów węglowodorowych, glebę z terenów rolnych oraz osad czynny z miejskiej oczyszczalni ścieków w Koziegłowach k. Poznania Wymienione próbki środowiskowe pobierano do jałowych butelek i transportowano w temperaturze 10 C. Po przywiezieniu próbek do laboratorium ok. 10 g próbki zawieszano w 100 cm 3 jałowego medium hodowlanego z dodatkiem 2 cm 3 20% roztworu bursztynianu sodu. Po 24 h inkubacji w temperaturze 30 C 10 cm 3 zawiesiny przenoszono do 90 cm 3 jałowego medium i dodano 1,5 cm 3 20% roztworu bursztynianu sodu oraz 0,01 cm 3 mieszaniny halogenowych związków aromatycznych (trzech izomerów chlorotoluenu lub trzech 4-halogenowanych pochodnych fenolu), opisanych w części II w rozdziale 2.3. Pasażowanie hodowli powtarzano co 7 dni, sukcesywnie zmniejszając ilość dodawanego bursztynianu zastępując stopniowo to źródło węgla mieszaniną trzech izomerów chlorotoluenu lub trzech 4-halogenowanych pochodnych fenolu. W konsekwencji, po miesiącu, jedynym źródłem węgla były odpowiednie HZA w stężeniu 40 mg/dm 3. Kontynuowano odświeżanie hodowli co 7 dni przez kolejne 3 miesiące, utrzymując wymienione stężenie HZA. W kolejnym etapie posiewano 0,1 cm 3 hodowli na płytkach z agarem wzbogaconym, a po 24 h inkubacji stosowano posiew redukcyjny w celu wyodrębnienia kolonii poszczególnych szczepów bakteryjnych. 3.2. Charakterystyka wody rzecznej W badaniach biodegradacji halogenowych związków aromatycznych (opisanych w rozdziałach 5.2 oraz 5.3 części II) wykorzystano wodę rzeczną. Próbki wody pobrano z rzeki 45

Warty ze środka nurtu na wysokości mostu św. Rocha w Poznaniu, w maju 2016 roku. W tygodniu przed poborem wody maksymalne dzienne temperatury wahały się między 20 C a 22 C. Woda pobierana była do wyjałowionych wcześniej szklanych butelek. Pobrana woda rzeczna charakteryzowała się ph 7,8±0,1, zawartość suchej masy w 105 C wynosiła 540 mg/dm 3 (oznaczenie wg normy PN-EN 12880:2004 [215]), a pozostałość po wyprażeniu w 600 C 320 mg/dm 3 (oznaczenie wg normy PN-EN 12879:2004 [216]). Analiza biochemiczna (system Vitek 2 ) bakterii obecnych w pobranej wodzie, wykazała, że obecne w niej były mikroorganizmy m.in. z rodzajów Aeromonas, Alcaligenes, Escherichia, Pseudomonas i Sphingomonas. Całkowitą ilość mikroorganizmów w wodzie (w temperaturze 22 C) oznaczono metodą seryjnych rozcieńczeń uzyskując wynik 1 10 6 jtk/cm 3 (±6%). 3.3. Określenie profilu biochemicznego Identyfikację biochemiczną szczepów przeprowadzono z wykorzystaniem systemu Vitek 2. Analiza jest oparta na wprowadzeniu zawiesiny komórek wyizolowanego szczepu na płytkę z zagłębieniami zawierającymi różne źródła węgla. Przyporządkowanie mikroorganizmu do danego gatunku jest w tym systemie oparte na obserwacji przebiegu charakterystycznych reakcji biochemicznych. W analogiczny sposób dokonano identyfikacji szczepów bakteryjnych w wodzie rzecznej z Warty. Identyfikację wykonano w Pracowni Mikrobiologii Wielkopolskiego Centrum Onkologii w Poznaniu pod kierunkiem dr. hab. Zefiryna Cybulskiego. 3.4. Identyfikacja genetyczna i pokrewieństwo filogenetyczne Bakteryjny materiał genetyczny, w celu identyfikacji szczepów, był izolowany z czystych kultur z użyciem DNA Mini Prep Kit (Qiagen, Niemcy). W celu amplifikacji genu 16S rrna został wykorzystany charakterystyczny dla bakterii starter (ang. primer) 8F 5'AGTTTGATCATCGCTCAG3' oraz 1492R 5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'. Amplifikacja była prowadzona według następującego programu temperaturowego: 94 ºC przez 300 s, 3 cykle: 94 ºC (45 s), 57 ºC (30 s), 72 ºC (120 s); 3 cykle: 94 ºC (45 s), 56 ºC (30 s), 72 ºC (120 s); 3 cykle: 94 ºC (45 s), 55 ºC (30 s), 72 ºC (120 s); 26 cykli: 94 ºC (45 s), 53 ºC (30 s), 72 ºC (120 s) z zakończeniem przy 72 ºC przez 300 s. Do sekwencjonowania nukleotydów genu wykorzystano zestaw: Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, Stany Zjednoczone) i analizator AbiPrism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Stany Zjednoczone). Do wyszukiwania homologów został zastosowany program MegaBLAST ze standardowymi ustawieniami. Drzewo pokrewieństwa filogenetycznego zostało sporządzone na podstawie wielkokrotnego przyporządkowania sekwencji (ang. multiple 46

sequence alignments) w programie CLC Free Workbench 4.5.1 (QIAGEN Bioinformatics, Niemcy) [217]. Sekwencje genu 16S rrna poszczególnych szczepów wraz z ich nazwami gatunkowymi zostały zamieszczone w bazie GeneBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, Stany Zjednoczone). Badania wykonano w Katedrze Biochemii Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach pod kierunkiem dr hab. Urszuli Guzik. 3.5. Określenie profilu kwasów tłuszczowych Analizę ilościową błonowych kwasów tłuszczowych badanych szczepów bakteryjnych przeprowadzono według procedury opisanej przez Sassera [218]. W metodzie wykorzystywane są następujące roztwory: - R1: 45 g NaOH, 150 cm 3 metanolu, 150 cm 3 wody dejonizowanej, - R2: 275 cm 3 metanolu, 325 cm 3 6 M HCl, - R3: 200 cm 3 heksanu, 200 cm 3 eteru tert-butylo-metylowego, - R4: 10,8 g NaOH, 900 cm 3 wody dejonizowanej, - R5: nasycony roztwór NaCl w wodzie dejonizowanej. Biomasę do analiz pobierano z dobowych hodowli na podłożu stałym na agarze tryptozowo-sojowym (TSA) inkubowanych w 30 C przez 24 h. 40 mg biomasy bakteryjnej wprowadzano do probówek szklanych (Pyrex z wkładką PTFE, Scilabware, Wielka Brytania). W celu uwolnienia kwasów tłuszczowych z komórki i przekształcenia ich w sole sodowe dodawano 1 cm 3 roztworu R1 i mieszano na wytrząsarce typu worteks przez 20 s. Następnie próbki ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej przez 30 min. Po ochłodzeniu, do probówek dodawano 2 cm 3 roztworu R2, wytrząsano 20 s i ogrzewano w łaźni wodnej w 80 C przez 15 min. Na tym etapie następowało utworzenie estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Po ochłodzeniu i dodaniu 1,25 cm 3 roztworu R3 próbki mieszano delikatnie przez 10 min, aby nastąpiła ekstrakcja estrów metylowych kwasów tłuszczowych do fazy organicznej. Fazę organiczną zbierano i dodawano do niej 3 cm 3 roztworu R4, aby usunąć wolne kwasy tłuszczowe, które nie uległy reakcji estryfikacji. W sytuacji pojawienia się emulsji dodawano 0,2 cm 3 roztworu R5. Fazę organiczną przeniesiono do naczynek chromatograficznych. Próbki analizowano na chromatografie gazowym HP6890 z detektorem płomieniowojonizacyjnym. Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie kapilarnej Ultra-2 (25 m x 0,22 mm x 0,33 nm; 5% fenylo 95% dimetylopolisiloksan), jako fazą stacjonarną oraz wodorem jako gazem nośnym (natężenie przepływu 1 cm 3 /min). Identyfikację estrów metylowych kwasów tłuszczowych prowadzono z wykorzystaniem programu Sherlock 6.1 Microbial Identification System (MIDI Inc., Stany Zjednoczone) i biblioteki TSBA 6.0 [219]. Badania wykonano w Katedrze Biochemii Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach pod kierunkiem dr hab. Urszuli Guzik. 47

W oznaczeniu kwasów tłuszczowych zostosowano często stosowany w literaturze zapis skrócony (np. 14:0 iso, 16:1 ω7c). Liczba przed dwukropkiem oznacza ilość atomów węgla w cząsteczce kwasu tłuszczowego. Z kolei cyfra po dwukropku określa liczbę wiązań podwójnych w łańcuchu. W izomerach iso grupa metylowa podstawiona jest przy drugim od końca metylowego łańcucha acylowego, a w postaci anteiso przy trzecim węglu. Kwasy zawierające grupę cyklopropanową oznaczone są skrótem cyclo. Określenie aldehyd oznacza aldehyd odpowiedniego kwasu tłuszczowego. Położenie wiązania podwójnego oznaczane jest przez podanie numeru węgla (liczonego od końca metylowego) przy którym się znajduje wraz z konformacją cis lub trans. Hydroksykwasy tłuszczowe oznaczone są symbolami 2OH i 3OH, reprezentujące kwasy posiadające grupę hydroksylową przy odpowiednio drugim i trzecim atomie węgla licząc od grupy karbonylowej. Lista zidentyfikowanych kwasów tłuszczowych wraz z ich oznaczeniami została zamieszczona w aneksie A.3. 3.6. Test hemolizy Wszystkie szczepy posiewano redukcyjnie na płytkach z podłożem Columbia zawierającym 5% krwi baraniej. Po 24 h inkubacji w 30 ºC obserwowano kolor i przezroczystość podłoża agarowego w sąsiedztwie kolonii bakteryjnych. Pozwoliło to na ocenę zdolności szczepów do lizy czerwonych ciałek krwi, co może pośrednio świadczyć o zdolności mikroorganizmów do wytwarzania związków powierzchniowo czynnych wydzielanych poza komórkę [220]. 4. Izolacja i charakterystyka ekstraktów roślinnych 4.1. Surowce roślinne Kłącza mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis L.) oraz korę kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum L.) zakupiono jako surowiec zielarski (Flos, Polska). Łupiny tzw. orzechów piorących (Sapindus mucorossi Gaertn.) zakupiono jako środek piorący (EcoShop, Polska). Zawartość suchej masy w surowcach nie była mniejsza niż 95%. 4.2. Ekstrakcja saponin z surowców roślinnych W celu przeprowadzenia ekstrakcji saponin z surowców roślinnych wykorzystano esktrakcję typu ciało stałe ciecz w aparacie Soxhleta, która jest jedną z najpopularniejszych metod izolacji substancji biologicznie aktywnych, m. in. saponin, z tkanek roślinnych [126]. W celu izolacji saponin najczęściej stosowanymi ekstrahentami są alkohole (metanol i etanol) oraz woda. Spośród wymienionych rozpuszczalników metanol wyróżnia się stosunkowo niskim kosztem i łatwością odparowania. Ponadto posiada niższą, od etanolu i wody, temperaturę wrzenia, co zmniejsza ryzyko dezaktywacji i rozkładu związków wrażliwych na 48

temperaturę [221]. W celu uzyskania większej zawartości saponin w ekstrakcie stosowanych jest wiele technik jego oczyszczania, ale są to jednak procesy złożone i angażuje duży nakład środków i pracy [222]. Przed ekstrakcją materiał roślinny rozdrobniono w moździerzu agatowym. Następnie znaną naważkę materiału roślinnego (10 g) przesypano do celulozowej gilzy i umieszczono w aparacie Soxhleta. Ekstrakcję metanolem (w proporcji 100 cm 3 rozpuszczalnika na 10 g surowca) prowadzono przez 8 h. Po ekstrakcji rozpuszczalnik odparowano na wyparce próżniowej, a suchą pozostałość mrożono i liofilizowano przez jedną dobę przy ciśnieniu 37 Pa. Wydajność ekstrakcji wyliczano odnosząc masę otrzymanego ekstraktu do masy wykorzystanego do ekstrakcji surowca roślinnego. 4.3. Analizy spektroskopowe ekstraktów Widma w zakresie podczerwieni (od 400 cm -1 do 4000 cm -1 ) wykonano na spektrometrze podczerwieni z transformacją Fouriera. Próbki ekstraktów analizowano w postaci pastylki bromku potasu (2 mg ekstraktu na 200 mg bromku potasu). Analizę spektrofotometryczną w zakresie nadfioletu oraz światła widzialnego (od λ = 200 nm do λ = 600 nm) wykonano na spektrofotometrze UV-Vis. Badaniu poddano roztwór danego ekstraktu o stężeniu 0,1 g/dm 3. 4.4. Ocena całkowitej zawartości saponin Saponiny zawarte w tkankach roślin stanowią mieszaninę związków różniących się strukturą aglikonu oraz części cukrowej. Utrudnia to w znacznym stopniu precyzyjną analizę ilościową zawartości saponin. Jedną z metod wykorzystywanych do pomiaru całkowitej zawartości saponin w ekstraktach roślinnych jest metoda kolorymetryczna opisana przez Hiai i in. [223]. Oparta jest ona na wytworzeniu barwnego kompleksu saponin w reakcji z waniliną w obecności kwasu siarkowego. Intensywność zabarwienia, określona poprzez pomiar absorbancji, jest proporcjonalna do zawartości saponin w próbce. W ocenie zawartości saponin należy uwzględnić różnice we współczynniku ekstynkcji kompleksu saponin z waniliną w zależności od struktury części aglikonowej. Stąd krzywą wzorcową zawartości saponin wykonano dla ich mieszaniny zawartej w preparacie handlowym saponin z kory Quillaja saponaria, dla którego producent deklaruje zwartość części aglikonowej saponin (sapogenin) na nie mniej niż 10%. Do probówek o objętości 2 cm 3 wprowadzano 1,0 cm 3 72% kwasu siarkowego(vi), 0,1 cm 3 8% roztworu waniliny w bezwodnym etanolu oraz 0,1 cm 3 roztworu badanego ekstraktu roślinnego o stężeniu 1 g/dm 3. Próbki inkubowano przez 10 min w 60 C, a po ich ochłodzeniu do temperatury 20 C, wykonywano pomiar absorbancji przy długości fali 544 nm. 49

Na podstawie krzywej wzorcowej wykonanej dla ekstraktu saponin z kory Quillaja saponaria, oszacowano zawartość saponin w badanych ekstraktach roślinnych. 4.5. Wyznaczenie parametrów adsorpcji Ocenę właściwości powierzchniowo czynnych otrzymanych ekstraktów wykonano na podstawie pomiarów napięcia powierzchniowego roztworów wodnych ekstraktów, które prowadzono metodą Du Noüy a z pierścieniem platynowym. Otrzymane wyniki wykorzystano do wyznaczenia parametrów adsorpcji surfaktantów na powierzchni roztworu w oparciu o równanie Szyszkowskiego [224], które jest szczególnym przypadkiem izotermy adsorpcji Gibbsa (równanie II.1). Sz c 0 1 BSz ln 1 (II.1) ASz gdzie: γ Sz napięcie powierzchniowe roztworu surfaktantu o stężeniu c [N/m], γ0 napięcie powierzchniowe w układzie woda/powietrze [N/m], c stężenie surfaktantu [mol/dm 3, M], ASz, BSz współczynniki Szyszkowskiego [-]. Równanie Szyszkowskiego pozwala oszacować podstawowe parametry adsorpcji: a) energię swobodną adsorpcji, która równa jest różnicy wartości standardowego potencjału chemicznego substancji w fazie objętościowej i na granicy faz: -ΔGads = RT ln Asz (II.2) gdzie: -ΔGads energia swobodna adsorpcji [kj/mol], R uniwersalna stała gazowa: 8,314 [J/(mol K)], T temperatura [K], ASz współczynnik Szyszkowskiego z równania II.1 [-]. b) nadmiar powierzchniowy na nasyconej granicy faz, który określa stan wysycenia powierzchni przez zaadsorbowane cząsteczki: 0 B Sz RT (II.3) gdzie: Γ nadmiar powierzchniowy na nasyconej granicy faz [mol/m 2 ], γ0 napięcie powierzchniowe w układzie woda/powietrze [N/m], BSz współczynnik Szyszkowskiego z równania II.1 [-], R uniwersalna stała gazowa: 8,314 [J/(mol K)], T temperatura [K]. 50

c) minimalną powierzchnię zajmowaną przez statystyczną zaadsorbowaną cząsteczkę na nasyconej granicy faz, która pozwala ocenić orientację zaadsorbowanej cząsteczki na granicy faz, upakowanie cząsteczek oraz ich wzajemne oddziaływania w warstwie adsorpcyjnej: 1 Amin (II.4) N a gdzie: Amin minimalna powierzchnia zajmowana przez statystyczną zaadsorbowaną cząsteczkę na nasyconej granicy faz [m 2 ], nadmiar powierzchniowy na nasyconej granicy faz [mol/m 2 ], Na liczba Avogadro: 6,023 10 23 [1/mol]. 4.6. Test emulsyfikacji Zdolność badanych ekstraktów do tworzenia układów emulsyjnych została zbadana za pomocą testu emulsyfikacji zaproponowanego przez Sneha i wsp. [225]. Metoda ta zakłada, że wzrost gęstości optycznej emulsji jest proporcjonalny do wzrostu rozproszenia fazy organicznej w roztworze wodnym. Do szklanych probówek o objętości 20 cm 3 wprowadzono po 6 cm 3 roztworów ekstraktów o stężeniach odpowiadających 2, 1 oraz 0,5 krytycznego stężenia micelizacji (CMC). Próbę odniesienia stanowiła próba z wodą demineralizowaną. Następnie dodawano do próbek po 0,02 cm 3 heksadekanu i wytrząsano je przez 20 min (25 C, 350 obr./min). Pomiarów gęstości optycznej utworzonej emulsji dokonano przy długości fali 550 nm. 4.7. Skaningowa mikroskopia elektronowa Obserwacja morfologii powierzchni zliofilizowanych ekstraktów była prowadzona za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego sprzężonego ze spektrometrem dyspersji energii z oprogramowaniem NSS Spectral Imaging System. Analizy wykonano w Instytucie Chemii i Elektrochemii Technicznej Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej pod kierunkiem dr. hab. inż. Piotra Krawczyka. 4.8. Toksyczność ekstraktów roślinnych wobec badanych szczepów Ocenę wpływu badanych ekstraktów z owoców S. mukorossi, kory kasztanowca zwyczajnego oraz kłącza mydlnicy lekarskiej na badane szczepy bakteryjne określono na podstawie pomiaru aktywności metabolicznej komórek. Zasada działania testu opiera się na redukcji żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H tetrazoliowego (skrót z ang. MTT) do fioletowego produktu reakcji, która jest katalizowana przez enzymy wewnątrzkomórkowe należące do klasy oksydoreduktaz. Intensywność fioletowej barwy mierzona spektrofotometrycznie jest proporcjonalna do aktywności 51

metabolicznej komórek, co stanowi pośredni wskaźnik ilości żywych komórek w analizowanej próbce [226]. Do analiz wykorzystano zawiesinę komórek danego szczepu z hodowli prowadzonych w 50 cm 3 medium zawierających glukozę o stężeniu 0,4 g/dm 3. Po zwirowaniu (5000 g, 10 min, 20 ºC) komórki zawieszono w medium hodowlanym uzyskując zawiesinę komórek o gęstości optycznej równej 1,0 (pomiar przy λ = 550 nm). Do probówek typu Eppendorf (o objętości 2,0 cm 3 ) dodawano kolejno 0,2 cm 3 roztworu MTT (5 g/dm 3 ), 0,1 cm 3 zawiesiny komórek oraz wyjściowy roztwór ekstraktu, w takiej ilości aby uzyskać końcowe stężenie w próbce odpowiadające 3 CMC, 2 CMC lub 1 CMC. Następnie uzupełniano próby medium hodowlanym do objętości 1,0 cm 3 i inkubowano w 30 C. Próbę kontrolną dla każdego szczepu stanowiła próba nie zawierająca HZA, z samym tylko medium hodowlanym. Po 24 h inkubacji odwirowano próbki (15000 g, 10 min, 10 ºC), zlano supernatant, a osad rozpuszczano w 2 cm 3 propan-1-olu. Następnie zbadano absorbancję przy długości fali 560 nm. Zmierzone wartości absorbancji odnoszono do wartości uzyskanej dla próby kontrolnej, dla której przyjęto względną wartość aktywności metabolicznej komórek równą 100%. 4.9. Identyfikacja struktury chemicznej saponin Identyfikację saponin obecnych w ekstrakcie z owoców Sapindus mukorossi wykonano z użyciem chromatografu cieczowego sprzężonego z tandemowym spektrometrem mas. Zliofilizowany ekstrakt rozpuszczono w wodzie i oczyszczono z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej na kolumience ze złożem krzemionkowym z powierzchniowymi grupami oktadecylowymi. Frakcja zawierająca saponiny została wymyta 30% roztworem metanolu. Analiza chromatograficzna została wykonana na aparacie HPLC Ultimate 3000 sprzężonym ze spektrometrem mas QTRAP 4000 pracującym w trybie jonów dodatnich w celu identyfikacji adduktów sodowych. Zastosowano kolumnę Gemini-NX C18 (100 mm 2,0 mm; 3 µm) firmy Phenomenex (Torrance, Stany Zjednoczone) przy przepływie fazy ruchomej 0,4 cm 3 /min. Faza ruchoma była sporządzona z 0,1% roztworów kwasu mrówkowego w wodzie i acetonitrylu. Wyznaczenie dokładnej masy jonów oparto na systemie Acquity UPLC sprzężonym ze spektrometrem mas microtof-q pracującym w trybie jonów ujemnych z kolumną Zorbax Eclipse XDB-C18 (2,1 x 150 mm; 3,5 µm) firmy Agilent (Palo Alto, Stany Zjednoczone) z przepływem fazy ruchomej 0,6 cm 3 /min. Faza ruchoma była sporządzona z 0,05% roztworów kwasu mrówkowego w wodzie i acetonitrylu. Analizy wykonano w Instytucie Chemii i Elektrochemii Technicznej Politechniki Poznańskiej oraz Europejskim Centrum Bioinformatyki i Genomiki w Poznaniu pod kierunkiem dr hab. inż. Agnieszki Zgoła- Grześkowiak. 52

5. Biodegradacja halogenowych związków aromatycznych 5.1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego Inokulum bakteryjne przygotowywano poprzez wprowadzenie do 50 cm 3 medium hodowlanego biomasy bakteryjnej, pobranej z płytki agarowej za pomocą jałowej ezy. Jako źródła węgla zastosowano glukozę, której stężenie w hodowli wyniosło 0,2 g/dm 3. Tak sporządzony roztwór inkubowano 24 h w temperaturze 30 C. 5.2. Biodegradacja 4-halogenowanych fenoli Badania biodegradacji HZA, rozumianej jako zanik w hodowli oznaczanego związku chemicznego, prowadzonej przez wyizolowane szczepy bakteryjne realizowano z wykorzystaniem trzech różnych pochodnych fenolu: 4-fluorofenolu, 4-chlorofenolu oraz 4-bromofenolu. Związki te należą do jednych z częściej wykorzystywanych w przemyśle. Przykłady ich zastosowań oraz zagrożenia związane z ich obecnością w środowisku zostały przedstawione w części I pracy w rozdziale 1. Ponadto analiza wyników biodegradacji dla tych trzech związków pozwala porównać wpływ rodzaju podstawnika halogenowego na biodegradowalność tych związków i zachodzące w ich obecności zmiany we właściwościach powierzchniowych komórek bakteryjnych. Biodegradację 4-halogenowanych fenoli prowadzono w hodowlach płynnych z następującymi szczepami bakteryjnymi: - Raoultella planticola WS2, - Achromobacter sp. SA1, - Pseudomonas sp. OS4, - Microbacterium resistens MChC. Test biodegradacji 4-fluorofenolu, 4-chlorofenolu i 4-bromofenolu prowadzono w zakręcanych szklanych butelkach Duran Schott (Niemcy) o objętości 250 cm 3. Hodowle zawierały daną 4-halogenowaną pochodną fenolu w stężeniu 20 mg/dm 3. Hodowle prowadzono w dwóch seriach pierwszej z hodowlami nie zawierającymi ekstraktu z owoców S. mukorossi i drugiej, z hodowlami zawierającymi ekstrakt w stężeniu odpowiadającym 1 CMC. Hodowle zaszczepiano 5 cm 3 inokulum bakteryjnego (OD550 = 1,0; ok. 1 10 9 jtk/cm 3 ) i dopełniano do objętości 50 cm 3 medium hodowlanym. Inkubację prowadzono w temperaturze 30 C na wytrząsarce orbitalnej (90 obr./min) przez 25 dni. Kontrolę stanowiły próby abiotyczne, o składzie identycznym jak hodowle bakteryjne. W celu określenia biodegradacji halogenowanych pochodnych fenolu w warunkach zbliżonych do istniejących w środowisku naturalnym przeprowadzono badania z wykorzystaniem wody rzecznej, pobranej według opisu przedstawionego w rozdziale 3.2. 53

Biodegradację 4-fluorofenolu, 4-chlorofenolu oraz 4-bromofenolu, przy stężeniu początkowym w hodowli 20 mg/dm 3 prowadzono w dwóch różnych układach: a) wody rzecznej zawierającej autochtoniczne mikroorganizmy, b) wody rzecznej zaszczepionej dodatkowo szczepem R. planticola WS2, który na wcześniejszych etapach badań wykazywał wysoką zdolność do biodegradacji 4-halogenowanych pochodnych fenolu (na każde 90 cm 3 wody rzecznej dodawano 10 cm 3 inokulum bakteryjnego zawierącego ok. 1 10 7 jtk/cm 3 ). Wszystkie układy hodowlane były realizowane w dwóch seriach z dodatkiem ekstraktu z S. mukorossi w stężeniu odpowiadającym 1 CMC oraz niezawierających ekstraktu roślinnego. Hodowle w warunkach tlenowych prowadzono przez 21 dni w temperaturze 22 C w bioreaktorze BIOSTAT B Plus o objętości 1500 cm 3. Do analiz ilościowych zawartości 4-halogenowanych fenoli pobierano w warunkach jałowych po 0,2 cm 3 hodowli. Próbkę rozcieńczano pięciokrotnie 90% roztworem metanolu i oczyszczano przepuszczając przez jałowy filtr 0,2 μm. Przed analizą próbki przechowywano w zamkniętych naczynkach chromatograficznych w 4 C. Analizę ilościową biodegradowanych związków przeprowadzono za pomocą wysokosprawnego chromatografu cieczowego UltiMate 3000 sprzężonego ze spektrometrem mas. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie XBridge Phenyl (50 mm 3,0 mm; 2,5 µm) firmy Waters (Milford, Stany Zjednoczone), przy przepływie fazy ruchomej 0,3 cm 3 /min i nastrzyku 5 µl próbki. Kolumnę termostatowano w temperaturze 35 ºC. Fazę ruchomą w analizie halogenowych pochodnych fenoli stanowiła mieszanina dwóch składników, którymi były: - faza A: roztwór octanu amonu w wodzie o stężeniu 5 10-3 mol/dm 3, - faza B: metanol. Zastosowano elucję gradientową od 50% fazy B do 100% fazy B przez 2 min i utrzymanie 100% udziału fazy B przez 2 min. Czas analizy wynosił 4 minuty. Eluat z kolumny kierowano bezpośrednio przez źródło jonów z elektrorozpraszaniem do spektrometru mas. Źródło jonów pracowało w trybie analizy jonów ujemnych. W trakcie analizy zastosowano następujące parametry dla źródła i spektrometru mas: ciśnienie gazu osłonowego 10 psi (69 kpa), ciśnienie gazu nebulizującego 45 psi (310 kpa), ciśnienie gazu pomocniczego 45 psi (310 kpa), temperatura 450 C, przyłożone napięcie elektrorozpraszania -4500 V, potencjał desolwatacji -40 V i gaz kolizyjny na poziomie średnim. Spektrometr mas pracował w trybie monitorowania wybranych reakcji fragmentacji. Parametry oznaczania poszczególnych związków przedstawiono w tabeli II.5. Czas pomiaru dla każdej reakcji był ustawiony na 100 ms. Pomiary zostały wykonane w Instytucie Chemii i Elektrochemii Technicznej Wydziału 54

Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej pod kierunkiem dr hab. inż. Agnieszki Zgoła-Grześkowiak. Tabela II.5. Warunki oznaczania halogenowych pochodnych fenolu techniką MS/MS oznaczany związek / wzorzec przejście MRM [m/z] energia zderzeń [V] przejście MRM [m/z] energia zderzeń [V] Fenol 93 93-5 93 65-30 4-fluorofenol 111 91-25 111 63-31 4-chlorofenol 127 91-24 127 35-36 4-bromofenol 171 79-29 173 81-30 5.3. Biodegradacja izomerów chlorotoluenu Kolejny etap badań obejmował badania biodegradacji trzech izomerów chlorotoluenu przez wyizolowane szczepy bakteryjne. 2-chlorotoluen, 3-chlorotoluen oraz 4-chlorotoluen są powszechnie wykorzystywane w syntezie chemicznej i jako rozpuszczalniki, przy czym pod względem produkcji największy udział posiada izomer orto. Przykłady zastosowań izomerów chlorotoluenu oraz zagrożenia związane z ich obecnością w środowisku zostały przedstawione w części I pracy w rozdziale 1. Izomery chlorotoluenu są związkami hydrofobowymi o niskiej rozpuszczalności w wodzie. Wybór tych trzech izomerów do badań pozwala zanalizować wpływ położenia podstawnika (atomu chloru) na biodegradowalność tych związków i zachodzące w ich obecności zmiany we właściwościach powierzchniowych komórek bakteryjnych. Biodegradację izomerów chlorotoluenu przeprowadzono w hodowlach z następującymi szczepami bakteryjnymi: - Achromobacter sp. KW1, - Rahnella aquatilis DA2, - Raoultella planticola SA2, - Pseudomonas sp. MChB. Test biodegradacji 2-chlorotoluenu, 3-chlorotoluenu oraz 4-chlorotoluenu prowadzono w zakręcanych szklanych butelkach Duran firmy Schott (Niemcy) o objętości 250 cm 3. Hodowle zawierały dany izomer chlorotoluenu w stężeniu 40 mg/dm 3. Hodowle prowadzono w dwóch seriach pierwszej z hodowlami nie zawierającymi ekstraktu z owoców S. mukorossi i drugiej, z hodowlami zawierającymi ekstrakt w stężeniu odpowiadającym 1 CMC. Hodowle zaszczepiano 5 cm 3 inokulum bakteryjnego (OD550 = 1,0; ok. 1 10 9 jtk/cm 3 ) i dopełniano do objętości 20 cm 3 medium hodowlanym. Inkubację w warunkach tlenowych w temperaturze 30 C na wytrząsarce orbitalnej (90 obr./min) prowadzono przez 21 dni. Równolegle prowadzono kontrole abiotyczne, o składzie identycznym jak hodowle bakteryjne, jednak nie zaszczepiane 55

mikroorganizmami. Jako standard wewnętrzny stosowano etylobenzen. Kontrolę stanowiły próby abiotyczne, o składzie identycznym jak hodowle bakteryjne. W celu określenia biodegradacji izomerów chlorotoluenu w warunkach zbliżonych do istniejących w środowisku naturalnym przeprowadzono badania z wykorzystaniem wody rzecznej, pobranej według opisu przedstawionego w rozdziale 3.2. Biodegradację 2-chlorotoluenu, 3-chlorotoluenu oraz 4-chlorotoluenu, przy stężeniu początkowym w hodowli 40 mg/dm 3 prowadzono w dwóch różnych układach: a) wody rzecznej zawierającej autochtoniczne mikroorganizmy, b) wody rzecznej zaszczepionej dodatkowo szczepem Achromobacter sp. KW1, który na wcześniejszych etapach badań wykazywał wysoką zdolność do biodegradacji 4-halogenowanych pochodnych fenolu (na każde 90 cm 3 wody rzecznej dodawano 10 cm 3 inokulum bakteryjnego zawierącego ok. 1 10 7 jtk/cm 3 ). Wszystkie układy hodowlane były realizowane w dwóch seriach z dodatkiem ekstraktu z S. mukorossi w stężeniu odpowiadającym 1 CMC. Hodowle o objętości 200 cm 3 w warunkach tlenowych prowadzono przez 21 dni w temperaturze 22 C w szklanych bioreaktorach o objętości 1000 cm 3. Zawartość badanych związków w hodowlach określono po 7, 14 oraz 21 dniach. W tych dniach liczonych od założenia hodowli, butelki zamrażano w temperaturze -20 C, w celu zatrzymania procesu biodegradacji. Po 24 h do butelek wprowadzano dichlorometan (w stosunku objętościowym do hodowli 1:2). Jako standard wewnętrzny dodawano 0,02 cm 3 roztworu etylobenzenu w dichlorometanie (40 mg/cm 3 ). Po rozmrożeniu fazy wodnej próby wytrząsano przez 0,5 min, a po rozdzieleniu faz pobierano fazę organiczną do naczyniek chromatograficznych. Próbki suszono dodając do nich ok. 5 mg bezwodnego siarczanu(vi) magnezu(ii). Analizę ilościową zawartości biodegradowanych związków przeprowadzono z wykorzystaniem chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas Pegasus 4D GCxGC-TOFMS z kolumną BPX-5 (28 m 250 µm; 0,25 µm) firmy SGE Analytical Science (Stany Zjednoczone). Jako gaz nośny wykorzystano hel (1 cm 3 /min). Analizę prowadzono przez 13,5 min w warunkach programowanego wzrostu temperatury (50 C przez 3 min, następnie wzrost 12 C/min do 140 C, końcowa temperatura utrzymana przez 3 min). 6. Właściwości powierzchniowe komórek 6.1. Przygotowanie zawiesiny komórek do pomiarów Hodowle bakteryjne, przeznaczone do badań właściwości powierzchniowych komórek, zostały przygotowane w analogiczny sposób jak hodowle do testów biodegradacji (opisane w rozdziałach 5.2 oraz 5.3). Próbę odniesienia dla każdego szczepu stanowiły hodowle 56

z glukozą (0,4 g/dm 3 hodowli) jako jedynym źródłem węgla. Po 7 dniach odwirowano biomasę z poszczególnych hodowli (10 min, 8000 g, 10 C). Supernatant zlewano, a osad (biomasę) dwukrotnie przemywano jałowym medium hodowlanym. Następnie biomasę zawieszano w 5 cm 3 medium. W razie konieczności zawiesinę rozcieńczano, aby wartość gęstości optycznej przy λ = 600 nm mieściła się w zakresie 1,0 1,2 (ok. 1 10 9 jtk/cm 3 ). Tak przygotowana zawiesina komórek była wykorzystywana do oznaczenia mikrobiologicznej adhezji do węglowodorów, potencjału dzeta oraz przepuszczalności wewnętrznej błony komórkowej. 6.2. Mikrobiologiczna adhezja do węglowodorów W celu oznaczenia powinowactwa komórek bakterii do związków hydrofobowych zastosowano metodę mikrobiologicznej adhezji do węglowodorów opisaną po raz pierwszy przez Rosenberga [227]. Po pomiarze gęstości optycznej przy λ = 600 nm (OD0), 5 cm 3 zawiesiny komórek wprowadzano do probówek o objętości 10 cm 3 i dodawano 0,5 cm 3 heksadekanu. Całość wytrząsano przez 2 min na wytrząsarce typu vortex. Próby pozostawiano do całkowitego rozdziału faz, a następnie ponownie mierzono gęstość optyczną fazy wodnej (OD1). Wartość mikrobiologicznej adhezji do węglowodorów dla komórek bakteryjnych z każdej hodowli wyliczano z wzoru II.5. AKW = [(OD 0 OD 1 )/OD 0 ] 100% (II.5.) gdzie: OD0 gęstość optyczna zawiesiny komórek w fazie wodnej przy długości fali 600 nm, mierzona przed wytrząsaniem z heksadekanem [-], OD1 gęstość optyczna zawiesiny komórek w fazie wodnej przy długości fali 600 nm, mierzona po wytrząsaniu z heksadekanem i rozdzieleniu się faz [-], AKW mikrobiologiczna adhezja komórek do węglowodorów [%]. 6.3. Potencjał dzeta Potencjał dzeta, nazywany także potencjałem elektrokinetycznym, jest parametrem charakteryzującym układy koloidalne, którego wartość związana jest z obecnością na granicy międzyfazowej podwójnej warstwy elektrycznej. Wokół cząstki ciała stałego zawieszonej w roztworze elektrolitu pojawia się nadmiar jonów o ładunku dodatnim lub ujemnym, co przekłada się na różnicę potencjałów między podwójną warstwą elektryczną otaczającą cząstkę a otaczającym ją roztworem [100]. Wartość potencjału dzeta świadczy m. in. o stabilności układu koloidalnego, ponieważ im wyższa bezwzględna wartość potencjału dzeta tym mniejsza tendencja cząstek do agregacji i sedymentacji [228]. Potencjał dzeta, definiowany najczęściej w układach koloidalnych, może stanowić również istotny parametr do oceny właściwości powierzchniowych komórek mikroorganizmów [229]. 57

Zawiesinę komórek wprowadzano do kuwety o objętości 1 cm 3, wyposażonej w dwie elektrody. Kuwetę umieszczano następnie w aparacie Zetasizer Nano ZS. Wartość potencjału dzeta wyliczano na podstawie równania Smoluchowskiego [100]. 6.4. Przepuszczalność wewnętrznej błony komórkowej Przepuszczalność wewnętrznej błony komórkowej określono na podstawie ilości uwalnianego przez błonę komórkową cytoplazmatycznego enzymu (β-galaktozydazy). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy (rysunek II.1.) orto-nitrofenylo-β-galaktozydu (skrót z ang. ONPG), a stężenie powstającego barwnego produktu (2-nitrofenolu) może być mierzone spektrofotometrycznie. Ilość powstającego 2-nitrofenolu pozwala ocenić stężenie uwalnianej β-galaktozydazy, proporcjonalne do przepuszczalności wewnętrznej błony komórkowej [83]. Rysunek II.1. Reakcja katalizowana przez β galaktozydazę [230] Pierwszym etapem oznaczenia był pomiar gęstości optycznej zawiesiny komórek przy długości fali 550 nm (OD550) na spektrofotometrze V-650. Następnie do 2 cm 3 zawiesiny dodawano 0,1 cm 3 roztworu ONPG (30 mmol/dm 3 ). Próby inkubowano w 30 C przez 2 godziny (t = 120 min). Następnie zawiesinę odwirowano (5 min, 4000 g) i dokonano pomiaru absorbancji supernatantu przy λ = 415 nm (maksimum absorbcji 2-nitrofenolu), dla której molowy współczynnik ekstynkcjiwynosi 4500 M/cm. Wyliczając stężenie 2-nitrofenolu z równania Lamberta-Beera można określić przepuszczalność błony komórkowej (PBK) według równania II.6. PBK = c OD 550 t (II.6.) gdzie: PBK przepuszczalność wewnętrznej błony komórkowej [M/min], c stężenie powstałego 2-nitrofenolu [mol/dm 3, M], OD550 gęstość otyczna zawiesiny komórek przy długości fali 550 nm [-], t czas inkubacji próbek [min]. 7. Analiza statystyczna wyników Wszystkie pomiary były wykonywane w trzech powtórzeniach, dla których wyliczano średnią arytmetyczną oraz wariancję i odchylenie standardowe. Sprawdzenia istotności różnic 58

między dwiema seriami pomiarów dokonywano za pomocą testu t-studenta. W przypadkach, kiedy wariancje porównywanych serii pomiarowych nie były równe stosowano poprawkę Cochrana-Coxa [231]. Kolejny etap analizy statystycznej wyników miał na celu sprawdzenie czy istnieją statystycznie istotne zależności pomiędzy wartościami biodegradacji a wartościami poszczególnych właściwości powierzchniowych komórek: adhezji komórek do węglowodorów (AKW), potencjału dzeta (ζ) i przepuszczalności wewnętrznej błony komórkowej (PBK). Porównania dokonywano w obrębie czterech grup wyników: A - hodowle 4 szczepów z 4-halogenowanymi fenolami, B - hodowle 4 szczepów z izomerami chlorotoluenu, C - hodowle 8 szczepów bez ekstraktu roślinnego, D - hodowle 8 szczepów z dodatkiem ekstraktu roślinnego. Każdą grupę rozważano w dwóch wariantach: I - z wartościami bezwzględnymi parametrów AKW, ζ lub PBK; celem porównania wyników w tym wariancie była odpowiedź na pytanie: "Czy w obrębie danej serii wyników istnieje korelacja miedzy wartością bezwzględną danego parametru (AKW, ζ lub PBK) a biodegradacją?" II - z wartościami skorygowanymi parametrów AKW, ζ lub PBK (wartość skorygowana jest tutaj rozumiana jako różnica między wartością bezwzględną danego parametru uzyskaną dla komórek w danej hodowli a wartością danego parametru zmierzoną w próbie odniesienia, czyli w hodowli na glukozie); celem porównania wyników w tym wariancie była odpowiedź na pytanie: "Czy w obrębie danej serii wyników istnieje korelacja miedzy wartością skorygowaną danego parametru (AKW, ζ lub PBK) a biodegradacją?" W rezultacie analizom statystycznym poddano 8 serii wyników (A_I, A_II, B_I, itd.). W pierwszej kolejności za pomocą testu W Shapiro-Wilka dokonywano ustalenia, czy wartości danego parametru w obrębie danej serii wyników mają rozkład normalny. W sytuacji, gdy zarówno wyniki danego parametru oraz biodegradacji w danej serii miały rozkład normalny korelację ustalano na postawie wyliczonych współczynników korelacji Pearsona. Jeśli wyniki danego parametru oraz biodegradacji w danej serii nie miały rozkładu normalnego, analizowano korelacje nieparametryczne na postawie wyliczonych współczynników R Spearmana. We wszystkich analizach przyjęto poziom istotności α równy 0,05 [231]. Obliczenia wykonano za pomocą oprogramowania Statistica 12.5. Wykresy prezentowane w pracy wykonano za pomocą oprogramowania Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corp., Stany Zjednoczone). 59

III. OPIS I DYSKUSJA WYNIKÓW 1. Charakterystyka szczepów bakteryjnych 1.1. Charakterystyka biochemiczna i identyfikacja genetyczna mikroorganizmów Z próbek gleb z terenu sąsiadującego ze zbiornikami paliw płynnych, z magazynów odpadów węglowodorowych i z terenów wiejskich oraz osadu czynnego z miejskiej oczyszczalni ścieków w Koziegłowach k. Poznania wyizolowano dziewiętnaście szczepów bakteryjnych niebędących patogenami. W przypadku ośmiu z nich stwierdzono zdolność do przeżycia na pożywce zawierającej halogenowane związki aromatyczne, jako jedyne źródło węgla. W tabeli III.1. zestawiono przynależność gatunkową tych szczepów, określoną na podstawie analizy frakcji 16S rybosomalnego RNA. Sekwencje nukleotydów 16S rybosomalnego RNA zostały opublikowane w bazie GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, Stany Zjednoczone). Tabela III.1. Przynależność gatunkowa szczepów bakteryjnych wykorzystywanych w badaniach biodegradacji halogenowanych związków aromatycznych lp. symbol szczepu identyfikacja genetyczna numer w bazie GenBank NCBI 1. WS2 Raoultella planticola WS2 KP096507 2. SA1 Achromobacter sp. SA1 KP096514 3. OS4 Pseudomonas sp. OS4 KP096512 4. MChC Microbacterium resistens MChC KU563538 5. KW1 Achromobacter sp. KW1 KP096516 6. DA2 Rahnella aquatilis DA2 KP096518 7. SA2 Raoultella planticola SA2 KP096517 8. MChB Pseudomonas sp. MChB KU563540 Spośród szczepów bakteryjnych wymienionych w tabeli III.1. cztery szczepy o numerach od 1 do 4 były zdolne do wzrostu w obecności mieszaniny 4-halogenowych pochodnych fenolu, jako jedynego źródła węgla. Badania wstępne kolejnych czterech szczepów bakteryjnych (oznaczonych numerami od 5 do 8) wykazały, że możliwy był ich wzrost w obecności mieszaniny izomerów chlorotoluenu, jako jedynego źródła węgla. 60

Identyfikacja genetyczna szczepów wiązała się z określeniem ich pokrewieństwa filogenetycznego z innymi szczepami bakteryjnymi, dla których sekwencje nukleotydów są zdeponowane w bazie GenBank NCBI. W aneksie A.1 zostały przedstawione wykresy pokrewieństwa filogenetycznego dla wszystkich szczepów bakteryjnych wykorzystywanych w badaniach. Wytypowane do dalszych badań szczepy bakteryjne należą do mikroorganizmów powszechnie występujących w środowisku naturalnym i zaliczane są do obligatoryjnych lub fakultatywnych tlenowców. Szczepy z rodzajów Pseudomonas, Achromobacter, Raoultella oraz Rahnella to bakterie Gram-ujemne, a z rodzaju Microbacterium należą do bakterii Gramdodatnich. Określenie profilu biochemicznego szczepów bakteryjnych polegało na weryfikacji, czy badany szczep był zdolny do przeprowadznia wybranych reakcji asymilacji związków organicznych, takich jak kwas L-jabłkowy, sacharoza czy D-glukoza, wydzielania siarkowodoru, produkcji enzymów, np. α-glukozydazy, ureazy i in. Informacje o zachodzeniu charakterystycznych reakcji biochemicznych (profile biochemiczne) dla badanych szczepów zostały przedstawione w aneksie A.2. Do cech wspólnych dla wszystkich badanych szczepów należy brak wytwarzania siarkowodoru, lipazy czy β-glukuronidazy. Żaden ze szczepów nie wykazywał asymilacji L-arabitolu oraz D-tagatozy. Jednocześnie wszystkie szczepy zobojętniały kwas L-mlekowy. Między poszczególnymi szczepami, także w obrębie szczepów należących do tego samego rodzaju, występowały istotne różnice w profilu biochemicznym. Szczep R. planticola SA2 wyróżniał się spośród innych produkcją β-n-acetylgalaktozoaminidazy, ureazy i dekarboksylazy lizyny, asymilacją adonitolu oraz brakiem zdolności do produkcji L-prolino-arylamidazy. M. resistens MChC, w przeciwieństwie do pozostałych szczepów, produkował α-glukozydazę i β-alanino-arylamidazę-pna, a równocześnie nie zobojętniał kwasu bursztynowego i asymilował cytrynianu sodu oraz nie wykazywał oporności na 2,4-diamino-6,7-diizopropylopterydynę. Z kolei Pseudomonas sp. OS4, jako jedyny spośród analizowanych szczepów bakteryjnych, wytwarzał kwas L-mlekowy. 1.2. Profil kwasów tłuszczowych błony komórkowej Dla każdego szczepu bakteryjnego, na podstawie analizy chromatograficznej opisanej w rozdziale II.4.5., określono profil kwasów tłuszczowych obecnych w błonie komórkowej. Wyniki zawartości procentowej poszczególnych kwasów tłuszczowych dla każdego szczepu zostały przedstawione w tabeli III.2. 61

Tabela III.2. Zawartość kwasów tłuszczowych w błonie komórkowej badanych szczepów bakteryjnych (uwzględniono tylko te kwasy tłuszczowe, których średnia zawartość wynosiła więcej niż 1,0%); pełne nazwy zidentyfikowanych kwasów tłuszczowych zostały zamieszczone w aneksie A.3 symbol kwasu tłuszczowego zawartość w błonie komórkowej szczepu [%] SA2 WS2 DA2 SA1 MChB MChC OS4 KW1 10:0 3OH 4,7±0,2 12:0 3,2±0,1 3,5±0,1 2,0±0,1 12:0 2OH 5,2±0,1 12:0 3OH 4,5±0,1 1,0±0,1 12:0 aldehyd 1,9±0,1 6,9±0,3 2,0±0,5 8,4±0,1 13:0 iso 8,5±0,2 14:0 6,8±0,2 5,5±0,1 4,3±0,1 1,0±0,1 9,8±0,1 14:0 3OH 6,2±0,3 14:0 iso 4,1±0,7 15:0 anteiso 3,8±0,3 58,7±1,2 39,8±0,3 15,4±0,8 15:0 iso 22,5±0,5 1,8±0,2 6,0±0,1 16:0 27,0±0,9 31,1±0,1 7,1±0,5 1,8±0,1 29,2±0,2 0,9±0,1 13,2±0,7 30,6±0,4 16:0 iso 6,7±0,1 7,5±0,9 8,4±0,1 20,5±0,3 1,9±0,1 16:1 iso ω7c 2,0±0,5 16:1 ω7c 17,9±0,4 24,7±0,5 8,9±0,5 25,2±0,4 3,2±0,2 24,1±0,1 17:0 3,3±0,1 1,7±0,1 17:0 anteiso 1,5±0,2 28,2±1,5 29,9±0,8 2,9±0,1 17:0 cyclo ω7c 6,8±0,6 13,9±0,8 3,7±0,1 3,3±0,3 17:0 iso 9,9±0,6 2,3±0,1 17:1 iso ω5c 3,5±0,3 17:1 iso ω10c 5,2±0,7 17:1 ω8c 1,2±0,1 18:0 1,7±0,1 18:1 ω7c 22,2±0,7 11,6±0,3 23,3±0,4 55,8±0,9 18,9±0,4 62

Wyizolowane szczepy bakteryjne znacząco różniły się zawartością poszczególnych rodzajów kwasów tłuszczowych w błonie komórkowej. Najwięcej nierozgałęzionych nasyconych kwasów tłuszczowych (na poziomie powyżej 40%) było obecnych w błonach komórkowych szczepów R. planticola SA2, R. planticola WS2 i Achromobacter sp. KW1. Ponad 30% wszystkich kwasów tłuszczowych szczepu Pseudomonas sp. MChB stanowiły kwasy z tej właśnie grupy. Zawartość kilkunastu procent nasyconych nierozgałęzionych kwasów tłuszczowych stwierdzono w błonach szczepów R. aquatilis DA2 i Pseudomonas sp. OS4. Udział kwasów nierozgałęzionych w komórkach dwóch pozostałych szczepów, Achromobacter sp. SA1 i M. resistens MChC, nie przekraczał 1%. Natomiast w błonie komórkowej szczepów Achromobacter sp. SA1 i M. resistens MChC występowały niemal wyłącznie rozgałęzione nasycone kwasy tłuszczowe (odpowiednio 98% i 99%). W przypadku szczepu Achromobacter sp. SA1 blisko 60% wszystkich kwasów tłuszczowych stanowił kwas 15:0 anteiso, a około 30% kwas 17:0 anteiso. Z kolei w błonie szczepu M. resistens MChC występowały przede wszystkim kwasy 15:0 anteiso (40%), 16:0 iso (20%) oraz 17:0 anteiso (30%). Rozgałęzione nasycone kwasy tłuszczowe nie były obecne w błonie komórek szczepów R. planticola SA2, Pseudomonas sp. MChB oraz Achromobacter sp. KW1. Do szczepów zawierających względnie wysoki udział hydroksykwasów tłuszczowych należą Pseudomonas sp. MChB (14%) i R. planticola SA2 (6%). W błonie komórkowej szczepu Pseudomonas sp. OS4 obecnych było ok. 1% hydroksykwasów tłuszczowych, które nie występowały w błonie komórkowej szczepów szczepów Achromobacter sp. SA1 i M. resistens MChC. Jednocześnie te szczepy wyróżniały się brakiem nienasyconych kwasów tłuszczowych. Udział tych kwasów był największy w błonie komórkowej szczepów Pseudomonas sp. OS4 (59%), Pseudomonas sp. MChB (49%) oraz Achromobacter sp. KW1 (43%). Nieznacznie mniej (odpowiednio 41% i 36%) nienasyconych kwasów tłuszczowych było zawartych w błonie komórkowej szczepów R. planticola SA2 i R. planticola WS2. 1.3. Test hemolizy W celu określenia zdolności badanych szczepów do prowadzenia lizy czerwonych krwinek wykonano posiew redukcyjny na podłożach agarowych z dodatkiem 5% krwi baraniej. Obserwacje barwy podłoża wokół kolonii bakteryjnych pozwoliły na wskazanie zdolności szczepów do hemolizy. Hemoliza typu α, oznaczająca częściowe zniszczenie krwinek czerwonych, występowała wokół kolonii szczepu R. planticola SA2. Całkowite zniszczenie erytrocytów, charakteryzujące hemolizę typu β, wystąpiło wokół kolonii szczepów Achromobacter sp. KW1 oraz R. aquatilis DA2. Sześć pozostałych szczepów bakteryjnych 63

Pseudomonas sp. OS4, M. resistens MChC, Pseudomonas sp. MChB, R. planticola WS2, Achromobacter sp. SA1 nie wykazywało zdolności do hemolizy. 1.4. Dyskusja wyników Wyizolowane szczepy bakteryjne, dla których stwierdzono zdolność do wzrostu w obecności halogenowanych związków aromatycznych, należą do rodzajów Pseudomonas, Raoultella, Achromobacter, Rahnella i Microbacterium. Szczepy środowiskowe należące do tych rodzajów są identyfikowene często jako pełniące istotną rolę w procesach biodegradacji uciążliwych zanieczyszczeń, w tym związków aromatycznych. Mikroorganizmy należące do rodzajów Pseudomonas i Achromobacter są jednymi z najczęściej spotykanych mikroorganizmów występujących w glebach i wodach skażonych zanieczyszczeniami węglowodorowymi, takimi jak polichlorowane bifenyle [232], dioksyny [233], insektycydy [234], pestycydy, pochodne fenolu [235], czy węglowodory obecne w ropie naftowej [236]. Wiele szczepów z rodzaju Pseudomonas, jak np. Pseudomonas putida, jest powszechnie stosowanych w licznych gałęziach biotechnologii [237]. Z kolei bakterie z rodzaju Raoultella były wykorzystywane w badaniach biodegradacji leków (np. diklofenaku [238]) oraz barwników, np. 4-nitroaniliny [239]. Z kolei bakterie Microbacterium były identyfikowane jako dominujące w glebach pustynnych zanieczyszczonych ropą naftową [240]. Egorova i in. [241] opisali szczep Microbacterium sp. B51 prowadzący biodegradację polichlorowanych bifenyli. Z kolei Patel i Vyas [242] zaobserwowali, że należący do rodzaju Microbacterium szczep oznaczony jako TAS1CB degradował chlorobenzen. Również szczepy z rodzaju Rahnella wykazują zdolność do degradacji związków aromatycznych. Szczep Rahnella aquatilis DX2b wykazywał zdolność do degradacji barwników stosowanych w przemyśle tekstylnym [243]. Marecik i in. [244] przedstawili badania dotyczące biodegradacji atrazyny i wśród badanych mikroorganizmów zdolnych do degradacji tego herbicydu były trzy różne szczepy z gatunku R. aquatilis. Z kolei z próbek gleb pobranych z okolic rafinerii ropy naftowej wyizolowano kilka szczepów należących do gatunku R. aquatilis, które bardzo dobrze biodegradowały węglowodory alifatyczne i aromatyczne [245]. Fenotyp szczepów bakteryjnych jest określany m. in. na podstawie analizy przebiegu wybranych reakcji biochemicznych. Wykorzystany do określenia profilu biochemicznego wyizolowanych szczepów system Vitek 2 (biomerieux, Polska) jest popularnym narzędziem stosowanym w tym celu [246]. Przeprowadzone badania wskazały na daleko idące różnice w profilu biochemicznym wykorzystywanych w badaniach szczepów. Na czterdzieści sześć przeprowadzonych reakcji biochemicznych jedynie kilka przebiegało w analogiczny sposób w obecności wszystkich ośmiu szczepów. Cechą wspólną było m. in. zobojętnianie kwasu L-mlekowego oraz nie wytwarzanie siarkowodoru, lipazy czy β-glukuronidazy. 64

Prezentowane w literaturze przedmiotu informacje dotyczące szczepów zdolnych do biodegradacji halogenowanych związków aromatycznych (HZA) pokazują ich dużą różnorodność pod względem posiadanego profilu biochemicznego. Szczep Burkholderia phenoliruptrix, biodegradujący kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy, wytwarzał β-galaktozydazę, asymilował D-glukozę, L-arabinozę, D-mannozę, mannitol i in. Jednocześnie szczep ten nie produkował dekarboksylazy lizyny oraz charakteryzował się m. in. brakiem aktywności ureazy [247]. Innym szczepem biodegradującym związki chloroaromatyczne był Defluvibacter lusatiae, który wyizolowano z osadu czynnego oczyszczalni ścieków zasilanej ściekami przemysłowymi [248]. Szczep ten asymilował jedynie norwalinę, putrescynę, L-tryptofan, maloniany, glutarany and 2-ketoglutarany a spośród cukrów prostych D-glukozę, D-fruktozę, D-mannozę, D-rybozę, D-ksylozę oraz L-liksozę. Jednocześnie D. lusatiae był zdolny do biodegradacji 4-chloro-2-metylofenolu, 2,4-dichlorofenolu i 4-chlorofenolu. Z kolei biodegradujący fenol i 4-chlorofenol szczep Herbaspirillum chlorophenolicum, wyizolowany z osadu dennego rzeki przepływającej przez wysoko uprzemysłowiony region Chin, wykorzystywał jako źródło węgla N-acetyloglukozaminę, jednak wykazywał brak wzrostu na m.in. D-mannozie, glicerolu, D-ramnozie, D-rybozie i adonitolu [249]. Inne halogenowane pochodne fenolu, w tym 4-chloro-, 4-bromo-, 4-jodo- oraz 4-fluorofenol, były z wysoką wydajnością biodegradowane przez szczep LZ-1 należący do rodzaju Stenotrophomonas, który wykorzystywał również jako źródło węgla D-glukozę, D-fruktozę, D-mannozę sacharozę i maltozę, a także kwasy organiczne takie jak cytrynowy, bursztynowy i octowy [250]. Uzyskane dla badanych szczepów wyniki oraz zebrane informacje na temat prezentowanych w literaturze szczepów, pokazały zróżnicowanie profili biochemicznych szczepów biodegradujących HZA. Spośród reakcji biochemicznych, przeprowadzonych w trakcie badań z wykorzystaniem systemu Vitek 2, nie można wskazać takich, które byłyby typowe dla szczepów biodegradujących HZA. Kolejnym badanym parametrem charakteryzującym komórki bakteryjne był profil błonowych kwasów tłuszczowych. Na zawartość kwasów tłuszczowych w błonie komórkowej bakterii ma wpływ szereg czynników środowiskowych, takich jak temperatura, ph, ciśnienie osmotyczne, dostępność i rodzaj źródeł węgla oraz czas hodowli komórkowej [251]. Zmiana profilu kwasów tłuszczowych stanowi również jeden z mechanizmów adaptacji komórek do przeciwdziałania negatywnemu oddziaływaniu toksycznych związków, np. fenolu i węglowodorów alifatycznych. Zmiany płynności błony komórkowej, związane ze zwiększonym udziałem nienasyconych, rozgałęzionych i cyklicznych kwasów tłuszczowych oraz hydroksykwasów tłuszczowych, mogą stanowić odpowiedź komórek na obecność w ich otoczeniu związków aromatycznych [252]. Wśród omawianych w niniejszej pracy szczepów 65

bakteryjnych duży udział nasyconych rozgałęzionych kwasów tłuszczowych był charakterystyczny dla Achromobacter sp. SA1, M. resistens MChC oraz R. aquatilis DA2. Do szczepów o wysokiej zawartości nierozgałęzionych nasyconych kwasów należały R. planticola SA2, R. planticola WS2 i Achromobacter sp. KW1. Z kolei kwasy nienasycone dominowały w komórkach szczepów Pseudomonas sp. OS4, Pseudomonas sp. MChB oraz Achromobacter sp. KW1. Jednym z opisanych w literaturze przykładów szczepu zdolnego do degradacji szeregu chlorowych i bromowych pochodnych fenolu, był wyizolowany z próbek wody z Morza Śródziemnego szczep Desulfoluna spongiiphila. Charakteryzował się on wysoką zawartością w błonie komórkowej kwasów tłuszczowych 14:0 iso (11%), 14:0 3OH (15%), 15:0 anteiso (12%), 16:1 ω7c (17%) oraz 18:1 ω7c (24%) [253]. Z kolei Carvalho i in. [254] opisali szczep należący do Proteobacteria biodegradujący fluorobenzen, a w którego błonie komórkowej dominowały kwasy tłuszczowe 16:0, 18:1 ω7c i 19:0 cyclo ω8c. Analiza profilu kwasów tłuszczowych zawartych w błonie Burkholderia phenoliruptrix, szczepu który biodegradował kwas 2,4,5-trichloro-fenoksyoctowy, wykazała, że dominowały w niej kwasy 16:1 ω7c (18%) 16:0 (20%) i 18:1 ω7c (38%) [247]. Kwas oleinowy (18:1 ω7c) dominował również w błonie szczepu Defluvibacter lusatiae, biodegradującego chlorofenol [248]. Natomiast kwasy tłuszczowe 18:1 ω7c i 16:1 ω7c dominowały w błonie szczepu Rhodopseudomonas palustris, wyizolowanego z wód odpadowych z przemysłu papierniczego, a zdolnego do biodegradacji 2-chlorofenolu [255]. Dużym udziałem (powyżej 40%) kwasów 16:1 ω7c i 18:1 ω7c charakteryzowały się także szczepy z rodzajów Raoultella i Pseudomonas oraz szczep Achromobacter sp. KW1, badane w ramach niniejszej pracy. Do biodegradacji 4-chlorofenolu był również zdolny szczep Herbaspirillum chlorophenolicum, którego błona komórkowa zawierała głównie nasycone i nierozgałęzione kwasy tłuszczowe 16:0 (34%), 17:0 cyclo (22%) oraz nienasycony kwas 18:1 ω7c (13%) [249]. Z kolei Nowak i in. [252] przedstawiły analizy profilu kwasów tłuszczowych szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2, wyizolowanego z osadu czynnego z oczyszczalni ścieków. W czasie wzrostu w obecności 2-chlorofenolu oraz 4-chlorofenolu obserwowano zwiększenie się udziału hydroksykwasów tłuszczowych (10:0 3OH, 12:0 2OH, 12:0 3OH) oraz zawierających w cząsteczce fragment cykliczny (17:0 cyclo). W hodowlach z 3-chlorofenolem zaobserwowano jednak zwiększoną zawartość kwasów tłuszczowych o prostym łańcuchu węglowym (głównie kwasów 12:0 i 16:0). Analogiczne zwiększenie udziału nierozgałęzionych kwasów tłuszczowych obserwowany był przez Nowak i Mrozik [256] w przypadku szczepu z rodzaju Pseudomonas, biodegradującego chlorowe pochodne fenolu. Wysoką zawartość kwasów nierozgałęzionych, wynoszącą powyżej 25%, wykazywały 66

również szczepy R. planticola SA2, R. planticola WS2, Pseudomonas sp. MChB oraz Achromobacter sp. KW1, dla których wyniki analizy ilościowej błonowych kwasów tłuszczowych zaprezentowano w tabeli III.2. Dominujący udział prostołańcuchowych kwasów tłuszczowych może skutkować ograniczeniem przepuszczalności błony komórkowej, co wydatnie utrudnia przenikanie do wnętrza komórki toksycznych substancji, jak np. pochodne fenolu [252]. Należy również zwrócić uwagę, że jedną z cech przypisywanych błonom komórkowym bakterii Gram-ujemnym jest względnie niski w nich udział rozgałęzionych kwasów tłuszczowych. Ekspozycja na stres metaboliczny, np. związkami aromatycznymi, może jednak przyczynić się do zwiększenia zawartości kwasów rozgałęzionych [256], tak jak to zaobserwowano dla omawianego szczepu R. aquatilis DA2. Duży udział nienasyconych kwasów tłuszczowych pozwala komórce na znaczną modyfikację płynności błony komórkowej poprzez przemiany izomerów cis w izomery trans [257]. Wykonany przegląd literatury oraz uzyskane w trakcie badań wyniki pokazują na zróżnicowanie profilu kwasów tłuszczowych w błonie komórkowej szczepów zdolnych do degradacji HZA. Można jednak wskazać, jako cechę wspólną tej grupy szczepów, duży udział kwasów prostołańcuchowych, zarówno nasyconych (m.in. 16:0) jak i nienanasyconych (m.in. 18:1 ω7c i 16:1 ω7c). Jednocześnie należy zwrócić uwagę na stosunkowo niską zawartość w błonie komórkowej tych szczepów hydroksykwasów tłuszczowych. Dotyczy to zarówno szczepów opisywanych w literaturze, jak i tych omawianych w niniejszej pracy. W następnym etapie badań określono, na podstawie testu hemolizy, zdolność szczepów do produkcji zewnątrzkomórkowych związków o właściwościach surfaktantów [258]. Spośród ośmiu badanych w niniejszej pracy szczepów bakteryjnych hemolizę typu β wykazywały jedynie dwa szczepy, Achromobacter sp. KW1 oraz R. aquatilis DA2, co może wskazywać na produkcje przez nie biosurfaktantów. Zachodzenie hemolizy typu β, będące skutkiem działania związków powierzchniowo czynnych [259], stanowić może potwierdzenie produkcji biosurfaktantów przez mikroorganizmy [260], [261]. Produkcja biosurfaktantów przez szczepy bakteryjne jest uznawana za jedną z cech adaptacyjnych szczepów do przyswajania związków hydrofobowych. Wydzielane na zewnątrz komórek związki powierzchniowo czynne mogą w istotny sposób zwiększyć dostępność węglowodorów m. in. poprzez zmniejszenie napięcia międzyfazowego i emulgowanie słabo rozpuszczalnych zanieczyszczeń [262], [263]. Przykładem szczepu biodegradującego związek chloroaromatyczny, tj. kwas 2,3,5- trichlorofenoksyoctowy, który wykazywał hemolizę typu β, jest Burkholderia phenoliruptrix [247]. 67

W literaturze przedmiotu opisano jednak wiele szczepów, które bardzo dobrze biodegradują węglowodory o niskiej rozpuszczalności w wodzie, ale nie wykazują zdolności do produkcji biosurfaktantów [258], [264]. Produkcja biosurfaktantów, która może być wykryta poprzez test hemolizy, nie jest więc cechą typową dla szczepów biodegradujących związki aromatyczne, co również dotyczy sześciu spośród ośmiu prezentowanych w tej pracy szczepów. Produkcja substancji zewnątrzkomórkowych, którymi mogą być biosurfaktanty, obserwowana w przypadku Achromobacter sp. KW1 oraz R. aquatilis DA2, może świadczyć o zaawansowanych mechanizmach adaptacji tych szczepów do biodegradacji hydrofobowych zanieczyszczeń [265]. Porównanie zdolności do biodegradacji izomerów chlorotoluenu szczepów produkujących biosurfaktanty oraz szczepów nie wykazujących tej cechy zostanie dokonane w rozdziale III.4.3. 2. Charakterystyka ekstraktów roślinnych Celem badań realizowanych w ramach kolejnego etapu prezentowanej pracy było wytypowanie surowca roślinnego zawierającego saponiny, którego ekstrakt wykazywałby najkorzystniejsze właściwości oceniane z perspektywy późniejszego zastosowania go we wspomaganiu biodegradacji wybranych HZA. Dokonany przegląd literatury oraz przeprowadzone wstępne badania wskazały, że kłącza mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis L.), owoce tzw. orzechów piorących (Sapindus mukorossi L.) oraz kora kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum L.) mogą być wydajnym źródłem saponin, będących naturalnymi związkami powierzchniowo czynnymi. 2.1. Efektywność ekstrakcji materiału roślinnego W wyniku ekstrakcji w aparacie Soxhleta otrzymano ekstrakty roślinne z trzech różnych surowców roślinnych: kłączy mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis L.), owoców tzw. orzechów piorących (Sapindus mukorossi L.) oraz kory kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum L.). Wydajność ekstrakcji dla poszczególnych surowców przedstawiono w tabeli III.3. Tabela III.3. Wydajność ekstrakcji dla ekstraktów z kory kasztanowca zwyczajnego (A. hippocastanum), kłącza mydlnicy lekarskiej (S. officinalis) oraz owoców drzewa S. mukorossi źródło ekstraktu wydajność ekstrakcji [%] kłącze mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis) 9,7±1,7 owoce Sapindus mucorossi tzw. orzechy piorące 52,4±2,0 kora kasztanowca zwyczajnego, (Aesculus hippocastanum) 53,7±1,6 68

transmitancja [%] Wpływ ekstraktu z owoców Sapindus mukorossi na biodegradację halogenowanych związków aromatycznych Największą wydajność ekstrakcji uzyskano w przypadku kory kasztanowca zwyczajnego (53,7%). Nieznacznie mniejszą wydajność procesu zaobserwowano dla ekstrakcji tzw. orzechów piorących (52,4%). Ponad pięciokrotnie mniejszą wydajnością charakteryzowała się ekstrakcja z kłącza mydlnicy lekarskiej (9,7%). Oznaczenie całkowitej zawartości saponin w badanych ekstraktach, wykonane metodą spektrofotometryczną, wykazało, że największą zawartością saponin charakteryzował się ekstrakt z owoców Sapindus mukorossi, zawierający ok. 24±1% związków z tej grupy. Znacznie mniej saponin zawierały ekstrakty z kory kasztanowca zwyczajnego (4±1%) oraz kłącza mydlnicy lekarskiej (5±1%). 2.2. Analiza spektroskopowa i mikroskopowa ekstraktów Kolejny etap badań ekstraktów roślinnych obejmował ich analizy spektroskopowe w zakresie podczerwieni oraz w zakresie światła widzialnego oraz nadfioletu. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 4000 3600 3200 2800 2400 2000 liczba falowa [cm -1 ] 1600 1200 800 400 A. hippocastanum S. officinalis S.mukorossi Rysunek III.1. Widma w zakresie podczerwieni dla badanych ekstraktów roślinnych: z kory kasztanowca zwyczajnego (A. hippocastanum), kłącza mydlnicy lekarskiej (S. officinalis) oraz owoców drzewa S. mukorossi Analiza widm w podczerwieni (przedstawionych na rysunku III.1) wykazała występowanie pasm charakterystycznych grup funkcyjnych związków chemicznych zawartych w badanych ekstraktach roślinnych. Obecność grup hydroksylowych potwierdza silne i szerokie pasmo w zakresie od 3250 cm -1 do 3450 cm -1. Około 2950 cm -1 jest widoczny sygnał pochodzący od drgań rozciągających wiązań węgiel-wodór. Ponadto pasma między 1600 cm -1 a 1750 cm -1 reprezentują wiązania w grupie karbonylowej. Sygnał o średniej intensywności, przy 1430 cm -1, może odpowiadać drganiom zginającym wiązania węgiel-wodór. Szerokie i intensywne pasmo powyżej 1000 cm -1 odpowiada drganiom rozciągającym wiązań pojedynczych węgiel-tlen. Opisane wyżej sygnały reprezentują wiązania obecne 69

absorbancja [-] Wpływ ekstraktu z owoców Sapindus mukorossi na biodegradację halogenowanych związków aromatycznych w cząsteczkach saponin, jednak mogą one reprezentować także inne związki występujące w tkanakch roślinnych, takie jak wolne cukry, kwasy karboksylowe, pochodne terpenów. Należy także wskazać istotne różnice między widmami otrzymanymi dla poszczególnych ekstraktów. Widmo ekstraktu z kory kasztanowca zwyczajnego posiada wyraźne pasmo odpowiadające drganiom rozciągającym wiązania węgiel-wodór z maksimum przy ok. 2880 cm -1, podczas gdy dla pozostałych dwóch ekstraktów maksimum analogicznego pasma przypda na ok. 2930 cm -1. Innym fragmentem, które wyróżnia widmo ekstraktu z kory kasztanowca zwyczajnego jest względnie silne pasmo przy 1490 cm -1. Widmo ekstraktu z owoców S. mukorossi wyróżnia natomiast silny sygnał przy 1725 cm -1, który może pochodzić od wiazań C=O w grupie estrowej. Widma roztworów wodnych ekstraktów sporządzone w przedziale od 200 nm do 600 nm (rysunek III.2) wykonane dla ekstraktu z kory kasztanowca zwyczajnego (A. hippocastanum), wskazują na obecność trzech pasm absorpcyjnych, o maksimach przy długości fali 240 nm, 282 nm oraz 340 nm. Na widmie wykonanym dla ekstraktu z kłącza mydlnicy lekarskiej (S. officinalis) obecne jest słabe pasmo z maksimum przy 218 nm. Ekstrakt z owoców S. mukorossi nie wykazywał absorbancji w analizowanym zakresie fal. 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 długość fali [nm] A. hippocastanum S. officinalis S.mukorossi Rysunek III.2. Zależność absorbancji od długości fali w zakresie światła widzialnego i nadfioletu dla roztworów wodnych badanych ekstraktów roślinnych: z kory kasztanowca zwyczajnego (A. hippocastanum), kłącza mydlnicy lekarskiej (S. officinalis) oraz owoców drzewa S. mukorossi W celu zbadania struktury powierzchni zliofilizowanych ekstraktów wykonano zdjęcia za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, które zostały przedstawione na rysunkach od III.3 do III.5. Zdjęcia wskazują na homogeniczną strukturę ekstraktów, nieporowatą, bez widocznych obszarów o charakterze krystalicznym. 70

a) b) Rysunek III.3. Zdjęcia ekstraktu z kory kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum) wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego; powiększenia: a) 50x, b) 500x a) b) Rysunek III.4. Zdjęcia ekstraktu z kłącza mydlnicy lekarskiej (Saponaria officinalis) wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, powiększenia: a) 50x, b) 500x a) b) Rysunek III.5. Zdjęcia ekstraktu z tzw. orzechów piorących (Sapindus mukorossi) wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, powiększenia: a) 50x, b) 500x 2.3. Właściwości powierzchniowo czynne ekstraktów Wyniki pomiarów napięcia powierzchniowego roztworów ekstraktów roślinnych pozwoliły na wyznaczenie parametrów adsorpcji w oparciu o równanie Szyszkowskiego (równanie II.1). Wartości poszczególnych parametrów zostały zebrane w tabeli III.4. 71