Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w przewlekłej białaczce szpikowej

PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 2, str. 199 208 KRZYSZTOF LEWANDOWSKI Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w przewlekłej białaczce szpikowej Mutation study of BCR-ABL tyrosine kinase in patients with chronic myeloid leukemia Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego w Poznaniu Kierownik: Prof. dr hab. med. Mieczysław Komarnicki STRESZCZENIE Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową mogą prowadzić do oporności na leczenie inhibitorami kinazy tyrozynowej BCR-ABL. Określenie rodzaju mutacji onkogenu BCR-ABL daje moŝliwość modyfikacji strategii klinicznej (np. zwiększenie dawki, zmiana rodzaju stosowanego IKT, podjęcie decyzji odnośnie przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych), a takŝe pełniejszej oceny związku pomiędzy obecnością defektu z odpowiedzią kliniczną. Aktualnie stosuje się wiele technik laboratoryjnych pozwalających na wykrywanie mutacji onkogenu BCR-ABL. NaleŜą do nich bezpośrednie sekwencjonowanie, subklonowanie z następowym sekwencjonowaniem, wysokosprawna chromatografia cieczowa w warunkach denaturacyjnych (d-hplc), fluoroscencyjny PCR z PNA clamping, PCR z uŝyciem allelospecyficznych oligonukleotydów, SEQUENOM Mass Array, elektroforeza na podwójnym gradiencie gęstości i denaturacyjnym (DG-DGGE) i ostatnio wprowadzona wysokorozdzielcza analiza krzywych topnienia amplikonów (HRM). Niestety, jak dotąd nie osiągnięto konsensusu co do metody referencyjnej wykonywania analizy i raportowania uzyskanych wyników. W praktyce jako test skryningowy zaleca się wykonywanie d-hplc lub DG-DGGE, a w przypadku podejrzenia mutacji onkogenu BCR-ABL test potwierdzenia techniką sekwencjonowania. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa Mutacje onkogenu BCR-ABL Techniki laboratoryjne SUMMARY Mutations of BCR-ABL oncogene in patients with chronic myeloid leukemia may lead to BCR- ABL tyrosine kinase inhibitors treatment failure. Knowledge about the type of mutations present allow to modify the treatment strategy (drug dose increase or change, decision about stem cell transplantation) and to better understand the relation between mutation presence and response to treatment. Recently, numerous different laboratory techniques are used to detect BCR-ABL oncogene mutations: direct sequencing, subcloning and sequencing, denaturing high-performance liquid chromatography (d-hplc), PNA-based PCR clamping, allele-specific oligonucleoitide PCR, SEQUENOM Mass Array, double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis (DG-DGGE) and high resolution genotyping by amplicon melting analysis (HRM). Unfortunately, there is no consensus about the reference method of mutation detection, screening and data reporting. In

200 K. LEWANDOWSKI practice, d-hplc or DG-DGGE as a screening method is used, and when mutation presence is suspected direct sequencing as a confirmatory test is performed. KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia BCR-ABL gen mutations Laboratory techniques Przewlekłą białaczkę szpikową (PBSz) charakteryzuje obecność specyficznej aberracji genetycznej t(9;22)(q34;q11). Jej obecność skutkuje utworzeniem genu fuzyjnego BCR-ABL i wysoką komórkową ekspresją kinazy BCR-ABL. Konsekwencją biologiczną wymienionych zaburzeń jest niekontrolowana proliferacja komórek macierzystych szpiku Ph(+) i rozwój objawów chorobowych. Postęp objawów choroby często jest powiązany z ewolucją klonalną komórek Ph(+), a takŝe z nabywaniem przez klon(y) białaczkowy(e) dodatkowych aberracji cytogenetycznych. Zjawiska te mogą prowadzić do zmniejszenia efektywności leczenia PBSz za pomocą specyficznych inhibitorów kinazy tyrozynowej BCR-ABL (IKT, m.in. imatynib, nilotynib, dasatynib), w tym m.in. do zmniejszenia odsetka uzyskiwanych odpowiedzi hematologicznych, cytogenetycznych, molekularnych, a takŝe skrócenia całkowitego przeŝycia pacjentów [1, 2, 3]. Mechanizm działania poszczególnych IKT róŝni się, co powiązane jest z róŝną ich skutecznością w poszczególnych sytuacjach klinicznych. I tak, imatynib, lek 1-rzutu w leczeniu chorych z PBSz, przyłącza się w sposób kompetytywny do miejsca wiązania ATP na cząsteczce kinazy tyrozynowej BCR-ABL, uniemoŝliwiając przenoszenie grupy fosforanowej z ATP na tyrozynę białka substratowego. Przyłączenie imatynibu prowadzi do blokady przekazywania sygnału proliferacyjnego do jądra komórkowego i apoptozy komórek białaczkowych. Wykazano, Ŝe imatynib łączy się jedynie z nieaktywną, zdefosforylowaną formą kinazy. Nilotynib, lek strukturalnie bardzo podobny do imatynibu, wiąŝe się swoiście z kieszenią ATP kinazy BCR-ABL w konformacji nieaktywnej i efektywniej niŝ imatynib hamuje jej aktywność biologiczną (IC 50 odpowiednio 20 60 nm i 120 470 nm) (4). Badania krystalograficzne kompleksu Nilotynib-Abl wykazały, Ŝe związek ten jest lepiej dopasowany do struktury przestrzennej kinazy. Dzięki temu jest 10 25 razy silniejszym inhibitorem proliferacji komórek BaF3 w porównaniu do imatynibu. Okazał się teŝ być skuteczny w przypadku niektórych mutacji opornych na imatynib [5]. Trzeci dostępny na polskim rynku IKT dasatynib naleŝy do grupy tzw. podwójnych inhibitorów, czyli inhibitorów rodziny kinaz Src. Pomimo słabszych oddziaływań z kieszenią katalityczną kinazy BCR-ABL, dasatynib w porównaniu do imatynibu hamuje jej aktywność juŝ przy stukrotnie niŝszym stęŝeniu w osoczu. Związek ten wykazuje powinowactwo zarówno do aktywnej jak i nieaktywnej postaci kinazy. Z wymienionych powodów jest skuteczny u większości chorych z opornością na inne IKT. NiemoŜność uzyskania odpowiedzi na leczenie IKT jest określana mianem oporności pierwotnej. W przypadku chorych którzy uzyskali odpowiedź po zastosowaniu IKT (hematologiczną, cytogenetyczną, molekularną) a następnie ją utracili mówimy o oporności nabytej. Oporność pierwotna występuje niezwykle rzadko przed rozpoczęciem terapii IKT i moŝe mieć zarówno charakter mutacyjny jak i nie mutacyjny. W przypadku oporności nabytej w około 50% przypadków powodem oporności jest obecność

Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz 201 mutacji onkogenu BCR-ABL. W pozostałych 40 50% przypadków ze zmniejszoną wraŝliwością na IKT nie stwierdza się obecności mutacji onkogenu BCR-ABL. Przyczyna oporności w tych przypadkach nie jest w pełni poznana. MoŜliwe, Ŝe u podłoŝa oporności w tych przypadkach leŝą m.in. nadekspresja COX-2 i MDR-1 [6], niezaleŝna od BCR-ABL aktywacja Lyn [7] lub aktywacja szlaków sygnałowych poprzez kinazy SRC [8]. W badaniu GIMEMA Co-operative Group oceniającym 297 chorych z PBSz opornością stwierdzoną w trakcie leczenia IKT ogólną częstość mutacji określono na 43%. Częstość mutacji onkogenu BCR-ABL była róŝna w zaleŝności od fazy choroby. I tak, obecność mutacji wykazano u 14% chorych we wczesnej fazie przewlekłej otrzymujących imatynib w 1-linii leczenia oraz aŝ u 83% u chorych z PBSz w okresie przełomu limfoblastycznego. Mutacje genu BCR-ABL dotyczyły częściej chorych z opornością wtórną niŝ pierwotną (57 vs 30%). W badaniu przesiewowym metodą chromatografii cieczowej wysokiej sprawności w warunkach denaturujących przeprowadzonym przez Soverini i wsp. mutacje domen kinazy tyrozynowej obecne były u 23% chorych z PBSz z utratą odpowiedzi cytogenetycznej w trakcie leczenia IKT [9]. W innym badaniu grupy niemieckiej częstość mutacji BCR-ABL u chorych leczonych imatynibem ze wznową hematologiczną lub cytogenetyczną oceniono odpowiednio na 58 i 44%. Co ciekawe, u Ŝadnego z przedstawianych chorych w tym badaniu nie wykazano obecności mutacji przed rozpoczęciem terapii [10]. Lokalizacja mutacji onkogenu BCR-ABL u chorych z PBSz Konsekwencje biologiczne substytucji aminokwasowych w obrębie domen kinazy tyrozynowej są róŝnorodne. Mutacje punktowe w domenie odpowiedzialnej za wiązanie imatynibu, zmieniają jej konformację przestrzenną, utrudniając dostęp i przyłączenie leku [11]. Zmutowana domena kinazy tyrozynowej najczęściej nie traci zdolności do wiązania cząsteczki ATP. Prowadzi to do zachowania funkcji biologicznych kinazy, niewygaszania sygnału proliferacyjnego i selekcji klonalnej zmutowanych komórek Ph(+). Część substytucji aminokwasowych będących wynikiem mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL, zlokalizowana jest poza centrum aktywnym. W celu zrozumienia ich wpływu na rozwój oporności na imatynib konieczna jest dokładna analiza przestrzennej struktury białka BCR-ABL, procesu autoinhibicji kinazy oraz mechanizmów prowadzących do jej aktywacji. Strukturę domen kinazy c-abl w konformacji nieaktywnej i po aktywacji przedstawia Rycina 1. Dla celów klasyfikacyjnych i lepszego zrozumienia konsekwencji biologicznych obecności poszczególnych mutacji wyodrębniono 5 grup mutacji onkogenu BCR-ABL [12]. Do grupy pierwszej naleŝą mutacje genu w obrębie sekwencji kodującej pętlę P (między 244 i 255 aminokwasem). Region ten jest wysoce konserwatywny i odpowiada za wiązanie cząsteczki ATP. Do najczęstszych substytucji aminokwasowych w tym obszarze naleŝą: Y253F, G250E, E255K oraz Q252H. Mutacje onkogenu BCR-ABL prowadzące do substytucji w/w aminokwasów powodują około 100-krotne obniŝenie wraŝliwości na imatynib i 10-krotne obniŝenie wydajności hamowania proliferacji komórek in vitro. Obecność wymienionych substytucji aminokwasowych moŝe wywo-

202 K. LEWANDOWSKI ływać takŝe zmiany konformacyjne w cząsteczce białka, prowadzące do przesunięcia równowagi w kierunku dominacji postaci aktywnej, która nie jest wiązana przez imatynib. A N-lobe B Miejsce wiązania imatynibu Pętla aktywacyjna C-lobe Ryc. 1. Struktura domen kinazy c-abl: A konformacja nieaktywna, B konformacja po aktywacji Druga grupa obejmuje substytucje w regionie, nie mającym wpływu na wiązanie ATP, ale istotnym dla powstawania wiązań stabilizujących pomiędzy kinazą tyrozynową BCR-ABL a cząsteczką imatynibu. Do tej grupy naleŝą substytucje aminokwasowe T315I i F317L. Tyrozyna w pozycji 315 tworzy wiązanie wodorowe z imatynibem. Zastąpienie tyrozyny izoleucyną, która ma rodnik polarny, uniemoŝliwia powstanie wiązania stabilizującego, co w konsekwencji obniŝa wraŝliwość na lek. Substytucja F317L powoduje utratę oddziaływania hydrofobowego pomiędzy imatynibem i kinazą. Z obserwacji klinicznych wynika, Ŝe obecność mutacji T315I oraz mutacji w obrębie p-loop powiązana jest z szybką progresją objawów choroby. Trzecia grupa mutacji dotyczy regionu genu kodującego centrum katalityczne kinazy (aminokwasy 351-359). Do najczęstszych substytucji aminokwasowych w tym regionie naleŝą m.in. M351T, E355G i F359V. M351 uczestniczy w powstawaniu interakcji stabilizującej autoinhibicję kinazy. Czwartą grupę stanowią substytucje nukleotydowe w obszarze kodującym sekwencję pętli aktywacyjnej (A-loop, activation loop) pomiędzy 381 i 402 aminokwasem. TakŜe one mogą mieć wpływ na rozwój oporności na imatynib. Są one odpowiedzialne za rozwinięcie pętli aktywacyjnej i przejście enzymu w konformację otwartą, czyli niewraŝliwą na imatynib. NaleŜą do nich zmiany aminokwasowe: H396R, V379I oraz L387M.

Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz 203 Ostatnią grupę defektów kinazy BCR-ABL stanowią substytucje aminokwasowe rozproszone w całej cząsteczce białka. Mechanizm rozwoju oporności w tych przypadkach nie jest do końca poznany. Ich obecność nie ma bezpośredniego wpływu na proces przyłączania cząsteczki leku do kinazy BCR-ABL. Mogą one być jednak przyczyną zmniejszonej wraŝliwości na imatynib. Zwiększenie dawki leku w tych przypadkach zwykle doprowadza do przełamania lekooporności. Uproszczony podział lokalizacji defektów onkogenu BCR-ABL uwzględnia jedynie 3 grupy: mutacje p-loop (aminokwas 244 343), domeny katalitycznej (aminokwas 351 359) oraz pętli aktywacyjnej (aminokwas 379 486). Jak dotąd u pacjentów z PBSz zidentyfikowano ponad 70 róŝnych mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL prowadzących do 50 substytucji aminokwasowych. Osiemdziesiąt pięć procent dotychczas opisanych mutacji prowadzi jedynie do piętnastu substytucji aminokwasowych, a aŝ w 66% przypadków mamy do czynienia z obecnością mutacji jedynie w 7 lokalizacjach (G250, Y253, E255, T315, M351, F359, H396). W tej samej lokalizacji moŝe dochodzić do róŝnych substytucji aminokwasowych (np. F317C, F317L, czy teŝ F317V). Zjawisko to ma waŝne konsekwencje biologiczne bo prowadzi do powstania mutantów o róŝnej wraŝliwości na imatynib. Wydaje się, Ŝe obecność niektórych z mutacji częściej stwierdza się w określonych fazach choroby. I tak, substytucje w pozycjach M244, L248, F317, H396 i S417 zwykle obecne są w fazie przewlekłej, a Q252, Y253, E255, T315, E459 i F486 w bardziej zaawansowanych postaciach schorzenia [13]. Podobnie, niektóre z defektów wydają się występować częściej u pacjentów z opornością pierwotną (M244V, Y253 F/H), M351T/V), a inne u pacjentów z opornością nabytą (np. G250E, E255K/V, T315I, F359V/I) [9]. NaleŜy takŝe jednak podkreślić, Ŝe metodą random mutagenezy in vitro u chorych z PBSz opornych na imatynib zidentyfikowano około 90 moŝliwych miejsc mutacji onkogenu BCR-ABL [14, 15]. Metody wykrywania mutacji onkogenu BCR-ABL Ocena obecności mutacji domen kinazy tyrozynowej BCR-ABL u chorych opornych lub odpowiadających suboptymalnie na leczenie inhibitorami kinaz tyrozynowych jest niezbędna dla prawidłowej oceny skuteczności prowadzonej terapii. W 2006 roku opracowano wskazania do wykonywania badania u chorych z PBSz (Tabela 1) [16]. Wskazówki dotyczące wykonywania badania opublikowano takŝe w języku polskim [17]. Aktualnie stosuje się wiele technik laboratoryjnych pozwalających na wykrywanie mutacji onkogenu BCR-ABL. NaleŜą do nich bezpośrednie sekwencjonowanie [18], subklonowanie z następowym sekwencjonowaniem [19], wysokosprawna chromatografia cieczowa w warunkach denaturacyjnych [20], pyrosekwencjonowanie [21], fluoroscencyjny PCR z PNA clamping [22], PCR z uŝyciem allelospecyficznych oligonukleotydów [23, 24], SEQUENOM Mass Array [25] i ostatnio wprowadzona wysokorozdzielcza analiza krzywych topnienia amplikonów (HRM) [26]. Niestety, jak

204 K. LEWANDOWSKI dotąd nie osiągnięto konsensusu co do metody referencyjnej wykonywania analizy i raportowania uzyskanych wyników [16]. Rodzaje technik laboratoryjnych stosowanych w diagnostyce obecności mutacji onkogenu BCR-ABL, ich czułość i specyficzność, a takŝe dostępność przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 1. Proponowane wskazania do badania w kierunku obecności mutacji domen kinazy tyrozynowej BCR/ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową leczonych IKT Chorzy w fazie akceleracji/przełomu Chorzy w fazie przewlekłej w kaŝdym przypadku przy nieoptymalnej odpowiedzi na terapię IKT przy niepowodzeniu terapii IKT a) brak CHR po 3 miesiącach u chorych odpowiadających na IKT, u b) brak mcyr po 6 miesiącach których potwierdzono wzrost ilości kopii c) brak MCyR po 12 miesiącach onkogenu BCR-ABL o 1 log u kaŝdego chorego z utratą odpowiedzi chorych odpowiadających na IKT, u których potwierdzono wzrost ilości kopii onkogenu BCR-ABL o 1 log Skróty: IKT inhibitor kinazy tyrozynowej, CHR całkowita odpowiedź hematologiczna, mcyr mniejsza odpowiedź cytogenetyczna, MCyR większa odpowiedź cytogenetyczna Tabela 2. Techniki laboratoryjne stosowane w diagnostyce mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL Technika Czułość % Specyficzność Dostępność Bezpośrednie sekwencjonowanie 15 25 ++ +++ Subklonowanie i sekwencjonowanie 9 +++ ++ d-hplc, wysokosprawna chromatografia cieczowa 0,1 10 ++ ++ w warunkach denaturacyjnych Pirosekwencjonowanie 5 ++ + Elektroforeza na podwójnym gradiencie gęstości 5 ++ + i denaturacyjnym (double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis, DG-DGGE) Fluoroscencyjny PCR i PNA clamping 0,2 ++ + (peptydowe kwasy nukleinowe, peptide nucleic acids, PNA) PCR z zastosowaniem allelo-specyficznych oligonukleotydów (Allele-specific oligonucleotide PCR, ASO-PCR) 0,01 ++ + W procesie podejmowania decyzji terapeutycznych u chorych z PBSz leczonych IKT oprócz oceny ilościowej liczby kopii transkryptu genu BCR-ABL duŝe znaczenie ma informacja dotycząca obecności i rodzaju mutacji onkogenu BCR-ABL. Z pośród wymienionych metod dla celów potwierdzenia obecności defektu(ów) najczęściej stosuje się technikę bezpośredniego sekwencjonowania, której czułość nie jest jednak zbyt duŝa (Rycina 2). Okazało się jednak, Ŝe cecha ta nie jest wadą tej metody ale jej zaletą. Decydujące znaczenie dla przebiegu leczenia ma bowiem obecność mutanta w duŝym mianie. Większość z wymienionych powyŝej technik, z powodu wyŝszej czułości wykrywa

Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz 205 Lokalizacja mutacji Wynik sekwencjonowania Substytucja IC 50 dla imatynibu (nm) aminokwasowa M244V Komórkowe - 2000 Biochemiczne - 380 P-loop Y253H Komórkowe - >10000 Biochemiczne - >5000 F317L Komórkowe- 480 Biochemiczne 775 M351T Komórkowe- 930 Biochemiczne 820 Domena katalityczna F359I Komórkowe- bd Biochemiczne bd V379I Komórkowe- 1630 Biochemiczne 800 Pętla aktywacyjna E459K Komórkowe- bd Biochemiczne bd Ryc. 2. Przykłady mutacji w poszczególnych domenach kinazy tyrozynowej BCR-ABL u chorych opornych na leczenie imatynibem. Wyniki własne Skróty: IC 50 połowa maksymalnego stęŝenia hamującego, bd brak danych

206 K. LEWANDOWSKI defekty, których obecność nie ma znaczenia klinicznego (zwykle niewinny świadek ko-segregowany z nie mutacyjnym mechanizmem oporności). Z tego powodu wynik badania na obecność mutacji ma tylko znaczenie w sytuacji stwierdzenia korespondujących zmian w ocenie hematologicznej (oporność, progresja), cytogenetycznej (oporność, utrata odpowiedzi), molekularnej (nie uzyskanie większej odpowiedzi molekularnej). Dodatkową korzyścią wynikającą z potwierdzenia obecności mutacji onkogenu BCR-ABL jest moŝliwość modyfikacji strategii klinicznej (np. zwiększenie dawki, zmiana rodzaju stosowanego IKT, podjęcie decyzji odnośnie przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych), a takŝe pełniejszej oceny związku pomiędzy obecnością defektu z odpowiedzią kliniczną. Do metod skryningowych, które znalazły zastosowanie w wykrywaniu mutacji onkogenu BCR-ABL naleŝą m.in. wysokosprawna chromatografia cieczowa w warunkach denaturacyjnych (dhplc) oraz technika elektorforezy na podwójnym gradiencie gęstości i denaturacyjnym (DG-DGGE) [27]. Przykładowe obrazy DG-DGGE tworzących się produktów fragmentu 3' w przypadku obecności róŝnych mutacji oraz typu dzikiego (WT) onkogenu BCR-ABL przedstawiono na Rycinie 3. Ryc. 3. Technika DG-DGGE. Obrazy tworzących się produktów fragmentu 3' w przypadku obecności róŝnych mutacji oraz typu dzikiego (WT) onkogenu BCR-ABL. Część A heterodupleksy produktów uzyskanych po jednostopniowej amplifikacji, część B jednorodne produkty uzyskane w wyniku nested PCR, część C produkty uzyskane w wyniku nested PCR z następowym tworzeniem heterodupleksów. Odmienny obraz tworzących się heterodupleksów w przypadku tej samej substytucji aminokwasowej F317L 1 i F317L 2 będących wynikiem odmiennych substytucji nukleotydowych (1098 C>A i 1096 T>C, zgodnie z sekwencją referencyjną X16416). Wyniki własne

Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz 207 W przypadkach wykazania obecności defektu za pomocą testów skryningowych zaleca się jednak powtórzenie badania techniką sekwencjonowania. Z uwagi na stosunkowo wysoki koszt sekwencjonowania oraz nakład pracy wciąŝ jednak poszukuje się tańszych i szybszych, a przede wszystkim szerzej dostępnych metod badania mutacji onkogenu BCR-ABL. PIŚMIENNICTWO 1. O Dwyer ME, Mauro MJ, Blasdel C, et al. Clonal evolution and lack of cytogenetic response are adverse prognostic factors for hematologic relapse of chronic phase CML patients treated with imatinib mesylate. Blood 2004; 103: 451 55. 2. Cortes JE, Talpaz M, Giles F, et al. Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy. Blood 2003; 101: 3794 800. 3. Schoch C, Haferlach T, Kern W, et al. Occurrence of additional chromosome aberrations in chronic myeloid leukemia patients treated with imatinib mesylate. Leukemia 2003; 17: 461 63. 4. Weisberg E, Manley PW, Breitenstein W et al. Characterization of AMN107, a selective inhibitor of native and mutant Bcr-Abl. Cancer Cell. 2005; 7: 129-34. 5. von Bubnoff N, Manley PW, Mestan J, Sanger J, Peschel C, Duyster J. Bcr-Abl resistance screening predicts a limited spectrum of point mutations to be associated with clinical resistance to the Abl kinase inhibitor nilotinib (AMN107). Blood 2006; 108: 1328-1333. 6. Kimura S. Second generation Abl kinase inhibitors and novel compounds to eliminate the Bcr- Abl/T315I clone. Recent Patents Anticancer Drug Discov. 2006; 1: 347-55. 7. Wu J, Meng F, Lu H, Kong L, Bornmann W, Peng Z, Talpaz M, Donato NJ. Lyn regulates BCR-ABL and Gab2 tyrosine phosphorylation and c-cbl protein stability in imatinib resistant chronic myelogenous leukemia cells. Blood. 2008 Jan 30 [Epub ahead of print]. 8. Li S, Li D. Stem cell and kinase activity-independent pathway in resistance of leukaemia to BCR- ABL kinase inhibitors. J Cell Mol Med. 2007; 11: 1251-62. 9. Soverini S, Colarossi S, Gnani A, Rosti G, Castagnetti F, Poerio A, Iacobucci I, Amabile M, Abruzzese E, Orlandi E, Radaelli F, Ciccone F, Tiribelli M, di Lorenzo R, Caracciolo C, Izzo B, Pane F, Saglio G, Baccarani M, Martinelli G; GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res. 2006; 12: 7374-9. 10. Ernst T, Erben P, Müller MC, Paschka P, Schenk T, Hoffmann J, Kreil S, La Rosée P, Hehlmann R, Hochhaus A. Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance to imatinib. Haematologica 2008; 93: 186-92. 11. Gambacorti-Passerini CB, Gunby RH, Pizza R, Galietta A, Rostagno R, Scapozza L. Molecular mechanisms of resistance to imatinib In Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. Lancet Oncol. 2003: 4: 75-85. 12. Barańska M, Lewandowski K. Mutacje punktowe onkogenu BCR-ABL prowadzące do zmniejszenia wraŝliwości na terapię imatinibem. Acta Hemat. Pol. 2005; 38: 303-316. 13. Apperley JF: Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukemia. Lancet Oncol. 2007; 8: 1018 29. 14. Weisberg, P.W. Manley, S.W. Cowan-Jacob, A. Hochhaus and J.D. Griffin, Second generation inhibitors of BCR-ABL for the treatment of imatinib-resistant chronic myeloid leukaemia, Nat. Rev. Cancer 2007; 7: 345 356. 15. Volpe G, Panuzzo C, Ulisciani S, Cilloni D. Imatinib resistance in CML. Cancer Lett. 2009; 274: 1-9. 16. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: reviewand recommendations for harmonizing

208 K. LEWANDOWSKI current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006; 108: 28 37. 17. Sacha T, Lewandowski K, Foryciarz K et al. Recommendations for analysis of BCR-ABL tyrosine kinase domain gene mutations in patients with chronic meylogenous leukemia: experts opinion accepted by Polish Adult Leukemia Group. Acta Haemat. Pol. 2008; 39: 119-123. 18. Shah NP, Nicoll JM, Nagar B, Gorre ME, Paquette RL, Kuriyan J, Sawyers CL. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2002; 2: 99-102. 19. Shah NP, Nicoll JM, Nagar B, et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor Imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2002; 2: 117-125. 20. Deininger MW, McGreevey L, Willis S, Bainbridge TM, Druker BJ, Heinrich MC. Detection of ABL kinase domain mutations with denaturing high-performance liquid chromatography. Leukemia 2004; 18: 864 71. 21. Khorashad JS, Anand M, Marin D, Saunders S, Al-Jabary T, Iqbal A, et al. The presence of a BCR- ABL mutant allele in CML does not always explain clinical resistance to imatinib. Leukemia 2006; 20: 658 63. 22. Kreuzer KA, le Coutre P, Landt O, Na IK, Schwarz M, Schultheis K, et al. Preexistence and evolution of imatinib mesylate-resistant clones in chronic myelogenous leukemia detected by a PNA-based PCR clamping technique. Ann Hematol 2003; 82: 284 96. 23. Roche-Lestienne C, Soenen-Cornu V, Grardel-Duflos N, La ı JL, Philippe N, Facon T, et al. Several types of mutations of the ABL gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment. Blood 2002; 100: 1014 8. 24. Willis S, Lange T, Demehri S, Otto S, Crossman L, Niederwieser D, et al. High sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutation in imatinib-naive patient: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response therapy. Blood 2005; 106: 2128 37. 25. Vivante A, Amariglio N, Koren-Michowitz M, Ahur-Fabian O, Nagler A, Rechavi G, et al. Highthroughput, sensitive and quantitative assay for the detection of BCR-ABL kinase domain mutations. Leukemia 2007; 21: 1318 21. 26. Polakova Machova K, Lopotova T, Klamova H, Moravcova J. High-resolution melt curve analysis: Initial screening for mutations in BCR-ABL kinase domain. Leuk Res 2008; 32: 1236 1243. 27. Sorel N, Chazelas F, Brizard A, Chomel JC. Double-gradient denaturing- gel electrophoresis for mutation screening of the BCR-ABL tyrosine kinase domain in chronic myeloid leukemia patient. Clin Chem 2005; 51: 1263 1266. Praca wpłynęła do Redakcji 20.04.2009 r. i została zakwalifikowana do druku 30.04.2009 r. Adres do korespondencji: Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego Uniwersytet Medyczny w Poznaniu ul. Szamarzewskiego 84 60-569 Poznań