Praca oryginalna Original Article

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2016; 52(2): 107-114 Praca oryginalna Original Article ISSN 0867-4043 Ocena wydajności różnych metod izolacji wybranych pochodnych benzodiazepiny z krwi pełnej i surowicy krwi ludzkiej oraz zjawisko ich reaktywności w metodzie immunoenzymatycznej Efficiency evaluation of extraction methods of selected benzodiazepine derivatives from human serum and whole blood and the reactivity phenomenon in immunoassay for benzodiazepines Barbara Potocka-Banaś, Teresa Dembińska, Krzysztof Borowiak Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Zakład Toksykologii Klinicznej i Sądowej Streszczenie Cel: porównanie wydajności różnych metod izolacji wybranych pochodnych benzodiazepiny: diazepamu, estazolamu, flunitrazepamu i nitrazepamu z materiału biologicznego. W badaniach porównano odzysk wybranych benzodiazepin z krwi pełnej i surowicy krwi ludzkiej po wykonaniu ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz oraz w układzie ciecz-ciało stałe. Wydajność procesów odzysku w warunkach ekstrakcji określono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem diodowym. Dodatkowo w pracy wyznaczono reaktywność wybranych benzodiazepin w metodzie immunoenzymatycznej (EMIT). Metoda: materiał biologiczny poddano następującym rodzajom ekstrakcji: w układzie ciecz-ciecz (klasyczna ekstrakcja ciecz-ciecz i mikroekstrakcja), w układzie ciecz-ciało stałe: (kolumienki firmy Baker i United Chemical Technologies UTC). Reaktywność wybranych benzodiazepin wyznaczono w metodzie immunoenzymatycznej na aparacie V-Twin firmy Simens. Wyniki: najniższy odzysk (nitrazepam 16%, diazepam 23%, flunitrazepam 28%, estazolam 37%) uzyskano po mikroekstrakcji ciecz-ciecz krwi pełnej, a najwyższy (nitrazepam 86%, diazepam 89%, estazolam 91%, flunitrazepam 94%) w wyniku ekstrakcji ciecz-ciało stałe krwi pełnej, wykonanej na kolumienkach firmy UCT. W wyniku klasycznej ekstrakcji ciecz-ciecz, najniższy odzysk (36%) uzyskano w przypadku ekstrakcji diazepamu z krwi pełnej, a najwyższy (74%) po ekstrakcji flunitrazepamu z surowicy. Ekstrakcja na kolumienkach firmy Baker powiodła się tylko w przypadku surowicy, a średni odzysk wynosił od 57% dla diazepamu do 89% dla flunitrazepamu. Uzyskane wyniki wskazują na większą wydajność ekstrakcji w układzie ciecz-ciało stałe, zwłaszcza w przypadku stosowania sorbentu dedykowanego dla benzodiazepin. Podczas analizy immunoenzymatycznej stwierdzono obniżoną reaktywność badanych pochodnych benzodiazepiny ze stosowanym w teście odczynnikiem. Wnioski: Analiza porównawcza efektywności odzysku wybranych pochodnych benzodiazepiny przemawia za szerszym zastosowaniem ekstrakcji w układzie ciecz-ciało stałe w rutynowej analizie toksykologicznej. Znajomość reaktywności krzyżowej pochodnych benzodiazepiny w metodzie immunoenzymatycznej pozwala na prawidłową interpretację uzyskanych wyników. Summary The aim of the study was to compare efficiency of various extraction methods of benzodiazepine derivatives: diazepam, estazolam, flunitrazepam and nitrazepam. The study compared the recovery of benzodiazepines isolated from biological material (blood and human blood serum) using liquid-liquid extraction and solid-phase extraction. The efficiency of each extraction was evaluated using high-performance liquid chromatography with diode array detector. In addition, benzodiazepines immunoassay reactivity was estimated. The following methods of extraction were used: liquid-liquid extraction (a classical liquid-liquid extraction and microextraction), solid- -phase extraction (Baker s columns and United Chemical Technologies (UTC columns). The reactivity was evaluated using V-Twin System with EMIT technology by Siemens. The results showed that the lowest recovery (nitrazepam 16%, diazepam 23%, flunitrazepam 28%, estazolam 37%) was obtained using liquid-liquid microextraction of whole blood and the highest recovery was obtained in solid-phase extraction of whole blood using United Chemical Technologies columns (nitrazepam 86%, diazepam 89%, estazolam 91%, flunitrazepam 94%). The lowest recovery in classical liquid-liquid extraction was obtained for diazepam isolated from whole blood (36%), and the highest for flunitrazepam isolated from serum (74%). Solid-phase extraction with Baker s columns was successful only in case of drugs isolation from 107

www.diagnostykalaboratoryjna.eu serum and the recovery range from 57% to 89% for flunitrazepam. The results indicated higher efficiency of solid-phase extraction, especially with use of columns specific for the extraction of benzodiazepines. The immunoassay analysis showed a decreased reactivity of the tested benzodiazepine derivatives on the reagent used for the EMIT assay. Comparative analysis of the recovery efficiency of selected benzodiazepine derivatives led to the conclusion that use of solid-phase extraction should be considered more often in routine toxicological analysis. The knowledge of benzodiazepine derivatives cross-reactivity in immunoassay method is essential for correct interpretation of obtained results. Key words: Słowa kluczowe: benzodiazepines, liquid-liquid extraction, solid-phase extraction, reactivity, enzyme linked immunoassay benzodiazepiny, ekstrakcja ciecz-ciecz, ekstrakcja do fazy stałej, reaktywność, test immunoenzymatyczny Wstęp Na przestrzeni ostatnich lat obserwuje się wzrost stosowania środków farmakologicznych, które niejednokrotnie prowadzą do ciężkich zatruć, wymagających postępowania lekarskiego, przy jednoczesnym prowadzeniu diagnostyki toksykologicznej. Sprzyja temu stres i rosnące tempo życia, co z kolei prowadzi do rozwoju zaburzeń psychicznych takich jak depresja, nerwica czy bezsenność. Zauważalny jest również wzrost przypadków użycia substancji psychoaktywnych w celach przestępczych [1, 2]. Jedną z najpopularniejszych grup środków farmakologicznych, które są nadużywane, stanowią benzodiazepiny, których podstawą zarówno ich struktury chemicznej jak i nazwy jest pierścień 1,4-diazepinowy skondensowany z pierścieniem benzenowym. Związki z tej grupy cechują się dużą lipofilnością i wysokim stopieniem wiązania z białkami osocza. Ich biodostępność zawiera się w granicach 70-100%, ponieważ w bardzo małym stopniu podlegają zjawisku pierwszego przejścia. Mechanizm działania pochodnych benzodiazepiny polega na potęgowaniu hamującego neuroprzekaźnictwa GABA-ergicznego w ośrodkowym układzie nerwowym [3]. Objawy przedawkowania benzodiazepin to miedzy innymi: senność, splątanie, ataksja, hipotonia, zaburzenia oddychania, śpiączka. Szczególnie niebezpieczne są zatrucia mieszane, zwłaszcza, gdy jednocześnie zażyto inne środki o działaniu depresyjnym na ośrodkowy układ nerwowy np. alkohol etylowy. Dochodzi wówczas do synergizmu addytywnego [4]. Biorąc pod uwagę ogromną liczbę substancji powodujących zatrucia oraz fakt, że zazwyczaj informacje, co do rodzaju przyjętego środka są ograniczone, kluczową rolę w podjęciu właściwych działań lekarskich odgrywa wynik pełnej analizy toksykologicznej [1, 5]. Analiza toksykologiczna materiału biologicznego jest trudnym i wieloetapowym procesem, którego celem jest wykrycie, identyfikacja oraz ilościowe oznaczenie poszukiwanych substancji lub ich metabolitów w możliwie jak najkrótszym czasie. Stosowane metody muszą być swoiste i czułe. Kryteria te spełniają metody chromatograficzne, a częściowo także immunologiczne, które są obecnie najczęściej stosowane w laboratoriach zajmujących się analizą toksykologiczną [2, 5, 6]. Do metod immunologicznych stosowanych w laboratoriach toksykologicznej należą m.in. metoda immunoenzymatyczna (EMIT) i metoda immunofluorescencji w świetle spolaryzowanym (FPIA). Metody te pozwalają na identyfikację oraz określenie stężenia wybranych grup substancji (np. benzodiazepiny, trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne). Podstawową zaletą metod immunologicznych jest brak konieczności izolacji oznaczanych substancji z materiału biologicznego, co umożliwia szybkie wykonanie oznaczenia. Zaletą jest również wysoka czułość, prostota wykonania oraz możliwość przeprowadzenia analizy nawet w przypadku bardzo małej objętości materiału biologicznego. Wadą tych metod jest wysoki koszt odczynników oraz niespecyficzność reakcji w obrębie danej grupy farmakologicznej. Zjawisko to może być przyczyną uzyskania wyników fałszywie dodatnich [6, 7]. Natomiast do metod potwierdzających, stosowanych w analizie toksykologicznej, należą metody chromatograficzne takie jak: wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją diodową (HPLC/DAD), chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS) i chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC/MS). Metody chromatograficzne charakteryzują się bardzo dużą specyficznością, pozwalającą na dokładne określenie rodzaju przyjętych substancji, wysoką czułości umożliwiającą detekcję i oznaczenie ilościowe niskich stężeń substancji. Podstawową wadą metod chromatograficznych jest czasochłonność, ponieważ zawsze wymagają etapu izolacji (ekstrakcja ciecz-ciecz LLE, ekstrakcja ciecz-ciało stałe, tzw. ekstrakcja do fazy stałej SPE) oznaczanych substancji z matrycy biologicznej. Podkreślić należy, że aparatura tego typu jest bardzo kosztowna, co ogranicza jej zastosowanie w rutynowych laboratoriach diagnostycznych [2]. Z uwagi na bardzo istotny wpływ etapu izolacji ksenobiontyku z materiału biologicznego na miarodajność wyników analizy toksykologicznej, celem pracy było porównanie wydajności różnych metod izolacji wybranych pochodnych benzodiazepiny z dwóch materiałów (surowica i krew pełna). Ponadto wykonując analizę metodą immunoenzymatyczną (EMIT) zbadano zjawisko reaktywności. Materiał i metody Materiałem biologicznym użytym do badań była: krew pełna zabezpieczona po badaniach toksykologicznych wykonanych w ZTKiS PUM Szczecin, w której badania na obecność leków dały wynik ujemny w badaniu metodami EMIT i HPLC; surowica krwi ludzkiej uzyskana z Wojewódzkiej Stacji Krwiodawstwa w Szczecinie, w której badanie na obecność leków dało wynik ujemny w badaniu metodami EMIT i HPLC. Materiał biologiczny poddano następującym rodzajom ekstrakcji: w układzie ciecz-ciecz (LLE): klasyczna ekstrakcja ciecz-ciecz oraz mikroekstrakcji; 108

Diagn Lab 2016; 52(2): 107-114 w układzie ciecz-ciało stałe (SPE): ekstrakcja na kolumienkach firmy Baker oraz ekstrakcja na kolumienkach United Chemical Technologies (UCT). Przed wykonaniem ekstrakcji materiał biologiczny przygotowano według poniższego schematu: Do 975 µl materiału biologicznego (krew pełna/surowica) dodano 25 µl wzorca o stężeniu 1 mg/ml (flunitrazepamu/ estazolamu/diazepamu/ nitrazepamu firmy LGC Standards), uzyskując stężenie 25 µg/ml. Dla każdego rodzaju ekstrakcji przygotowano po 3 próby materiału biologicznego z każdego wzorca. Aparatura: Analizator V-Twin 9260 firmy SIEMENS. Wysokosprawny chromatograf cieczowy Merck-Hitachi, z detektorem Diode Array L-3000 oraz pompą izokratyczną L-6000, obsługiwanego przez program komputerowy Chromatography, Data Station Software-DAD Manager. Rozdział prowadzono w warunkach izokratycznych na kolumnie Lichrocart 125-4 wypełnionej Lichrospher 100RP-18E, długość 10 cm, średnica 5 µm. Objętość nastrzyku wynosiła 30 µl. Skład fazy ruchomej: 530 cm³ wody dejonizowanej + 350 µl 80% kwasu fosforowego + 146 µl trietyloaminy (całość doprowadzone do ph 3,3 10% wodnym roztworem wodorotlenku potasu) oraz 470 cm³ acetonitrylu. Prędkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 0,6 cm³/min, zakres ciśnienia 0,1-0,8 bar. Ocena wydajności różnych metod izolacji Wszystkie rodzaje ekstrakcji prowadzano na dwóch rodzajach materiału biologicznego: surowicy i krwi pełnej. Dla każdego rodzaju ekstrakcji przygotowano, według podanego schematu, 12 prób: 3 próby materiału biologicznego z dodatkiem flunitrazepamu, 3 próby materiału biologicznego z dodatkiem estazolamu, 3 próby materiału biologicznego z dodatkiem diazepam, 3 próby materiału biologicznego z dodatkiem nitrazepamu. Przed przystąpieniem do ekstrakcji próby dokładnie wymieszano przy użyciu worteksu. Próbę odniesienia do oceny wydajności poszczególnych ekstrakcji stanowiły roztwory wzorcowe o stężeniu 25 µg/ml, sporządzone poprzez dodanie 25 µl wzorca benzodiazepiny o stężeniu 1 mg/ ml do 975 µl etanolu. Wykonanie klasycznej ekstrakcji ciecz-ciecz W rozdzielaczu o pojemności 50 ml umieszczono 1 ml materiału biologicznego zawierającego badaną benzodiazepinę w stężeniu 25 µg/ml. Jako rozpuszczalnik ekstrahujący zastosowano chloroform, który dodano w objętości 40 ml. Mieszaninę doprowadzono do ph 9 poprzez dodanie 1 ml 25% amoniaku, a następnie wytrząsano przez 5 minut, uważając by nie doszło do wytworzenia emulsji. Po rozdzieleniu warstw, dolną warstwę organiczną przesączono przez sączek bibułowy do parowniczki i odparowano do sucha na łaźni wodnej. Pozostałość po odparowaniu rozpuszczono w 1 ml etanolu. Wykonanie mikroekstrakcji W probówce plastikowej o pojemności 5 ml, umieszczono 1 ml materiału biologicznego zawierającego badaną benzodiazepinę w stężeniu 25 µg/ml, 1 ml buforu TRIS (ph 8,9-9,0) i 1ml octanu etylu, a następnie wytrząsano przez 3 minut. Całość wirowano 5 minut przy 4400 obrotów na minutę, następnie górną warstwę octanową przeniesiono do probówki Eppendorf o pojemności 2 ml i wirowano w ultrawirówce przez 5 minut przy 12000 obrotów na minutę. Po odwirowaniu warstwę górną przeniesiono do szklanej probówki o pojemności 10 ml i odparowano do sucha w strumieniu azotu w temperaturze 40 C, suchą pozostałość rozpuszczono w 1 ml etanolu. Wykonanie ekstrakcji do fazy stałej na kolumienkach z sorbentem uniwersalnym Do wykonania tego typu ekstrakcji zastosowano kolumienki firmy Baker, wypełnione żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (C18). Do 1 ml materiału biologicznego zawierającego badaną benzodiazepinę w stężeniu 25 µg/ml dodano 1 ml buforu boranowego (ph 9). Kolumienki umieszczono w komorze podciśnieniowej i kondycjonowano przepuszczając 2 ml metanolu i 2 ml buforu fosforanowego (ph 6). Następnie nie dopuszczając do wysuszenia złoża, naniesiono materiał biologiczny. Po przejściu materiału biologicznego przez złoże (z szybkością 1ml/min), kolumienki przemyto 3 ml roztworu woda:metanol (95:5) i 3 ml 0,3 M roztworu amoniaku, a następnie suszono w próżni przez 5 minut. Do elucji benzodiazepin użyto 3 ml roztworu chloroform:n-propanol (4:1). Eluat odparowano do sucha w strumieniu azotu w temperaturze 40 C, a suchą pozostałość rozpuszczono w 1 ml etanolu. Wykonanie ekstrakcji do fazy stałej na kolumienkach z sorbentem dedykowanym dla benzodiazepin Do wykonania tego typu ekstrakcji zastosowano kolumienki firmy UCT. Do 1 ml materiału biologicznego zawierającego badaną benzodiazepinę w stężeniu 25 µg/ml dodano 1 ml buforu fosforanowego (ph 6). Kolumienki umieszczono w komorze podciśnieniowej i kondycjonowano 3 ml metanolu, 3 ml wody dejonizowanej i 1 ml buforu fosforanowego (ph 6). Nie dopuszczając do wysuszenia złoża, naniesiono materiał biologiczny i przepuszczono przez złoże z szybkością 1ml/minutę. Do przemycia zastosowano 2 ml wody dejonizowanej i 2 ml 20% roztworu acetonitrylu w buforze fosforanowym o ph 6, a następnie złoże suszono 10 minut w próżni i ponownie przemyto przy użyciu 2 ml heksanu. Elucję benzodiazepin prowadzono 5 ml 2% roztworu wodorotlenku amonu w octanie etylu. Eluat odparowano w strumieniu azotu w temperaturze 40 C, a suchą pozostałość rozpuszczono w 1 ml etanolu. Ocena wydajności przy zastosowaniu metody HPLC/DAD Wydajność procesów odzysku w warunkach ekstrakcji określono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Uzyskane ekstrakty i roztwory wzorcowe (o stężeniu 25 µg/ml) poddano analizie ilościowej przy użyciu HPLC/DAD Uzyskane widma porównywano z widmami wzorcowymi wybranych benzodiazepin o znanym stężeniu (25 µg/ml), poprzez nakładanie na siebie widm w postaci graficznej, a następnie porównanie widm w postaci cyfrowej. 109

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Absorbancję odczytywano przy następujących długościach fali: 217,5 nm dla flunizatrepamu, 222,5 nm dla estazolamu, 230,0 nm dla diazepamu, 217,5 nm dla nitrazepamu. Ocena reaktywności Reaktywności wybranych benzodiazepin wyznaczono dla metody immunoenzymatycznej na aparacie V-Twin firmy Siemens. Zasada metody polega na współzawodnictwie o miejsce wiązania przeciwciał pomiędzy substancją w próbce a substancją oznakowaną enzymem dehydrogenazą glukozo-6 fosforanową (G6-PDH). Aktywność enzymu obniża się w wyniku wiązania z przeciwciałem, tak wiec stężenie leku w próbce można określić mierząc aktywność enzymu. Aktywny enzym przekształca dinukleotyd nikotyno-adeninowy (NAD) do jego postaci zredukowanej (NADH), co powoduje zmianę absorbancji przy 340 nm, Średnią wydajność przeprowadzonych ekstrakcji zestawiono w tabeli I. Ocena reaktywności krzyżowej Średnie oznaczone stężenie badanych pochodnych benzodiazepiny oraz procent reaktywności uzyskane w wyniku analizy immunoloenzymatycznej na aparacie V-Twin firmy Siemens przedstawiono w tabeli II. Pochodne benzodiazepiny stanowią szeroko stosowaną grupę leków z uwagi na to, często są one przedmiotem analizy toksykologicznej [8, 9]. Etapem umożliwiającym wykonanie analizy za pomocą metod potwierdzających jest izolacja badanych substancji z materiału biologicznego, dlatego też pierwszym celem pracy było porównanie wydajności różnych metod izolacji pochodnych benzodiazepiny z krwi pełnej oraz z surowicy krwi ludzkiej. Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że do najczęściej stosowanych którą można mierzyć spektrofotometrycznie. Test do oznaczeń metod izolacji należy ekstrakcja w układzie LLE oraz w układzie benzodiazepin został opracowany przez firmę Siemens. Krzywa SPE [10, 11]. W związku z tym, w pracy porównano efektywność kalibracyjna została wyznaczona dla diazepamu w zakresie od ekstrakcji następujących metod: 0,0 do 2000 ng/ml. w układzie LLE: Wzorce flunitrazepamu, estazolamu, diazepamu i nitrazepamu klasycznej ekstrakcji ciecz-ciecz o stężeniu 1 mg/ml rozcieńczono 10-krotnie, następnie przygotowano 9 prób: mikroekstrakcji w układzie SPE: 3 próby o stężeniu 300 ng/ml: Tabela I. Zestawienie wydajności wykonanych ekstrakcji do 997 µl surowicy dodano 3 µl rozcieńczonego wzorca, Rodzaj ekstrakcji Flunitrazepam Estazolam Diazepam Nitrazepam 3 próby o stężeniu 1000 ng/ml: Klasyczna ekstrakcja 74% 69% 61% 60% do 990 µl surowicy dodano 10 µl ciecz-ciecz surowica rozcieńczonego wzorca, Klasyczna ekstrakcja 58% 65% 36% 59% ciecz-ciecz krew pełna 3 próby o stężeniu 2000 ng/ml: do 980 µl surowicy dodano 20 µl Mikroekstrakcja 76% 50% 62% 50% surowica rozcieńczonego wzorca. Mikroekstrakcja Wszystkie próby dokładnie wymieszano na worteksie, po czym 200 µl 28% 37% 23% 16% krew pełna Ekstrakcja SPE (kolumienki Baker z każdej próbki odpipetowano do 89% 84% 57% 71% surowica, metodyka 1) kuwetki i poddano analizie w aparacie V-Twin firmy Simens. 94% 91% 89% 86% Ekstrakcja SPE (kolumienki UCT krew pełna, metodyka 1) Ekstrakcja SPE (kolumienki UCT Wyniki i dyskusja 92% 78% 76% 78% surowica, metodyka 2) 86% 79% 71% 68% ml, przeprowadzono w układzie LLE (klasyczna ekstrakcja LLE, mikroekstrakcja) oraz w układzie SPE Tabela II. Wyniki reaktywności krzyżowej badanych benzodiazepin (metoda EMIT) (ekstrakcja na kolumienkach firmy Baker oraz na kolumienkach UCT) FLUNITRAZEPAM ESTAZOLAM DIAZEPAM NITRAZEPAM przy zastosowaniu wyżej opisanych procedur. Ocenę wydajności [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] C RZ C ŚR C %r.k. ŚR C %r.k. ŚR C %r.k. ŚR %r.k. przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cie- 1000 452,5 45,3 492,1 49,2 838,3 83,8 312,0 31,2 300 38,2 12,7 171,0 57,0 255,7 85,2 181,0 60,3 czowej z detekcją diodową (HPLC/ 2000 796,1 39,8 1474,9 73,8 >2100 105,0 383,4 19,2 DAD). Analizę chromatograficzną C RZ stężenie rzeczywiste rejestrowano w postaci chromatogramu. C ŚR średnie stężenie oznaczone %r.k. procent reaktywności krzyżowej Wydajności izolacji wybranych Ekstrakcja SPE (kolumienki UCT benzodiazepin o stężeniu 25 ng/ krew pełna, metodyka 2) 110

Diagn Lab 2016; 52(2): 107-114 ekstrakcji prowadzonej na kolumienkach firmy Baker ekstrakcji na kolumienkach z sorbentem dedykowanym dla benzodiazepin firmy UCT Do ilościowej oceny odzysku zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową połączoną z detekcją diodową (HPLC/DAD), ponieważ jest to metoda rutynowo stosowana w analizie toksykologicznej [10]. Pochodne benzodiazepiny zaliczane są do substancji o charakterze zasadowym, przed wykonaniem ekstrakcji ciecz-ciecz badany materiał biologiczny należy doprowadzić do ph zasadowego poprzez dodanie np.: 25% roztworu amoniaku lub odpowiedniego buforu [10, 12]. Jednak niektórzy autorzy stosowali w badaniach ph zbliżone do obojętnego (7,4) lub wykonywali ekstrakcję w warunkach niebuforowanych [9, 13, 14]. Natomiast Chudzikiewicz i wsp. do ekstrakcji estazolamu zastosowali ph 5 [15]. Klasyczną metodę ekstrakcji w układzie LLE wykonano zgodnie z rutynowo stosowaną w ZTKiS procedurą izolacji z materiału biologicznego substancji o charakterze zasadowym. W wyniku izolacji tą metodą wybranych pochodnych benzodiazepiny z surowicy krwi ludzkiej średnie wartości odzysku mieściły się w zakresie 60-74%. Najwyższą wartość odzysku uzyskano dla flunitrazepamu (74%), a najniższą dla nitrazepamu (60%). Wykonując izolację z krwi pełnej uzyskano niższe wartości odzysku dla wszystkich badanych pochodnych benzodiazepiny. W tym przypadku najwyższa wartość odzysku wynosiła 65% (estazolam), natomiast najniższa 36% (diazepam). Uwzględniając, że zastosowana metodyka była przeznaczona do izolacji związków zasadowych bez ukierunkowania na benzodiazepiny, uzyskane odzyski były na tyle zadowalające, że w przypadku zatruć różnymi ksenobiotykami pozwala ona na wykrycie pochodnych benzodiazepiny w rutynowej analizie toksykologicznej. W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych dotyczących izolacji ksenobiotyków metodą klasycznej ekstrakcji LLE przy użyciu rozdzielacza. Z reguły autorzy wykonują mikroekstrakcję w układzie LLE w probówkach typu Eppendorf, ponieważ pozwalało to, na stosowanie dużo mniejszych objętości zarówno materiału biologicznego (najczęściej 0,5 ml) jak i rozpuszczalników organicznych, co redukuje znacznie koszt całej analizy [8, 9, 13]. W pracy badano wydajność tego typu ekstrakcji stosując metodykę opracowaną w ZTKiS. Średnia wartość odzysku badanych pochodnych z surowicy po zastosowaniu mikroekstrakcji wynosiła 50-76%. W porównaniu z klasyczną ekstrakcją LLE uzyskany odzysk był wyższy w przypadku flunitrazepamu i diazepamu, natomiast niższy w przypadku estazolamu i nitrazepamu. Zdecydowanie niższy odzysk uzyskano po ekstrakcji z krwi pełnej. Największa wartość odzysku wynosiła tylko 37% i uzyskano ją w przypadku ekstrakcji estazolamu, natomiast odzysk nitrazepamu wynosił zaledwie 15%, co mogło być skutkiem zastosowanych warunków izolacji, które były dobrane do całej grupy benzodiazepin, a nie poszczególnych pochodnych. Przeprowadzone badania wykazały nieprzydatność zastosowanej metodyki mikroekstrakcji w przypadku izolacji pochodnych benzodiazepiny z krwi pełnej. W przyszłości należałoby przeprowadzić dalsze badania wykorzystując metodyki opracowane przez innych badaczy, np. metodykę stosowaną przez Bugey`a i Staub`a. Zastosowali oni wyższe ph (ph=11,5) oraz chlorek n-butylu jako odczynnik ekstrahujący, uzyskując odzysk w zakresie 47-110% (88% dla diazepamu, 110% dla flunitrazepamu) [16]. W przypadku izolacji benzodiazepin z materiału biologicznego metodą SPE do powszechnie stosowanych sorbentów należą: żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi (C18) oraz żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktylowymi i kwasem benzenosulfonowym (tzw. faza mieszana) [10, 17, 18]. Niektórzy autorzy stosowali inne rodzaje sorbentów jak np. żel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi (CN) lub metylowymi (C1) [19]. Sorbent krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi należy do sorbentów uniwersalnych, za pomocą którego można izolować inne substancje niepolarne lub słabo polarne [11, 20, 21]. W pracy wykorzystano kolumienki firmy Baker wypełnione żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi, które są rutynowo stosowane w ZTKiS. Najpierw wykonano izolację wybranych benzodiazepin z surowicy krwi ludzkiej. Najniższy odzysk uzyskano w przypadku diazepamu (57%), który był niższy od uzyskanego w wyniku obu ekstrakcji przeprowadzonych w układzie LLE. Dla pozostałych izolowanych pochodnych wartości odzysku były wyższe niż w przypadku ekstrakcji w układzie LLE i wynosiły 89% dla flunitrazepamu, 84% dla estazolamu i 71% dla nitrazepamu. W trakcie wykonania ekstrakcji krwi pełnej okazało się, że sorbent był nieprzepuszczalny dla tego materiału. Producent nie podał informacji odnośnie rodzaju materiału biologicznego, dla jakiego jest dedykowany sorbent. Podano jedynie informację, że w przypadku takiej sytuacji, należy rozcieńczyć badany materiał. Zgodnie z tym, badane próby krwi rozcieńczono buforem boranowym (ph 9), najpierw dwukrotnie, a następnie ośmiokrotnie, jednak w dalszym ciągu pojawiał się ten sam problem, co w konsekwencji uniemożliwiło wykonanie ekstrakcji. W badaniach podjęto, zatem próbę wykonania ekstrakcji krwi pełnej na kolumienkach z sorbentem dedykowanym dla benzodiazepin firmy UCT, ale stosując metodykę, którą stosowano podczas ekstrakcji wybranych benzodiazepin z surowicy na kolumienkach firmy Baker. W tym przypadku ekstrakcja się powiodła, mimo tego, że według informacji podanych przez producenta są one przeznaczone do izolacji benzodiazepin z surowicy lub osocza. Uzyskane wartości odzysku były wysokie dla wszystkich badanych pochodnych: flunitrazepam (93%), estazolam (91%), diazepam (89%), nitrazepam (86%). Jako ostatnią wykonano izolację wybranych pochodnych benzodiazepiny na kolumienkach firmy UCT, stosując metodykę proponowaną przez producenta. Jednak z uwagi na toksyczność oraz brak odpowiedniego sprzętu w ZTKiS nie zastosowano par rtęci, jak było wskazane w powyższej metodyce podczas etapu kondycjonowania oraz suszenia. Odzysk, jaki uzyskano w wyniku ekstrakcji badanych pochodnych benzodiazepiny z surowicy mieścił się w zakresie 76-92%. W porównaniu z ekstrakcją SPE wykonaną na kolumienkach firmy Baker uzyskano wyższy odzysk dla flunitrazepamu (92%), diazepamu (76%) i nitrazepamu (78%), a niższy dla estazolamu (78%). 111

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Podobnie jak podczas ekstrakcji w układzie LLE również i w tym przypadku z krwi pełnej uzyskano niższe wartości odzysku niż z surowicy (69% dla nitrazepamu, 71% dla diazepamu, 79% dla estazolamu i 87% dla flunitrazepamu), jednak mimo tego były one wyższe od uzyskanych w wyniku obu ekstrakcji w układzie LLE. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono większą wydajność ekstrakcji w układzie SPE, co jest zgodne z wynikami badań przeprowadzonych przez Borges`a i wsp. [10]. Dodatkową zaletą tej metody jest fakt stosowania małych ilości rozpuszczalników organicznych. Podkreślić należy, że mniejsze objętości rozpuszczalników stosowano, co prawda w trakcie mikroekstrakcji (tylko 1 ml), jednak jak już wspomniano, w tym przypadku dokonując izolacji z krwi pełnej należałoby zastosować inną metodykę, ponieważ zastosowana w pracy była najmniej efektywną metodą ze wszystkich. Największą wydajność uzyskano w przypadku zastosowania kolumienek firmy UCT dedykowanych dla benzodiazepin [22]. Przy opracowywaniu metody analitycznej należy poszukiwać ekstrakcji najbardziej efektywnej dla danej grupy substancji nie ograniczając się do metodyk proponowanych przez producentów. Najprostszą technicznie ekstrakcją do wykonania była ekstrakcja w układzie LLE, ponieważ nie wymagała ona stosowania specjalistycznego sprzętu. Metoda ta charakteryzuje się również najkrótszym czasem potrzebnym do wykonania pojedynczej izolacji (ok. 7 minut bez etapu odparowania). Ze względów technicznych, problem stanowiło wykonanie izolacji kilku prób równocześnie. Ten problem, natomiast nie występował podczas mikroekstrakcji i ekstrakcji do fazy stałej. Metoda SPE była zdecydowanie droższą metodą w porównaniu z ekstrakcją w układzie LLE, co wynikało z wysokich cen stosowanych kolumienek. Drugim celem pracy była ocena reaktywności badanych pochodnych benzodiazepiny podczas analizy immunoenzymatycznej (EMIT) surowicy krwi ludzkiej. Analizę wykonano na analizatorze V-Twin firmy Siemens, rutynowo stosowanym w ZTKiS. Test do oznaczeń benzodiazepin został opracowany przez firmę Siemens. Krzywa kalibracyjna została wyznaczona dla diazepamu w zakresie od 0,0 do 2000 ng/ml. Stężenie 300 ng/ml stanowiło w zastosowanej metodzie wartość odcięcia (cut-off) i jednocześnie najniższą analizowaną wartość. Najwyższą dla tego stężenia reaktywność wykazywał diazepam (85,2%), jednak biorąc pod uwagę fakt kalibracji stosowanego odczynnika na tą pochodną wartość ta powinna wynosić 100%. Reaktywność pozostałych badanych pochodnych benzodiazepiny wynosiła w przypadku flunitrazepamu (12,7%), estazolamu (57%), a nitrazepamu (60,3%). Podczas analizy stężenia 1000 ng/ml również uzyskano obniżoną reaktywność diazepamu (83,8%). Analizy estazolamu (49,2%) i nitrazepamu (31,2%) wykazały niższe niż w poprzednim stężeniu reaktywności krzyżowe. Odwrotną zależność zaobserwowano w przypadku flunitrazepamu (45,3%), wykazującego w poprzednim stężeniu najniższą reaktywność krzyżową. Najwyższe analizowane stężenie w stosowanej metodzie stanowiło górną granicę liniowości. Analiza diazepamu wykazała, w tym przypadku, zwiększoną reaktywność (105%), a więc odmiennie niż dla poprzednich stężeń. Reaktywność krzyżowa nitrazepamu spadła do wartości 19,2%. Również nieco niższą reaktywność krzyżową uzyskano dla flunitrazepamu (39,8%). Natomiast estazolam w tym stężeniu wykazywał najwyższą reaktywność krzyżową (73,8%). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że najniższą reaktywność krzyżową ze stosowanym w teście odczynnikiem kalibrowanym na diazepam wykazują flunitrazepam i nitrazepam, należące do pochodnych z grupą nitrową, a najwyższą estazolam, który jest pochodną z układem triazolowym. Na podstawie wartości reaktywności krzyżowej uzyskanej podczas analizy stężenia 300 ng/ml, najniższe stężenie dające w teście wynik dodatni wynosiłoby: dla flunitrazepamu: 2362 ng/ml (reaktywność krzyżowa 12,7%) dla estazolamu: 526 ng/ml (reaktywność krzyżowa 57%) dla nitrazepamu: 498 ng/ml (reaktywność krzyżowa 60,3%) Uzyskane wyniki są niezgodne z danymi podanymi przez producenta testu, który dla badanych pochodnych podaje następujące najniższe wartości stężenia dające wynik dodatni: dla flunitrazepamu: 550 ng/ml (reaktywność krzyżowa 54,5%) dla nitrazepamu: 1000 ng/ml (reaktywność krzyżowa 30%) Producent nie podaje informacji odnośnie najniższego stężenia dającego wynik dodatni w przypadku estazolamu. Na podstawie powyższych badań, stwierdzono konieczność samodzielnego ustalania procentu reaktywności krzyżowej w danym laboratorium, z uwagi na znaczną rozbieżność uzyskanych wyników z informacjami podanymi przez producenta testu. Poza tym potwierdzono fakt, że obniżona reaktywność poszczególnych pochodnych benzodiazepiny ze stosowanym w teście odczynnikiem może przyczynić się do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych. We wszystkich badanych próbach o rzeczywistym stężeniu 300 ng/ml, uzyskane wyniki mieściły się poniżej wartości cut-off. Sytuacji takiej można uniknąć poprzez obniżenie wartości cut-off, jak to zrobiła Gomółka i wsp., wartość cut-off dla leków z grupy benzodiazepin ustawiono na 70 ng/ ml. Jednak obniżenie wartości cut-off skutkuje zwiększonym odsetkiem wyników fałszywie dodatnich, dlatego też uzyskane wyniki należy zawsze weryfikować metodą konfirmacyjną [13]. Wnioski Analiza porównawcza efektywności odzysku wybranych pochodnych benzodiazepiny przemawia za szerszym zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej w rutynowej analizie toksykologicznej. Dobór warunków izolacji badanych benzodiazepin z materiału biologicznego odgrywa istotną rolę w dalszych etapach analizy ilościowej, która jest podstawą obiektywnych dociekań interpretacyjnych. Znajomość reaktywności benzodiazepin w teście firmy Siemens można wykorzystać tylko w przypadku wcześniejszej identyfikacji danej pochodnej benzodiazepiny metodą potwierdzającą (np. HPLC). Pozwala to na prawidłową interpretację uzyskanych wyników. 112

Diagn Lab 2016; 52(2): 107-114 Piśmiennictwo 1. Adamowicz P. Analiza toksykologiczna w sprawach o ułatwienie dokonania zgwałcenia przez podanie środka farmakologicznego. Probl Krym 2005; 248: 26-30. 2. Kała M. Problemy toksykologa analityka w dobie technik sprzężonych. Probl Forensic Sci 2008; LXXV: 228-246. 3. Szukalski B. Barbiturany i benzodiazepiny. W: Narkotyki, kompendium wiedzy o środkach uzależniających. Warszawa: Wyd Instytut Psychiatrii i Neurologii 2005: 153-166. 4. Groszek B, Wilimowska J. Benzodiazepiny. W: Pach J., red.: Zarys toksykologii klinicznej. Kraków: Wyd Uniwersytet Jagielloński; 2009: 271-281. 5. Adamowicz P, Kała M. Complex intoxications. Analytical and interpretational problems. Probl Forensic Sci 2007; LXXII: 433-449. 6. Wachowiak R. Ocena toksykologiczna metod diagnostycznych stosowanych w zatruciach środkami psychoaktywnymi. Przegl Lek 2001; 58: 215-219. 7. Mikel C, Pesce AJ, Rosenthal M, West C. Therapeutic monitoring of benzodiazepines in the anagement of pain: Current limitations of point of care immunoassays suggest testing by mass spectrometry to assure accuracy and improve patient safety. Clin Chim Acta 2012; 413: 1199-1202. 8. Adamowicz P, Kała M. Wykrywanie środków stosowanych w celu ułatwienia wykorzystania seksualnego z zastosowaniem chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas z chemiczną. Probl Forensic Sci 2008; LXXVI: 403-411. 9. Janowska E, Adamowicz P, Chudzikiewicz E, Lechowicz W. Klonazepam środek stosowany w różnych celach. Probl Forensic Sci 2007; LXXI: 297-302. 10. Borges KB, Freire EF, Martins I, de Siqueira ME. Simultaneous determination of multibenzodiaze-pines by HPLC/UV: investigation of liquid-liquid and solid- -phase extractions in human plasma. Talanta 2009; 78: 233-241. 11. Główka F, Karaźniewicz-Łada M. Metody izolacji leków i ich metabolitów z matrycy biologicznej stosowane w badaniach farmakokinetycznych. Farm Pol 2009; 65: 505-510. 12. Pufal E, Sykutera M, Lis G, Rochholz G, Śliwka K. Analysis of estazolam in post- -mortem material. Probl Forensic Sci 2000; XLIII: 208-216. 13. Gomółka E, Wilimowska J, Sulka A, Gawlikowski T, Morawska A. Application of the EMIT and HPLC-DAD methods to determination of the concentration of benzodiazepines in the serum of poisoned patients. Probl Forensic Sci 2010; LXXXII: 161-172. 14. Rouini MR, Ardakani YH, Moghaddam KA, Solatani F. An improved HPLC method for rapid quantitation of diazepam and its major metabolites in human plasma. Talanta 2008; 75: 671-676. 15. Chudzikiewicz E, Adamowicz P, Kała M, et al. Possibilities of using saliva for testing drivers for estazolam, doxepin, and promazine. Probl Forensic Sci 2005; LXII: 166-177. 16. Bugey A, Staub C. Rapid analysis of benzodiazepines in whole blood by high- -performance liquid chromatography: use of a monolithic column. J Pharm Biomed Anal 2004; 35: 555-562. 17. Dussy FE, Hamberg C, Briellmann TA. Quantification of benzodiazepines in whole blood and serum. Int J Legal Med 2006; 120: 323-330. 18. Uddin MN, Samanidou VF, Papadoyannis IN. Validation of SPE-HPLC determination of 1,4-benzodiazepines and metabolites in blood plasma, urine, and saliva. J Sep Sci 2008; 31: 3704-3717. 19. Mercolini L, Mandrioli R, Amore M, Raggi MA. Separation and HPLC analysis of 15 benzodiazepines in human plasma. J Sep Sci 2008; 31: 2619-2626. 20. Żwir-Ferenc A, Biziuk M. Solid Phase Extraction Technique Trends, Opportunities and Applications. Polish J of Enviro Stu 2006; 15: 677-690. 21. Potocka-Banaś B, Borowiak K, Wachowiak R, Janus T. Zastosowanie faz stałych do izolacji wybranych związków organicznych z materiału biologicznego. Diagn Lab 2006; 42: 75-84. 22. Fernández P, Vázquez C, Lorenzo RA, et al. Experimental design for optimization of microwave-assisted extraction of benzodiazepines in human plasma. Anal Bioanal Chem 2010; 397: 677-685. Adres do korespondencji: dr n. med. Teresa Dembińska Katedra Medycyny Sądowej PUM 70-111 Szczecin, al. Powstańców Wlkp. 72 Tel. +48 91 4661567 e-mail: tedemb@sci.pum.edu.pl Otrzymano: 30.03.2016 Akceptacja do druku: 30.06.2016 Konflikt interesów: nie zgłoszono 113