Pol., 08, Sci. Acta WEGO IA. u 1. dowli. g dm kwas. i 2,7. paliw do do z ho- w latach 25,

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 7(4) 2 8, WYKORZYSTANIE GLICEROLU ODPADOWEGO DO BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOW WEGO PRZEZZ YARROWIALIPOLYTICA WRATISLAVI IA AW G7* Anita Rywi ska Uniwersytet Przyrodniczy we Wroc awiu u 1 Streszczenie. Odpadowy glicerol z produkcji biodiesla, zawieraj cy 35 g dm -3 glicerolu, zastosowano jako substratt w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego przezz mutanta octa- nowego Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. W czasie 14 h procesu u yty w badaniach szczep produkowa 133,,4 g dm -3-3 kwasu cytrynowego i 2,7 g dm kwasu izocytrynowego z szybko ci produkcji i wydajno ci kwasu cytrynowego, odpo- wiednio,95 g dm -3 h -1 i,67 g gg -1. St enie ca kowite pozosta ych kwasów organicznych: kwasu jab kowego, -ketoglutarowego i fumarowego nie przekracza o 6 g dm -3. Ponadto, w hodowli stwierdzono obecno polioli, takich jak erytrytol i mannitol, których st enie na ko cu procesu wynosi o odpowiednio 9,8 i 2,7 g dm -3. S owa kluczowe: lipolytica kwas cytrynowy, glicerol odpadowy, hodowla fed-batch, Yarrowia WST P Dyrektywa Unii Europejskiej 23/3/EC z dnia 8 maja 23 r. wprowadzi a zapis stosowania dodatku biokomponentów (bioetanolu i biodiesla) do paliw konwencjonal- do nych przez kraje cz onkowskie Unii Europejskiej w ilo ci 5,75% do 21 r. i 2% 22 roku. W zwi zku z tym nakazem dynamicznie zacz a rozwija si produkcja estrów metylowych wy szych kwasów t uszczowych FAME (fatty acid methyl esters), tzw. biodiesla. Do produkcji tego biokomponentu u ywane s oleje ro linne, np. rzepa- kowy, palmowy, s onecznikowy, sojowy lub t uszcze zwierz ce [ Fukuda i in. 21, Marchetti i in. 27]. W przysz o ci du e nadziejee b d zwi zane z wykorzystaniem do produkcji biodiesla t uszczów pochodzenia mikrobiologicznego uzyskiwanego z ho- dowli alg i dro d y [Dunahay i in. 1996, Ratledge i Wynn 22, Ratledgee 24, * Badaniaa realizowane w ramach grantu MNiSW 2P6T w latach Adres do korespondencji Corresponding author: Anita Rywi ska, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywno ci, Uniwersytet Przyrodniczy we Wroc awiu, ul. C.K. Norwida 25, Wroc aw,

2 14 A. Rywi ska Guschina i Harwood 26, Li i in. 26]. Rodzaj zastosowanego oleju do produkcji biodiesla i stopie jego rafinacji ma du y wp yw na przebieg procesu transestryfikacji triacyloglicerydów i na jako uzyskanego produktu [Altiparmak i in. 27]. FAME mog by stosowane jako paliwo do silników z zap onem samoczynnym (Diesla) lub do systemów grzewczych [Hirschmann i in. 25]. Produktem ubocznym w procesie otrzymywania estrów metylowych jest glicerol. Szacuje si, e w niedalekiej przysz o- ci w Europie b dzie powstawa o ok. 1 miliona ton surowego glicerolu rocznie. Zagospodarowanie tak du ej ilo ci taniego glicerolu wymaga poszukiwania nowych metod jego waloryzacji w cenniejsze produkty chemiczne. Jednym z interesuj cych rozwi za jest wykorzystanie go jako ród a w gla i energii w procesach mikrobiologicznych. Glicerol by z powodzeniem wykorzystywany w procesach fermentacyjnych do biosyntezy 1,3-propanodiolu [Chen i in. 23, Papanikolaou, Aggelis 23], kwasu bursztynowego [Lee i in. 21], wodoru i alkoholu etylowego [Ito i in. 25], czy dihydroksyacetonu [Bories i in. 1991]. W procesach tlenowych glicerol jako substrat stosowano do produkcji Single-Cell-Oil [Papanikolaou i in. 28], erytrytolu [Rymowicz i in. 28], dro d y paszowych [Juszczyk i in. 25] i kwasu cytrynowego [Papanikolaou i in. 22, Rymowicz i in. 26]. Wed ug bada Rymowicza i in. [26] oraz Papanikolaou i in. [22] proces biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu przez dro d e Yarrowia lipolytica zachodzi z wydajno ci ok. 6%, a st enie ko cowe kwasu w brzeczce jest w zakresie od 73 do 14 g dm -3. Takie wyniki s na tyle korzystne, e proces dro d owej fermentacji cytrynowej na glicerolu mo e by interesuj cym alternatywnym rozwi zaniem technologicznym do procesu ple niowego z udzia em grzybów Aspergillus niger. W procesie biosyntezy kwasu cytrynowego stosowano zarówno glicerol o czysto- ci technicznej, jak i glicerol odpadowy o ró nym stopniu oczyszczenia i zawarto ci glicerolu [Levinson i in. 27]. Glicerol odpadowy mo e zawiera tak e niewielkie ilo ci estrów, metanol oraz znaczne ilo ci soli [Papanikolaou i in. 28]. Zanieczyszczenia te mog mie istotny wp yw na przebieg wzrostu dro d y i proces produkcji kwasu cytrynowego. Niewiele jest bada po wi conych wykorzystaniu surowców o niskiej zawarto ci glicerolu w takich procesach biosyntezy. Celem pracy jest ocena przydatno ci odpadowego glicerolu pochodz cego z produkcji estrów metylowych o niskiej zawarto ci glicerolu do biosyntezy kwasu cytrynowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. MATERIA Y I METODY Mikroorganizm. W badaniach stosowano szczep dro d y Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 o g adkim fenotypie kolonii, otrzymany przez Rywi sk i in. [23]. Szczep jest mutantem octanowym (oct - ), pochodzi z kolekcji w asnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii ywno ci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wroc awiu, a przechowywano go na skosach YM, w temp. 4 C. Pod o a. Pod o e inokulacyjne mia o sk ad (g dm -3 ): glicerol 5,; ekstrakt dro d owy 3,; ekstrakt s odowy 3,; bactopepton 5,; woda destylowana do 1 litra. Do pod o a produkcyjnego u yto nast puj cych sk adników (g dm -3 ): glicerol 9,; NH 4 Cl 3,; MgSO 4 x 7H 2 O 1,; KH 2 PO 4,2; ekstrakt dro d owy 1,; woda wodoci gowa do 1 litra. W czasie hodowli pod o e produkcyjne dwukrotnie (po 24 i 48 h) zasilono roztworem glicerolu odpadowego (po ok. 22 cm 3 ), tak aby st enie ca kowite glicerolu wynosi o 2 g dm -3 (przy obj to ci roboczej zbiornika 1,3 dm 3 ). Acta Sci. Pol.

3 Wykorzystanie glicerolu Surowiec. W badaniach stosowano oczyszczony glicerol odpadowy pochodz cy z produkcji estrów metylowych (biorafineria SG BODDINS GmbH, Niemcy), zawieraj cy 35 g dm -3 glicerolu i,65 g dm -3 NaCl. Warunki prowadzenia hodowli. Hodowle inokulacyjne prowadzono na wstrz sarce rotacyjnej typu Elpan przy 16 rpm w 25 cm 3 kolbach sto kowych zawieraj cych 25 cm 3 pod o a inokulacyjnego przez 72 godz. w temp. 3 C. Do zaszczepienia pod o a produkcyjnego w bioreaktorze u ywano 5 cm 3 zawiesiny komórek namno onych w hodowli inokulacyjnej. Bezpo rednio po zaszczepieniu obj to pod o a produkcyjnego wynosi a ok.,85 dm 3. Proces biosyntezy kwasu cytrynowego by prowadzony w 3,5-litrowym bioreaktorze typu BIOFLO III (New Brunswick, USA), o obj to ci roboczej zwi kszaj cej si od,85 do 1,3 dm 3, przy szybko ci przep ywu powietrza,2 vvm, szybko ci obrotowej mieszad a 6 rpm, w temp. 3 C. W czasie procesu ph utrzymywano automatycznie na poziomie 5,5 za pomoc 4% NaOH. Metody analityczne. Biomas oznaczano metod wagow. Kwas izocytrynowy (ICA) oznaczano metod enzymatyczn przy udziale dehydrogenazy cytrynianowej [Goldberg i Ellis 1983]. St enie kwasu cytrynowego (KC), kwasu fumarowego (FUM), kwasu jab kowego (MAL), kwasu -ketoglutarowego (KET), glicerolu (GLY), erytrytolu (ER) i mannitolu (MAN) oznaczano metod HPLC na kolumnie Aminex HPX87H pod czonej do detektorów UV ( =21 nm) i RI w temperaturze pokojowej. Szybko przep ywu fazy ciek ej (2 mm H 2 SO 4 ) przez kolumn wynosi a,6 cm 3 min -1. Spis u ytych symboli q KC = szybko w a ciwa produkcji kwasu cytrynowego specific citric acid production rate (g g -1 h -1 ) Q KC = szybko produkcji kwasu cytrynowego volumetric citric acid production rate (g dm -3 h -1 ) Y KC = wydajno ca kowita kwasu cytrynowego total yield of citric acid (g g -1 ) OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Szczegó owej analizie poddano przebieg procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu przez szczep Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. St enie ca kowite glicerolu w tym procesie wynosi o 2 g dm -3. Ca kowite wyczerpanie glicerolu nast pi o w 14 h hodowli (rys. 1). Zawarto biomasy w 24 h hodowli wynosi a 26 g dm -3, jednak po ka dym zasileniu pod o a hodowlanego roztworem glicerolu zwi ksza a si obj to robocza reaktora z,85 do 1,3 dm 3, co spowodowa o obni enie zawarto ci biomasy do ok. 14,5 g dm -3 w 6 h hodowli. Czynnikiem limituj cym wzrost dro d y Y. lipolytica Wratislavia AWG7 by NH 4 Cl na poziomie 3 g dm -3. W przypadku stosowania surowców odpadowych nale y liczy si z obecno ci w nich ró nych zanieczyszcze, w tym dodatkowych róde azotu, które mog zwi kszy st enie biomasy, inne mog ogranicza wzrost dro d y. W analogicznej hodowli tego szczepu poprowadzonej w pod o u z czystym glicerolem ilo biomasy by a wy sza i wynosi a 19 g dm -3 [Rywi ska i in. 29]. Prawdopodobnie, wykorzystany w niniejszej pracy surowiec zawiera czynniki, które hamuj wzrost dro d y. W 14 h procesu fed-batch uzyskano 133,4 g dm -3 kwasu cytrynowego z wydajno ci,67 g g -1 (tab. 1). Ten sam szczep produkowa znacznie ni sze ilo ci kwasu Biotechnologia 7(4) 28

4 16 A. Rywi ska cytrynowego (88,1 g dm -3 ) z wydajno ci,44 g g -1 (z 2 g dm -3 glicerolu) w hodowli periodycznej [Rymowicz, in. 26]. Wed ug wielu autorów system fed-batch, w którym substrat jest dodawany w kilku porcjach lub w sposób ci g y, jest lepszym rozwi zaniem hodowlanym w przypadku stosowania wysokich st e substratu [Levišauskas i in. 26, Limtong i in. 1987]. Ponadto, wydajno produktu jest generalnie wy sza w porównaniu do procesów okresowych [Kim i in. 27]. Wysokie ko cowe st enie kwasu cytrynowego w brzeczce oraz wydajno ca kowita kwasu cytrynowego w przeprowadzonym procesie fed-batch przez szczep Wratislavia AWG7 s porównywalne z wynikami uzyskanymi przez innych autorów [Levinson i in. 27, Papanikolaou i Aggelis 23, Papanikolaou i in. 28]. Levinson i in. [27] analizowali uzdolnienia do produkcji kwasu cytrynowego z czystego glicerolu dwudziestu siedmiu szczepów z gatunku Y. lipolytica, dwóch szczepów Aciculoconidium aculeatum oraz trzech szczepów Candida sp. Najwy sz koncentracj kwasu cytrynowego (21,8 g dm -3 ) oraz najwy sz wydajno (,545 g g -1 ), otrzymano w hodowli szczepu Y. lipolytica NRRL YB-423, przy pocz tkowym st eniu glicerolu 4 g dm -3. Szczep Y. lipolytica ACA-DC 519 zastosowany przez Papanikolaou i in. [28] w pod o u zawieraj cym 164 g dm -3 surowego glicerolu produkowa tylko 62,5 g dm -3 kwasu cytrynowego z wydajno ci,56 g g -1, a wi c ni sz ni szczep Wratislavia AWG7 u yty w niniejszej pracy, a po zako czeniu procesu w 6 h hodowli w pod o u wci znajdowa o si 52,5 g dm -3 glicerolu. Natomiast wy sze warto ci wydajno ci kwasu cytrynowego uzyskiwano w procesach z udzia em ró nych szczepów Y. lipolytica, gdzie jako substrat stosowano etanol [Arzumanov i in. 2], n-parafiny [Crolla i Kennedy 21], olej rzepakowy [Kamzolova i in. 25] lub sacharoz [Förster i in. 27]. Wed ug Anastassiadis i Rhem [26] szczep Candida oleophila ATCC 2177 produkowa kwas cytrynowy z glukozy z wydajno ci,41,51 g g KC GLY X ICA KC, GLY (g dm -3 ) X, ICA (g dm -3 ) Czas Time (h) Rys. 1. Produkcja biomasy [X], kwasu cytrynowego (KC), kwasu izocytrynowego (ICA) oraz zu ycie glicerolu [GLY] przez Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. Roztwór glicerolu (35 g dm -3 ) by wprowadzony do bioreaktora periodycznie w 24 i 48 h do ca kowitego st enia 2 g dm -3, co pokazuj strza ki Fig. 1. Biomass (X), citric acid (KC) and isocitric acid (ICA) and uptake of glycerol (GLY) during fed-batch culture of Y. lipolytica Wratislavia AWG7. Glycerol solution (35 g dm -3 ) was periodically fed into the fermentor at 24 and 48 h until the total concentration of 2 g dm -3 was reached after the initiation of the fed-batch mode indicated by an arrow Acta Sci. Pol.

5 Wykorzystanie glicerolu Tabela 1. Parametry kinetyczne wzrostu i biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu odpadowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 Table 1. Kinetic parameters of growth and citric acid fermentation from crude glycerol by strain of Y. lipolytica Wratislavia AWG7 strain Parametr Parameter Glicerol odpadowy Crude glycerol Czas Time (h) 14 Biomasa Biomass (g dm -3 ) 14,5 Kwas cytrynowy Citric acid (g dm -3 ) 133,4 Kwas izocytrynowy Isocitric acid (g dm -3 ) 2,7 Y KC (g g -1 ),67 Q KC (g dm -3 h -1 ),95 q KC (g g -1 h -1 ),66 Podstawow wad dro d owej fermentacji cytrynowej jest nagromadzanie w rodowisku hodowlanym produktu ubocznego, jakim jest kwas izocytrynowy. W zale no- ci od u ytego substratu kwas izocytrynowy stanowi nawet do 5% sumy kwasów cytrynowych. Wed ug wcze niejszych bada stwierdzono, e mutanty oct - cechuj si nisk produkcj kwasu izocytrynowego zarówno w hodowlach z glukoz, jak i z glicerolem [Rymowicz i in. 25, 26, Rywi ska i in. 26]. W przeprowadzonej hodowli fed-batch z udzia em szczepu Wratislavia AWG7 ilo tego produktu ubocznego by a niska i wynosi a na ko cu hodowli 2,7 g dm -3, co wp ywa o na uzyskanie wysokiej czysto ci procesu (ok. 98%), a kwas izocytrynowy stanowi 2% sumy wytworzonych kwasów cytrynowych. W zale no ci od zastosowanego glicerolu (odpadowy lub czysty) i typu hodowli (okresowa wstrz sarkowa lub wg bna okresowa w bioreaktorze) st enie kwasu izocytrynowego w hodowlach mutantów octanowych wynosi o od,3 do 5,8 g dm -3 [Rymowicz i in. 25, 26]. Dla porównania, w hodowli z udzia em szczepu dzikiego typu, Y. lipolytica A-11, w pod o u z glicerolem odpadowym i z glicerolem czystym otrzymano 12,6 i 17,8 g dm -3 kwasu izocytrynowego, co stanowi o odpowiednio 15,8 i 21,1% kwasu izocytrynowego w sumie kwasów (dane niepublikowane). W badaniach Levinson i in. [27] spo ród 27 szczepów wyselekcjonowanych do procesu produkcji kwasu cytrynowego z glicerolu tylko jeden produkowa mniej ni 1% kwasu izocytrynowego. Badano równie obecno innych metabolitów po rednich z cyklu Krebsa, takich jak: kwas jab kowy, fumarowy i -ketoglutarowy w rodowisku hodowlanym. Ich sumaryczna ilo nie przekracza a jednak 6 g dm -3 (rys. 2). Uzyskane w tym zakresie wyniki trudno jest porówna z wynikami innych autorów, poniewa w dost pnej literaturze brak danych na temat ubocznej produkcji po redników cyklu Krebsa czy glikolizy. W omawianym w niniejszej pracy procesie, równolegle z nadprodukcj kwasu cytrynowego, tworzone by y alkohole cukrowe, takie jak erytrytol i mannitol, których st enia na ko cu hodowli wynosi y odpowiednio 9,8 i 2,7 g dm -3 (rys. 3). Zdolno dro d y Y. lipolytica do nadprodukcji polioli z glicerolu by a obserwowana podczas procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w hodowlach innego szczepu, równie mutanta octanowego, Y. lipolytica Wratislavia K1 [Rymowicz i in. 28, Rywi ska i in. 28]. Szczep ten w hodowlach fed-batch, w zale no ci od sposobu dozowania i pocz tkowego st enia glicerolu, produkowa (z 2 g dm -3 glicerolu) wy sze ilo ci erytrytolu, w zakresie od 41 do 81 g dm -3 [Rymowicz i in. 28]. Natomiast w procesach okresowych, Biotechnologia 7(4) 28

6 18 A. Rywi ska w których pocz tkowe st enie czystego glicerolu by o dwukrotnie ni sze i wynosi o 1 g dm -3, st enie erytrytolu i mannitolu na ko cu hodowli wynosi o odpowiednio 19,3 i 1,2 g dm -3 [Rywi ska i in. 28]. Na uwag zas uguje fakt, e podczas gdy szczep Wratislavia K1 nagromadza erytrytol przez ca y czas trwania procesu, szczep Wratislavia AWG7 po obni eniu st enia glicerolu utylizuje wolno oba poliole, co mo e mie wp yw na zwi kszenie wydajno ci kwasu cytrynowego (rys. 3).,54 FUM KET MAL 6,45 5 FUM, KET, (g dm -3 ),36,27,18, MAL (g dm -3 ) Czas Time (h) Rys. 2. Produkcja kwasu fumarowego (FUM), -ketoglutarowego (KET) i jab kowego (MAL) podczas procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu odpadowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch Fig. 2. Production of fumaric acid (FUM), -ketoglutaric acid (KET) and malic acid (MAL) during fed-batch production of citric acid from crude glycerol by Y. lipolytica Wratislavia AWG7 strain ER MAN 12 1 MAN, ER (g dm -3 ) Czas Time (h) Rys. 3. Produkcja erytrytolu (ER) i mannitolu (MAN) przez Y. lipolytica Wratislavia AWG7 z glicerolu odpadowego w hodowli fed-batch Fig. 3. Production of erythritol (ER) and mannitol (MAN) by Y. lipolytica Wratislavia AWG7 on glycerol medium in fed-batch cultivation system Acta Sci. Pol.

7 Wykorzystanie glicerolu Dynamika procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w czasie hodowli by a zró nicowana. W fazie spowolnionego wzrostu, pomi dzy 2 46 h hodowli, obj to ciowa szybko produkcji kwasu cytrynowego (Q KC ) kszta towa a si w zakresie od 1,7 do 2,6 g dm -3 h -1 (rys. 4). W kolejnych godzinach hodowli, kiedy komórki by y w fazie stacjonarnej, szybko produkcji kwasu cytrynowego obni a a si do ok.,52 g dm -3 h -1 w 95 h hodowli i utrzymywa a si na takim poziomie do ko ca procesu. Szybko w a- ciwa produkcji kwasu cytrynowego wynosi a w tym czasie oko o,38 g g -1 h -1 (rys. 4). Podobne obni anie si dynamiki produkcji kwasu cytrynowego by o obserwowane podczas biosyntezy kwasu cytrynowego z hydrolu glukozowego przez dziki szczep Y. lipolytica A-11 [Wojtatowicz i Rymowicz 1991] oraz z glukozy przez szczep Candida olephila ATCC 2177 [Anastassiadis i in. 22]. Warto jednak podkre li, e rednia szybko obj to ciowa produkcji kwasu cytrynowego, liczona dla ca ego procesu, by a wysoka i wynosi a Q KC =,95 g dm -3 h -1 (tab. 1), nieznacznie tylko ni sza ni w hodowli z czystym glicerolem, 1,16 g dm -3 h -1 [Rywi ska i in. 29]. 4 Q q,2 Q KC (g dm -3 h -1 ) 3 2 1,15,1,5 q KC (g g -1 h -1 ) Czas Time (h) Rys. 4. Obj to ciowa szybko produkcji kwasu cytrynowego (Q KC ) i szybko w a ciwa produkcji kwasu cytrynowego (q KC ) podczas procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu odpadowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch Fig. 4. Volumetric citric acid production rate (Q KC ) and specific citric acid production rate (q KC ) during citric acid biosynthesis from crude glycerol by Y. lipolytica Wratislavia AWG7 strain in fed-batch culture Podsumowuj c wyniki bada, mo na stwierdzi, e glicerol odpadowy pochodz cy z produkcji estrów metylowych o niskiej zawarto ci glicerolu (35 g dm -3 ) jest bardzo dobrym ród em w gla do biosyntezy kwasu cytrynowego dla szczepu Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w systemie fed-batch. Zanieczyszczenia obecne w surowcu pozostawa y bez wp ywu na dynamik i wydajno procesu biosyntezy kwasu cytrynowego, które by y wysokie i wynosi y odpowiednio 133,4 g dm -3 i,67 g g -1. Ponadto proces fermentacji charakteryzowa si wysok czysto ci z uwagi na nisk zawarto kwasu izocytrynowego, metabolitów po rednich cyklu Krebsa oraz polioli. Biotechnologia 7(4) 28

8 2 A. Rywi ska PI MIENNICTWO Altiparmak D., Keskin A., Koca A., Gürü M., 27. Alternative fuel properties of tall oil fatty acid methyl esters-diesel fuel blends. Bioresource Technol. 98, Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C., 22. Citric acid production by Candida strains under intracellular nitrogen limitation. Appl. Micrrobiol. Biotechnol. 6, Anastassiadis S., Rhem H.J., 26. Citric acid production from glucose by yeast Candida oleophila ATCC 2177 under batch, continuous and repeated batch cultivation. Electron. J. Biotechnol. 9, Arzumanov T.E., Shishkanova N.V., Finogenova T.V., 2. Biosynthesis of citric acid by Yarrowia lipolytica repeat-batch on culture on ethanol. Appl. Micrrobiol. Biotechnol. 53(5), Bories A.C., Claret C., Soucaille P., Kinetic study and optimisation of the production of dihydroxyacetone from glycerol using Gluconobacter oxydans. Process Biochemistry 26(4), Chen X., Xiu Z., Wang J., Zhang D., Xu P., 23. Stoichiometric analysis and experimental investigation of glycerol bioconversion to 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae under microaerobic conditions. Enzyme Microb. Technol. 33(4), Crolla A., Kennedy K.J., 21. Optimization of citric acid production from Candida lipolytica Y-195 using n-paraffin. J. Biotechnol. 89, Dunahay T.G., Jarvis E.E., Dais S.S., Roessler P.G., Manipulation of microalgal lipid production using genetic engineering. Appl. Biochem. Biotechnol , Förster A., Aurich A., Mauersberger S., Barth G., 27. Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, Fukuda H., Kondo A., Noda H., 21. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. Journal of Bioscience and Bioengineering. 92(5), Goldberg D., Ellis G., Isocitrate dehydrogenase, [in:] Bergmeyer HU (ed). Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie, Weinheim, 3, Guschina I.A., Harwood J.L., 26. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Prog. Lipid Res. 45, Hirschmann S., Baganz K., Koschik I., Vorlop K.D., 25. Development of an integrated bioconversion process for the production of 1,3-propanediol from raw glycerol waters. Landbauforschung Völkenrode 55, Ito T., Nakashimada Y., Senba K., Matsui T., Nishio N., 25. Hydrogen and ethanol production from glycerol-containing wastes discharged after biodiesel manufacturing process. Journal of Bioscience and Bioengineering 1(3), Juszczyk P., Musia I., Rymowicz W., 25. Dobór szczepów dro d y do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Scient. Polon. Biotechnol. 4(1 2), Kamzolova S.V., Morgunov I.G., Aurich A., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V., Stottmeister U., 25. Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat. Food Technol. Biotechnol. 43, Kim Y.H., Kang S.W., Lee J.H., Chang H.I., Yun C.W., Paik H.D., Kang C.W., Kim S.W., 27. High cell density fermentation of Saccharomyces cerevisiae JUL3 in fed-batch culture for the production of ß-glucan. J. Ind. Eng. Chem. 13(1), Lee P.C., Lee W.G., Lee S.Y., Chang H.N., 21. Succinic acid production with reduced byproduct formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon. Biotechnology and Bioengineering 72(1), Acta Sci. Pol.

9 Wykorzystanie glicerolu Levinson W.E., Kurtzman C.P., Kuo T.M., 27. Characterization of Yarrowia lipolytica and related species for citric acid production from glycerol. Enzyme Microb. Technol. 41, Levišauskas D., Galvanauskas V., Simutis R., Žilinskas A., Žilinskas J., 26. Optimization of biomass production in fed-batch culture by feed and dilution controlactions. Information Technol. Control 35(4), Li Y.H., Liu B., Zhao Z.B., Bai F.W., 26. Optimization of Culture Conditions for Lipid Production by Rhodosporidium toruloides. Chin. J. Biotechnol. 22(4), Limtong S., Kishimoto M., Seki T., Yoshida T., Taguchi H., Simulation and optimization of fed-batch culture for ethanol production from molasses. Bioprocess Eng. 2, Marchetti J.M., Miguel V.U., Errazu A.F., 27. Possible methods for biodiesel production. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 11, Papanikolaou S., Aggelis G., 23. Modelling aspects of the biotechnological valorization of crude glycerol: production of citric acid by Yarrowia lipolytica and 1,3-propanediol by Clostridium butyricum. J. Chem. Technol. Biotech. 78(5), Papanikolaou S., Fakas S., Fick M., Chevalot I., Galiotou-Panayotou M., 28. Biotechnological valorisation of raw glycerol discharged after bio-diesel (fatty acid methyl esters) manufacturing process: Production of 1,3-propanediol, citric acid and single cell oil. Biomass Bioen. 32, Papanikolaou S., Muniglia L., Chevalot I., Aggelis A., Marc I., 22. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol. J. Appl. Microbiol. 92, Ratledge C., Wynn J.P., 22. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Adv. Appl. Microbiol. 51, Ratledge C., 24. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production. Biochimie 86 (11), Rymowicz W., Juszczyk P., Rywi ska A., arowska B., Musia I., 25. Produkcja kwasu cytrynowego z odpadowego glicerolu przez dro d e Yarrowia lipolytica. Biotechnologia monografie 2 (2), Rymowicz W., Rywi ska A., G adkowski W., 28. Simultaneous production of citric acid and erythritol from crude glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia K1. Chem. Pap. 62(3), 1 8. Rymowicz W., Rywi ska A., arowska B., Juszczyk P., 26. Citric acid production from crude glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica. Chem. Pap. 6(5), Rywi ska A., Skrzypi ski A., Juszczyk P., Boruczkowski T., Rymowicz W., 28. Charakterystyka procesu biosyntezy kwasu cytrynowego i polioli z glicerolu i glukozy przez dro d e Yarrowia lipolytica. Acta Scient. Polon. Biotechnol. 7(1), Rywi ska A., Rymowicz W., arowska B., Wojtatowicz M., 29. Biosynthesis of citric acid from glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica in fed-batch fermentation. Food Technol. Biotechnol (w druku). Rywi ska A., Wojtatowicz M., Wielebi ska A., 23. Otrzymywanie mutantów fil - dro d y Yarrowia lipolytica do produkcji kwasu cytrynowego. Acta Scient. Polon. Biotechnol. 2(1-2), Wojtatowicz M., Rymowicz W., Effect of inoculum on kinetics and yield of citric acids production on glucose by Yarrowia lipolytica A-11. Acta Aliment. Pol., XVII /XLI/ (2), Biotechnologia 7(4) 28

10 22 A. Rywi ska THE USE OF CRUDE GLYCEROL FOR CITRIC ACID BIOSYNTHESIS BY YARROWIA LIPOLYTICA WRATISLAVIA AWG7 Abstract. Crude glycerol from biodiesel industry, containing 35 g dm -3 of glycerol, was used as a substrate for citric acid production by acetate negative mutant of Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 in fed-batch experiment. This strain produced 133,4 g dm -3 of citric acid and 2,7 g dm -3 of isocitric acid, unwanted product in this process, in 14 h of cultivation. As a results the volumetric citric acid production rate and the citric acid yield reached,95 g dm -3 h -1 and,67 g g -1, respectively. The total amount of other organic acids such as malic, fumaric and -ketoglutaric acid produced by the Wratislavia AWG7 strain no exceed 6 g dm -3.Polioles such as erythritol and as well as mannitol were produced in this process also. Concentration of these by-products at the and of process were 9,8 i 2,7 g dm -3, respectively. Key words: citric acid, raw glycerol, fed-batch system, Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 Zaakceptowano do druku Accepted for print: Do cytowania For citation: Rywi ska A., 28. Wykorzystanie glicerolu odpadowego do biosyntezy kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(4), Acta Sci. Pol.