WPŁYW DODATKU GLICEROLU NA PRODUKCJĘ BIOMASY DROŻDŻY CANDIDA PELLICULOSA G4KB21. Tomasz Podeszwa, Marta Wilk, Małgorzata Krzywonos

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 13 (3) 2014, 13-22 ISSN 1644 065X (print) ISSN 2083 8654 (on-line) WPŁYW DODATKU GLICEROLU NA PRODUKCJĘ BIOMASY DROŻDŻY CANDIDA PELLICULOSA G4KB21 Tomasz Podeszwa, Marta Wilk, Małgorzata Krzywonos Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu Streszczenie. Głównym produktem ubocznym produkcji biodiesla, którego ilość w ostatnich latach gwałtownie wzrosła, jest odpadowy glicerol. Na tonę wytwarzanych etylowych lub metylowych estrów kwasów tłuszczowych przypada około 100 kg glicerolu odpadowego. Wykorzystanie odpadowego glicerolu jest jednym z najważniejszych wyzwań dla ochrony środowiska. Celem pracy była weryfikacja możliwości produkcji biomasy komórkowej drożdży Candida pelliculosa G4KB2 z bezwodnego glicerolu cz.d.a. podczas hodowli okresowych wytrząsanych. W pierwszym etapie badań zdolność wzrostu tych drożdży na glicerolu bezwodnym cz.d.a. sprawdzano poprzez pasażowanie ich na modyfikowane podłoża agarowe na płytkach Petriego YPDG (zawierające ekstrakt drożdżowy, pepton, glukozę i glicerol), a następnie YPG (ekstrakt drożdżowy, pepton, glicerol). Hodowle inkubowano w 30 C przez 2 dni. Wpływ stężenia glicerolu na tempo wzrostu i poziom biomasy drożdży G4KB2 przeprowadzono w dwóch powtórzeniach w podłożach zawierających różne stężenia glicerolu, tj. 2, 5, 10, 15 oraz 20%. Hodowle inkubowano w 30 C w wytrząsarce obrotowej (120 obr. min -1 ). Tempo wzrostu drożdży analizowano poprzez pomiar gęstości optycznej (620 nm), a biomasę oznaczano metodą grawimetryczną. Najwyższy poziom biomasy (13,9 g dm -3 po 24 godz. i 19,2 g dm -3 po 40 godz.) uzyskano podczas hodowli zawierającej w podłożu 10% glicerolu bezwodnego. Słowa kluczowe: biodiesel, glicerol odpadowy, biomasa drożdży, Candida pelliculosa WSTĘP Od kilku lat jednym z najważniejszych problemów polityki krajowej jak i światowej jest przyszłość energetyki. Źródłem tych problemów są m.in. kurczące się zasoby naturalne ropy naftowej, wpływające na nieustanny wzrost cen tego surowca. Problem ten, a także inne aspekty związane z ochroną środowiska, przyczyniły się do zwiększenia zaintereso- Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Małgorzata Krzywonos, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, Katedra Inżynierii Bioprocesowej, ul. Komandorska 118/120, 53-345 Wrocław, e-mail: malgorzata.krzywonos@ue.wroc.pl

14 T. Podeszwa i in. wania nowymi, alternatywnymi źródłami energii, m.in. produkcją biopaliw. Zastosowanie procesów transestryfikacji olejów roślinnych umożliwiło wytworzenie biodiesla, paliwa alternatywnego dla tradycyjnie wytwarzanego paliwa dieslowskiego. Obecnie światowa produkcja biodiesla wynosi ok. 28 mld litrów, co daje 12-krotny wzrost w stosunku do produkcji z 2004 r. (rys. 1). Produkcja biodiesla [mln dm 3 ] Biodeiesel production [bln dm 3 ] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022 2023 Lata Years Rys. 1. Produkcja biodiesla na świecie w latach 2004 2023 [http://stats.oecd.org] Fig. 1. World biodiesel production in the years 2004 2023 Według OECD (The Organisation for Economic Co-operation and Development) w 2023 r. wytwórczość biodiesla będzie wynosić ponad 40 mld litrów. Rozwijająca się na całym świecie produkcja biopaliw olejowych, czyli estrów metylowych kwasów tłuszczowych, spowodowała zwiększenie podaży produktu ubocznego tego procesu, tj. glicerolu. Występowanie w skali światowej znacznych nadwyżek odpadowego glicerolu może w przyszłości spowodować poważny problem ekologiczny. Na tonę wytworzonych etylowych lub metylowych estrów kwasów tłuszczowych przypada około 200 kg odpadowej frakcji glicerynowej, w tym około 100 kg glicerolu [Kijora i in. 1995]. Przed wylaniem produktu ubocznego do ścieków konieczne jest jego oczyszczenie z alkoholu i katalizatora, co zwiększa koszty produkcji biodiesla. Wysoki wskaźnik biologicznego zapotrzebowania na tlen (BZT) glicerolu powoduje, że oczyszczalnie niechętnie współpracują z zakładami, w których jest on wytwarzany. Ta sytuacja przyczyniła się do poszukiwania nowych, przyjaznych dla środowiska zastosowań glicerolu, które jeśli nie wpłyną na poprawę opłacalności produkcji biodiesla, to przynajmniej zmniejszą koszty związane z jego utylizacją [Wen i Pyle 2009]. Nowe kierunki wykorzystania nadmiaru odpadowego glicerolu obserwuje się głównie w przemyśle chemicznym jak i biotechnologicznym [Kośmider i Czaczyk 2009, Podeszwa i Janczar-Smuga 2011]. Okazuje się, że odpadowy glicerol może być utylizowany w procesach biotechnologicznych poprzez zastosowanie go jako jedyne źródło węgla w podłożach hodowlanych. Badania wykazały, że odpadowa frakcja glicerynowa, a także jej poszczególne składniki (glicerol, kwasy tłuszczowe, estry etylowe) są dobrymi surowcami do produkcji biomasy komórkowej mikroalg [Wen i Pyle 2009] oraz różnych gatunków drożdży, m.in. Yarrowia Acta Sci. Pol.

Wpływ dodatku glicerolu... 15 lipolityca, Candida utylis, C. tropicalis, C. robusta, Picha pastoris, Metschnikowia sp., Debaryomyces Rhodotorula mucilaginosa, R. glutinis, Cystofilobasidium capitatum i Sporobolomyces roseus [Juszczyk i in. 2005, 2012, Juszczyk i Rymowicz 2009a, b, Taccari i in. 2012, Petrik i in. 2013]. Często w badaniach wstępnych wykorzystuje się jako podłoże glicerol cz.d.a, by potwierdzić zdolności drobnoustrojów do wzrostu na podłożu zawierającym glicerol jako źródło węgla, eliminując tym samym ewentualne podejrzenie wzrostu na pozostałych 20% składników glicerolu technicznego. Ponadto, na podstawie licznych badań stwierdzono, że niektóre szczepy drożdży są zdolne do biosyntezy z glicerolu różnych metabolitów wtórnych, m.in.: kwasu cytrynowego, lipidów, karotenoidów, etanolu czy 1,2-propanodiolu [Ashby i in. 2005, Imandi i in. 2007, Morita i in. 2007, Rywińska i in. 2009, Valduga i in. 2009, Liang i in. 2010, Yu i in. 2010, Jung i in. 2011, Yen i in. 2012, Petrik i in. 2013, Rywińska i in. 2013]. Celem pracy była weryfikacja możliwości produkcji biomasy komórkowej drożdży Candida pelliculosa G4KB2 z bezwodnego glicerolu cz.d.a., będącego głównym źródłem węgla w podłożach, podczas hodowli okresowych wytrząsanych. MATERIAŁ I METODY Mikroorganizm W badaniach wykorzystano szczep drożdży Candida pelliculosa G4KB2 pochodzący z kolekcji czystych kultur Katedry Biotechnologii Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Szczep ten został wyizolowany z owoców sezonowych i jedyny spośród wszystkich 25 pozyskanych szczepów drożdży środowiskowych charakteryzował się produkcją biomasy w podłożu zawierającym glicerol techniczny jako główne źródło węgla. Szczep przechowywano na podłożu agarowym YPD na płytkach Petriego w +4 C. Podłoża hodowlane W pierwszym etapie badań zdolność wzrostu drożdży Candida pelliculosa G4KB2 na glicerolu bezwodnym cz.d.a. sprawdzano poprzez pasażowanie ich na modyfikowane podłoża agarowe na płytkach Petriego YPDG, a następnie YPG (rys. 2). Skład tych podłoży przedstawiono w tabeli 1. Zaszczepione płytki inkubowano w 30 C przez 2 dni. Kolejnym etapem doświadczenia było przeszczepienie materiału biologicznego na płynne podłoże inokulacyjne YPG (rys. 2). W komorze laminarnej dwie kolby Erlenmayera (300 cm 3 ), wypełnione 100 cm 3 jałowego podłoża płynnego YPG (ph = 5,6), zaszczepiono drożdżami pobranymi z płytek Petriego za pomocą jałowej ezy. Komórki namnażane były na wstrząsarce rotacyjnej Braun Biotech CERTOMAT S przez 48 godzin, w temperaturze 30 C przy 120 obr. min -1. Następnie podłoża inokulacyjne zostały wprowadzone do jałowej probówki (200 cm 3 ) i odwirowane w wirówce Sigma 4k15, przy szybkości obrotowej 13131 obr. min -1 przez 15 min. Osad drożdżowy został zalany podłożem YPG20% w ilości 20 cm 3. Do 25 probówek Eppendorf o objętości 1,5 cm 3 wprowadzono po 1 cm 3 tak przygotowanej szczepionki drożdżowej (rys. 2). Biotechnologia 13 (3) 2014

16 T. Podeszwa i in. Rys. 2. Uproszczony schemat przygotowania podłoży do badań nad wpływem stężenia glicerolu na przyrost biomasy drożdży C. pelliculosa G4KB2 Fig. 2. Simplified diagram of the preparation of substrates to study the effect of glycerol concentration on the growth of yeast biomass C. pelliculosa G4KB2 Absorbacja [-] Absorbance Rys. 3. Wpływ stężenia glicerolu na wzrostu biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2 Fig. 3. Effect of glycerol concentration on the biomass growth of the yeast Candida pelliculosa G4KB2 t [h] Acta Sci. Pol.

Wpływ dodatku glicerolu... 17 Tabela 1. Skład i przeznaczenie podłoży Table 1. The composition and function of substrates Nazwa Name Agar YPD Agar YPDG Agar YPG Bulion YPG broth YPG Podłoże YPG2% Medium YPG2% Podłoże YPG5% Medium YPG5% Podłoże YPG10% Medium YPG10% Podłoże YPG15% Medium YPG15% Podłoże YPG20% Medium YPG20% Skład Composition glukoza 20 g, pepton P 20 g, ekstrakt drożdżowy Y 10 g, agar 20 g, woda destylowana 1 dm 3 glucose 20 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, agar 20 g, distilled water 1 dm 3 glukoza 10 g, glicerol bezwodny cz.d.a. 10 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, agar 20 g, woda destylowana 1 dm 3 glucose 10 g, glycerol anhydrous p.a. 10 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, agar 20 g, distilled water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 20 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, agar 20 g, woda destylowana 1 dm 3, glycerol anhydrous p.a. 20 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, agar 20 g, distilled water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 20 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, woda destylowana 1 dm 3, glycerol anhydrous p.a. 20 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, distilled water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 20 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, woda wodociągowa 1 dm 3 glycerol anhydrous p.a. 20 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, tap water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 50 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 1 0 g, woda wodociągowa 1 dm 3 glycerol anhydrous p.a. 50 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, tap water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 100 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, woda wodociągowa 1 dm 3 glycerol anhydrous p.a. 100g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, tap water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 150 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, woda wodociągowa 1 dm 3 glycerol anhydrous p.a. 150 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, tap water 1 dm 3 glicerol bezwodny cz.d.a. 200 g, pepton 20 g, ekstrakt drożdżowy 10 g, woda wodociągowa 1 dm 3 glycerol anhydrous p.a. 200 g, peptone 20 g, yeast extract 10 g, tap water 1 dm 3 Zastosowanie Application przechowywanie drożdży na płytkach Petriego storing yeast on Petri dishes pierwszy etap uzdolnienia drożdży do wzrostu na podłożu z glicerolem first step of growing yeast on medium with glycerol drugi etap uzdolnienia drożdży C.p. do wzrostu na podłożu z glicerolem second step of growing yeast on medium with glycerol hodowle inokulacyjne dla procesów prowadzonych na wytrząsarce inoculation processes carried out in shake-flasks analiza przyrostu biomasy w hodowlach wytrząsanych analysis of biomass growth during shake-flasks cultures Ocenę wpływu stężenia glicerolu na tempo wzrostu i poziom biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2 przeprowadzono w trakcie hodowli wytrząsanych w podłożach: YPG2%, YPG5%, YPG10%, YPG15% oraz YPG20% (n = 2) (tab. 1) (rys. 2). Temperatura i prędkość obrotowa wytrząsarki były takie same jak w przypadku hodowli inokulacyjnej. Odczyn ph podłoża ustalono na poziomie 5,6, używając 2M H 2. Wodę destylowaną zastąpiono wodą wodociągową ze względu na źródło mikro- i makroelementów. Inokulum stanowiło 0,1% objętości płynu hodowlanego. Biotechnologia 13 (3) 2014

18 T. Podeszwa i in. Metody analityczne Tempo wzrostu drożdży analizowano co 2 godziny poprzez pomiar gęstości optycznej (próba 5 cm 3 ) przy długości fali λ = 620 nm na spektrofotometrze (SP-830 PLUS/ Metertech). Biomasę oznaczano metodą grawimetryczną. Glicerol oraz metabolity wtórne oznaczano metodą HPLC (Knauer; detektory UV-VIS and RI; typ kolumny, Phenomenex ROA organic acids; wymiary kolumny, 7,8 mm i.d. 30 mm, eluent 0,2 mm H 2 ; szybkość przepływu, 0,5 cm 3 min -1 ; temperatura, 65 C). Długość fali 210 nm. Objaśnienia użytych skrótów: μ szybkość właściwa wzrostu [h -1 ] specific biomass grow rate [h -1 ] Y C wydajność całkowita biomasy [g biomasy/g początkowego stężenia glicerolu w podłożu] total biomass yield [g biomass/g initial glycerol concentration] Y P/S 24,Y P/S 40 wydajność biomasy [g biomasy/g wykorzystanego glicerolu w podłożu] po 24 i 40 godz. [g g -1 ] biomass yield [g biomass/g used glycerol concentration] after 24 and 40 h [g g -1 ] Q 24, Q 40 szybkość produkcji biomasy odpowiednio po 24 i 40 godz. [g dm -3 h -1 ] volumetric biomass production rate after 24 and 40 h [g dm -3 h -1 ] OMÓWIENIE WYNIKÓW Tempo wzrostu drożdży C. pelliculosa G4KB2 w trakcie trwania hodowli wytrząsanej, a także poziom biomasy po 24 i 40 godz. zależały od stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym (2 20%) (rys. 3, tab. 2). Najwyższa wartość szybkości właściwej μ uzyskana w niniejszej pracy wynosiła 0,1841 h -1. Gdy podłoże zawierało 15 i 20%, wartość ta była niewiele niższa i wynosiła odpowiednio 0,1779 i 0,1787 h -1. Najniższą wartość tego parametru (0,0626 h -1 ) otrzymano w hodowlach w podłożu zawierającym najmniejszą ilość glicerolu, tj. 2% (tab. 2). Średnia wartość właściwej szybkości wzrostu (μ) Yarrowia lipolytica w obecności 1% glicerolu wyznaczona dla czasu 0 24 godz. określonego przedziału czasu hodowli mieściła się w zakresie od 0,008 do 0,077 h -1 [Robak 2007]. W prezentowanych badaniach dla tego samego okresu wartość μ wynosiła od 0,1053 do 0,1121 h -1. Tabela 2. Produkcja biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2 po 24 i 40 godz. hodowli wstrząsanych, w podłożach zawierających różne stężenie glicerolu Table 2. Biomass of the yeast Candida pelliculosa G4KB2 after 24 and 40 h of shake- flask culture in media containing various concentrations of glycerol Wariant podłoża Variant of culture medium 24 h 40 h Biomasa [g dm -3 ] Biomass Szybkość właściwa [h -1 ] Specific growth rate Szybkość właściwa [h -1 ] Specific growth rate (0 24 h) YPG 2% 7,8 7,9 0,0626 0,1121 YPG 5% 7,6 7,8 0,1529 0,1053 YPG 10% 13,9 19,2 0,1841 0,1107 YPG 15% 10,1 13,25 0,1779 0,1108 YPG 20% 12,4 16,5 0,1787 0,1153 Acta Sci. Pol.

Wpływ dodatku glicerolu... 19 W niniejszej pracy wydajność całkowita biomasy wykazywała duże zróżnicowanie w zależności od użytego stężenia glicerolu w podłożu oraz czasu trwania hodowli (tab. 3). Najwyższą wydajność na poziomie 0,39 g g -1 (po 24 h i 40 h) stwierdzono w hodowli z użyciem podłoża z 20 g dm -3 glicerolu cz.d.a. W badaniach Juszczyka i in. [2012] wydajność procesu produkcji biomasy drożdży Pichia pastoris z wykorzystaniem glicerolu kosmetycznego była wyższa i osiągnęła wartości 0,44 0,59 g g -1 w zależności od ph podłoża. W niniejszej pracy dużo niższe wartości wydajności po 24 godz. (0,06 0,15 g g -1 ) i po 40 godz. (0,08 0,19 g g -1 ) otrzymano w pozostałych hodowlach z wyższym stężeniem glicerolu. Tak niską wydajność procesu produkcji można tłumaczyć brakiem zdolności drożdży C. pelliculosa G4KB2 do utylizacji wyższych niż 2% stężeń glicerolu oraz brakiem skomponowania optymalnych warunków rozwoju drożdży w podłożu (ph, zawartość mikro- i makroelementów, szybkość obrotowa, temperatura). Tabela 3. Wydajność całkowita (Y P/S ) i objętościowa szybkość produkcji biomasy (Q) w zależności od stężenia glicerolu w podłożu Table 3. Effect of glycerol concentration in the medium on total yield biomass production (g g -1 ) and volumetric biomass production rate (Q) Medium Y C24 [g g -1 ] Y P/S 24 [g g -1 ] Y C40 [g g -1 ] Y P/S 40 [g g -1 ] Q 24 [g dm -3 h -1 ] Q 40 [g dm -3 h -1 ] YPG2% 0,39 1,22 0,39 1,20 0,33 0,20 YPG5% 0,15 0,29 0,15 0,28 0,32 0,20 YPG10% 0,14 0,39 0,19 0,49 0,58 0,48 YPG15% 0,07 0,30 0,09 0,36 0,42 0,33 YPG20% 0,06 0,35 0,08 0,43 0,52 0,41 Szybkość produkcji biomasy kształtowała się na poziomie od 0,32 do 0,58 g dm -3 h -1 po 24 godz. oraz od 0,20 do 0,48 g dm -3 h -1 i zależała od stężenia glicerolu w podłożu. Największą produktywność biomasy uzyskano w wariancie hodowli z udziałem 10% glicerolu cz.d.a. (0,58 g dm -3 h -1 po 24 godz. i 0,48 g dm -3 h -1 po 40 godz.). Wyniki szybkości produkcji biomasy w niniejszej pracy są zdecydowanie niższe niż otrzymali Juszczyk i in. [2012] dla drożdży Pichia pastoris na glicerolu kosmetycznym (1,32 1,71 g dm -3 h -1 ). Uzyskana ilość biomasy drożdży C. pelliculosa G4KB2 w podłożu zawierającym 10% glicerolu jest wynikiem bardzo obiecującym i porównywalnym z wynikami produkcji biomasy innych gatunków drożdży. Taccari i in. [2012] przeprowadzili badania dotyczące możliwości wzrostu i optymalizacji produkcji biomasy wybranych drożdży w podłożu wzbogacanym czystym i technicznym glicerolem. Spośród 113 przebadanych przez nich szczepów, należących do rodzajów Candida, Debaryomyces, Lachancea, Kluyveromyces, Tetrapisispora, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Yarrowia, Rhodotorula, Metschnikowia, Aureobasidium, Kodamaea i Amauroascus, aż 45 charakteryzowało się dobrym wzrostem na czystym glicerolu. Dwadzieścia trzy szczepy były zdolne do produkcji biomasy drożdży w ilości porównywalnej z tymi hodowanymi w podłożu zawierającym glukozę (12 17 g dm -3 ). Dzięki zastosowaniu metodologii powierzchni odpowiedzi (RSM) ustalono optymalne stężenie glicerolu technicznego i temperaturę hodowli wstrząsanej do produkcji biomasy drożdży przez szczepy Yarrowia lipolytica DiSVA C 12.1 (60 g dm -3 glicerolu technicznego; temperatura 25 C 25,7 g dm -3 biomasy), Biotechnologia 13 (3) 2014

20 T. Podeszwa i in. Metschnikowia sp. DiSVA 50 (60 g dm -3 ; 27 C 22 g dm -3 biomasy), Debaryomyces sp. DiSVA 45/9 (38 g dm -3 ; 26 C 19,8 g dm -3 biomasy) i Rhodotorula mucilaginosa DiSVAC 7.1 (60 g dm -3 ; 25 C 20,5 g dm -3 biomasy). Wyniki te wskazują, że glicerol techniczny może być wykorzystywany jako główne źródło węgla w hodowli wyżej wymienionych drożdży do produkcji biomasy, a osiągnięte wyniki nie odbiegają znacznie od tych uzyskanych w niniejszej pracy (19 g dm -3 biomasy). Należy jednak zauważyć, że stężenie glicerolu w podłożu, w przypadku hodowli C. pelliculosa G4KB2, było o 40 g dm -3 wyższe niż u Taccari i in. [2012] w porównaniu z hodowlą drożdży Yarrowia lipolytica DiSVA C 12.1, Metschnikowia sp. DiSVA 50, Rhodotorula mucilaginosa DiSVAC 7,1 i o 62 g dm -3 wyższe w porównaniu z hodowlą drożdży Debaryomyces sp. DiSVA 45/9. Hodowle te prowadzone były również w innych temperaturach oraz w podłożach z glicerolem o innym stopniu czystości. Juszczyk i Rymowicz [2009b] wykorzystywali w swoich badaniach frakcję glicerynową jako główne źródło węgla w hodowli szczepu Y. lipolytica ATCC 8661 UV 1. Celem tych badań była optymalizacja dawki (NH 4 ) 2, KH 2 PO 4, autolizatu drożdży i stopnia natlenienia pożywki dla procesu produkcji biomasy. Wykazano, że najwyższy poziom biomasy uzyskano (około 17 19 g dm -3 ) w hodowlach z dodatkiem 10 g dm -3 (NH 4 ) 2 i 34 cm 3 dm -3 autolizatu drożdży, 0,125 g dm -3 KH 2 PO 4 i stopniem natlenienia na poziomie 35%. W innych badaniach Juszczyk i in. [2012] analizowali wpływ ph i stężenia metanolu na produkcję biomasy drożdży Pichia pastoris. Najwyższy poziom biomasy (19,4 g dm -3 ) uzyskano w podłożu zawierającym 30 g gliceryny odpadowej z dodatkiem (NH 4 ) 2, KH 2 PO 4, Mg 7H 2 O, metanolu (5 g dm -3 ) i wody wodociągowej w ph 4,0. W obu przypadkach najwyższe stężenia biomasy są niemal identyczne z wynikiem uzyskanym przez szczep C. pelliculosa G4KB2, jednak należy zaznaczyć, że hodowle te były prowadzone w bioreaktorze w podłożach syntetycznych z wykorzystaniem glicerolu odpadowego jako główne źródło węgla o czystości 45 50%. Duarte i in. [2013] w swoich badaniach wykorzystywali glicerol odpadowy, wytworzony przy syntezie biodiesla, do analizy potencjału tłuszczowego dzikich drożdży. Wstępna selekcja przeprowadzona za pomocą techniki barwienia Sudanem czarnym B umożliwiła wybór 5 spośród 129 badanych szczepów wykorzystywanych do dalszych analiz. Hodowle prowadzono w kolbach Erlenmayera zawierających 200 cm 3 podłoża o składzie (g dm -3 ): 30 czysty lub surowy glicerol (42,4% w/v); 7 KH 2 PO 4 ; 2,5 Na 2 HPO 4 ; 1,5 Mg 7H 2 O; 0,15 CaCl 2 ; 0,15 FeCl 3 6H 2 O; 0,02 Zn 7H 2 O; 0.06 Mn H 2 O; 0,5 (NH 4 ) 2 ; 0,5 ekstrakt drożdżowy; ph 6,0, Hodowle inkubowano w temperaturze 28 C w wytrząsarce obrotowej (185 obr. min -1 ). Największą zawartość lipidów w hodowli na czystym i surowym glicerolu (20,46 i 56,58%) i najwyższy poziom biomasy (11,86 i 16,12 g dm -3 ) uzyskano przy wykorzystaniu szczepu LEB-M3, który został zidentyfikowany genotypowo jako szczep z rodzaju Candida. Petrik i in. [2013] przeprowadzili eksperyment dotyczący analizy wpływu glicerolu technicznego i odpadowego (83%) w podłożu hodowlanym (40 g dm -3 podłoża) na produkcję biomasy drożdży z rodzaju Rodothorula, Cystofilobasidium i Sporobolomyces. Wszystkie przebadane szczepy były zdolne do utylizacji glicerolu jako jedynego źródła węgla w podłożu. Najlepsze wyniki plonu biomasy uzyskano z wykorzystaniem glicerolu odpadowego (a) i technicznego (b) w przypadku drożdży R. glutinis (a: 17,25 g dm -3 ; b: 17,99 g dm -3 ), R. aurantiaca (a: 19,92 g dm -3 ; b: 21,16 g dm -3 ), C. capitanum (a: 21,76 g dm -3 ; b: 22,53 g dm -3 ) i S. shibatanus (a: 20,52 g dm -3 ; Acta Sci. Pol.

Wpływ dodatku glicerolu... 21 b: 19,90 g dm -3 ). Wyniki te uzyskano w 75-godzinnych hodowlach bioreaktorowych w 28 C. Na podstawie nieznacznych różnic w wynikach badań można przypuszczać o zdolności utylizacji glicerolu odpadowego przez szczep C. pelliculosa G4KB2 na równie wysokim poziomie co w prezentowanej pracy. Na podstawie nieznacznych różnic w uzyskanych wydajnościach biomasy cytowanych autorów można przypuszczać, że zdolności utylizacji glicerolu odpadowego przez szczep C. pelliculosa G4KB2 oraz plonu biomasy są na równie wysokim poziomie co w prezentowanej pracy. PODSUMOWANIE Na podstawie uzyskanego plonu biomasy drożdży C. pelliculosa G4KB2 w opisanych badaniach można stwierdzić, że szczep ten jest zdolny do utylizacji glicerolu i produkcji porównywalnych ilości biomasy ze szczepami z rodzaju Yarrowia, Debaryomyces, Rhodotorula, Metschnikowia i Candida. Kolejnym etapem badań będzie optymalizacja składu podłoża i warunków prowadzenia procesu w podłożach zawierających glicerol bezwodny, techniczny i odpadowy oraz analiza powstających metabolitów. PIŚMIENNICTWO Ashby R., Nuñez A., Solaiman D., Foglia, T., 2005. Sophorolipid biosynthesis from a biodiesel coproduct stream. J. Am. Oil Chem. Soc., 82, 625 630. Duarte S.H., de Andrade C.C., Ghiselli G., Maugeri F., 2013. Exploration of Brazilian biodiversity and selection of a new oleaginous yeast strain cultivated in raw glycerol. Bioresour Technol. 138, 377 381. Imandi S.B., Bandaru V.R., Somalanka S.R., Garapati H.R., 2007. Optimization of medium constituents for the production of citric acid from byproduct glycerol using Doehlert experimental design. Enzym. Microb. Technol., 40, 1367 1372. Jung J.Y., Yun H.S., Lee J.W., Oh M.K., 2011. Production of 1,2-propanediol from glycerol in Saccharomyces cerevisiae. J. Microbiol. Biotechnol., 21, 846 853. Juszczyk P., Musiał I., Rymowicz W., 2005. Dobór szczepów drożdży do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 4, 65 76. Juszczyk P., Rymowicz W., 2009a. Microbial bioconversion of Raw glycerol. Nova Publish. Juszczyk P., Rymowicz W., 2009b. Optymalizacja procesu produkcji drożdży paszowych z odpadowego glicerolu. Inż. Ap. Chem., 48, 5, 40 41. Juszczyk P., Rymowicz W., Liszka P., 2012. Produkcja biomasy Pichia pastoris z surowców odpadowych z produkcji biodiesla. Inż. Ap. Chem., 51, 4, 138 140. Kijora C., Bergner H., Kupsch R.-D., Hagemann L., 1995. Glycerin als Futterkomponente in der Schweinemast. Arch. Tierernahr., 47, 345 360. Kośmider A., Czaczyk K., 2009. Perspektywy wykorzystania glicerolu. Post. Mikrobiol., 48, 277 87. Liang Y., Cui Y., Trushenski J., Blackburn J.W., 2010. Converting crude glycerol derived from yellow grease to lipids through yeast fermentation. Bioresour. Technol., 101, 7581 7586. Morita T., Konishi M., Fukuoka T., Imura T. Kitamoto D., 2007. Microbial conversion of glycerol into glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by a basidiomycete yeast, Pseudozyma antarctica JCM 10317T. J. Biosci. Bioeng., 104, 78 81. Petrik S., Marova I., Haronikova A., Kostovova I., Breierova E., 2013. Production of biomass, carotenoid and other lipid metabolites by several red yeast strains cultivated on waste glycerol from biofuel production a comparative screening study. Annals Microbiol., 63, 4, 1537 1551. Biotechnologia 13 (3) 2014

22 T. Podeszwa i in. Podeszwa T., Janczar-Smuga M., 2011. Kierunki zagospodarowania odpadowego glicerolu. Nauki Inżynierskie i Technologie. 3, 165 184. Robak M., 2007. Yarrowia lipolytica specific growth rate on acetate medium supplemented with glucose, glycerol or ethanol Acta Sci. Pol. Biotechnol. Biotechnologia, 6 (1), 23 31 Rywińska A., Rymowicz W., Żarowska B., Wojtatowicz M., 2009. Biosynthesis of citric acid from glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica in fed-batch fermentation. Food Technol. Biotechnol., 47, 1 6. Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W., 2013. Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications. Biomass Bioenerg, 48, 148 166. http://stats.oecd.org Taccari M., Canonico L., Comitini F., Mannazzu I., Ciani M., 2012. Screening of yeasts for growth on crude glycerol and optimization of biomass production. Bioresour Technol., 110, 488 495. Valduga E., Tatsch P.O., Tiggemann L., Zeni J., Colet R., Cansian J.M., Treichel H., Luccio M., 2009. Evaluation of the conditions of carotenoids production in a synthetic medium by Sporidiobolus salmonicolor (CBS 2636) in a bioreactor. Int. J. Food Sci. Technol., 44, 2445 2451. Wen Z., Pyle D.J., 2009. Athalye SK Production of omega-3 polyunsaturated fatty acids from biodiesel-derived crude glycerol by microalgal and fungal fermentation. Microbial conversions of raw glycerol. New York: Nova Science Publishers Inc., 41 63. Yen H.-W., Yang Y.-C., Yu Y.-H., 2012. Using crude glycerol and thin stillage for the production of microbial lipids through the cultivation of Rhodotorula glutinis. J. Biosci. Bioeng., 114, 453 456. Yu K.O., Kim S.W., Han S.O., 2010. Engineering of glycerol utilization pathway for ethanol production by Saccharomyces cerevisiae. Bioresour. Technol., 101, 4157 4161. EFFECT OF GLYCEROL CONCENTRATION ON BIOMASS GROWTH OF YEAST CANDIDA PELLICULOSA G4KB2 Abstract. The main by-product of biodiesel production, which in recent years has rocketed, is raw glycerol. Per ton of produced ethyl or methyl esters of fatty acids about 100 kg of raw glycerol was obtained. Utilization of raw glycerol is one of the most important and serious challenge in the environment protection. The aim of the study was to verify the production possibility of the cell biomass yeast Candida pelliculosa G4KB2 on pure glycerol in shake-flask cultures. In the first stage of the study, ability of growth on pure glycerol yeast Candida pelliculosa G4KB2 was checked by passaging them in a modified agar Petri dishes YPDG (YE, peptone, dextrose, glycerol) then YPG (YE, peptone, glycerol). Cultures incubated at 30 C for 2 days. Effect of glycerol concentration on the growth rate and biomass of G4KB2 were performed in duplicate in media containing: 2, 5, 10, 15 and 20% of glycerol. Cultures were incubated at 30 C on an orbital shaker (120 rpm). The growth rate of the yeast was analyzed by measuring the optical density and biomass concentration was determined gravimetrically. The highest biomass growth (13.9 g dm -3 at 24 h and 19.2 g dm -3 after 40 h) was obtained during culture in medium containing 10% of pure glycerol. Key words: biodiesel, raw glycerol, yeast biomass, Candida pelliculosa Zaakceptowano do druku Accepted for print: 30.12.2014 Do cytowania For citation: Podeszwa T., Wilk M., Krzywonos M., 2014. Wpływ dodatku glicerolu na produkcję biomasy drożdży Candida pelliculosa G4KB2. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 13 (3), 13 22. Acta Sci. Pol.