DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH W KULTURACH in vitro TULIPANA

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 163-171 DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH W KULTURACH in vitro TULIPANA Małgorzata Maślanka, Anna Bach Katedra Roślin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp Tulipan, ze względu na długotrwałą i mało wydajną drogę rozmnaŝania, jest obiektem wielu badań, mających na celu zwiększenie plonu oraz przyspieszenie jego uprawy. Obiecującą technologią produkcji tulipana jest somatyczna embriogeneza, ze względu na bardzo szybki i wydajny sposób rozmnaŝania [DE VROOMEN 1997]. Somatyczne zarodki, powstające z komórek innych niŝ zygota, czyli na drodze rozmnaŝania bezpłciowego, poprzez manipulowanie składem poŝywki, mogą tworzyć się w duŝej ilości, w stosunkowo krótkim czasie [KĘPCZYŃSKA 2006]. Liczba uzyskanych zarodków, obok ich jakości, decyduje o przydatności somatycznej embriogenezy do masowej produkcji roślin. W przypadku tulipana nie opracowano, jak dotąd, metody szybkiego i synchronicznego otrzymywania licznych somatycznych zarodków, pomimo poznania juŝ mechanizmów kontrolujących te procesy. Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu czasu trwania kultury na efektywność formowania zarodków somatycznych (terminu pojawienia się pierwszych zarodków globularnych i torpedo oraz ich liczby) u tulipana. Zbadano takŝe wpływ róŝnych stęŝeń auksyny na dynamikę formowania zarodków. Materiał i metody Badania przeprowadzono na tulipanach odmiany Apeldoorn (naleŝącej do grupy mieszańców Darwina) i Rosy Wing (z grupy pojedynczych późnych). Jako eksplantaty inicjalne zastosowano zaląŝnie, wyizolowane z chłodzonych przez 12 tygodni, w 5 C, cebul o obwodzie 11-12 cm. Zdezynfekowane eksplantaty cięto na 1-2- mm fragmenty (plastry) i wykładano do szalek Petriego na poŝywki zawierające sole mineralne według MURASHIGE i SKOOG [1962], 25 lub 50 µm Picloramu; 0,25-10 µm BA, 3% sacharozy, zestalone 0,7% agarem. Kultury prowadzono w ciemności, w 20 C. Tworzący się Ŝółty, embriogeniczny kalus odejmowano od tkanki matecznej, namnaŝano na jednej z poŝywek inicjalnych, a następnie poddano działaniu 10 lub 5 µm Picloramu oraz 1 µm BA, w celu formowania zarodków somatycznych, zgodnie z procedurą według BACH i PTAK [2001]. W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury określono procent eksplantatów róŝnicujących zarodki globularne oraz liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w

164 M. Maślanka, A. Bach stadium torpedy (długości 5-10 mm), w zaleŝności od genotypu, stęŝenia auksyny i czasu trwania kultury. Analizę histologiczną formujących się struktur sporządzono w oparciu o preparaty mikroskopowe, wykonane metodą parafinową według FILUTOWICZA i KUśDOWICZA [1951]. Doświadczenie wykonano w 5 powtórzeniach po 5 eksplantatów. Wyniki opracowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji. Porównanie średnich i określenie grup jednorodnych wykonano przy uŝyciu testu Duncana, z uwzględnieniem poziomu istotności α = 0,05. Wyniki i dyskusja RóŜnicowanie zarodków w fazie rozwoju globularnego Do rozwoju somatycznych zarodków u tulipana niezbędne jest obniŝenie stęŝenia auksyny w poŝywce lub jej usunięcie [GUDE, DIJKEMA 1997]. RóŜnicowanie zarodków stymuluje równieŝ obecność cytokinin, najsilniej podczas powstawania zarodków w stadium globularnym, któremu towarzyszą intensywne podziały komórkowe [SZWEYKOWSKA 1994]. Kultury zwykle prowadzi się w ciemności, stymulującej m.in. rozwój zarodków globularnych [BACH, WARCHOŁ 2000] oraz obniŝającej stopień deformacji zarodków w stadium torpedy [MAŚLANKA, BACH 2007]. średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŝnią się istotnie na poziomie istotności α=0,05; means marked with the same letter du not differ significantly at the significance level α=0.05 Rys. 1. Wpływ czasu trwania kultury i stęŝenia auksyny na róŝnicowanie zarodków globularnych u odmiany Apeldoorn Fig. 1. Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo differentiation of cv. Apeldoorn W przeprowadzonym doświadczeniu, formowanie zarodków globularnych zachodziło na drodze embriogenezy pośredniej, przez kalus. RóŜnicowanie to miało miejsce od pierwszych tygodni doświadczenia, ale nasiliło się po 2-3 miesiącach prowadzenia kultury. W przypadku odmiany Apeldoorn i poŝywki z 5 µm auksyny, najwyŝszy procent eksplantatów formujących zarodki globularne, wynoszący 76%, odnotowano po 8 tygodniach trwania kultury. Stosując 10 µm Picloramu, większe róŝnicowanie zarodków, równe 60%, otrzymano po 12 tygodniach od załoŝenia

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH... 165 doświadczenia, w stosunku do pozostałego okresu kultury. Wraz z upływem czasu trwania kultury obniŝała się wydajność kalusa embriogenicznego w tworzeniu zarodków, a po 20 tygodniach pod wpływem 5 µm Picloramu nie obserwowano róŝnicowania nowych zarodków (rys. 1). U tulipana Rosy Wing zaobserwowano intensywniejsze róŝnicowanie zarodków globularnych po 2-3 miesiącach, w stosunku do całego okresu kultywacji, niezaleŝnie od stęŝenia auksyny (rys. 2). Rys. 2. Wpływ czasu trwania kultury i stęŝenia auksyny na róŝnicowanie zarodków globularnych u odmiany Rosy Wing Fig. 2. Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo differentiation of cv. Rosy Wing Tabela 1; Table 1 Procent eksplantatów róŝnicujących zarodki globularne, w zaleŝności od genotypu i stęŝenia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury Percentage of explants forming globular embryos, depending on genotype and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation PoŜywka; Medium Apeldoorn Odmiana; Cultivar Rosy Wing 10 µm Picloram, 1 µm BA 39,2 b 20,8 a 5 µm Picloram, 1 µm BA 33,6 b 23,2 a Średnia; Average 36,4 b 22,0 a Oceniając wpływ stęŝenia auksyny na róŝnicowanie zarodków, u obu odmian tulipana stwierdzono, Ŝe badana cecha nie była zaleŝna od róŝnych stęŝeń Picloramu (tab. 1). RóŜnicowanie zarodków globularnych uzaleŝnione było natomiast od genotypu. Odmiana Apeldoorn efektywniej formowała początkowe stadia zarodków (36,4% eksplantatów) niŝ Rosy Wing (22% eksplantatów; tab. 1). Kalus embriogeniczny obu badanych odmian tulipana, utrzymywany na po- Ŝywkach z 10 lub 5 µm Picloramu oraz 1 µm BA, stopniowo tracił embriogeniczny charakter i róŝnicował coraz mniej zarodków. W kulturach kalusa przetrzymywanych

166 M. Maślanka, A. Bach przez dłuŝszy czas na poŝywce z auksyną lub cytokininą następują zwykle zmiany epigenetyczne, polegające na względnie trwałym uniezaleŝnieniu się od egzogennych regulatorów. Procesowi temu sprzyja prowadzenie kultur w ciemności [ORLIKOWSKA 1997]. Być moŝe kalus tulipana po kilku miesiącach kultury in vitro traci stopniowo wraŝliwość na obecne w poŝywce auksyny i cytokininy, albo teŝ stosowane regulatory w niŝszych stęŝeniach działają słabiej. O działaniu regulatorów roślinnych decyduje nie tylko ich rodzaj i koncentracja, ale takŝe wraŝliwość eksplantatu na te regulatory w momencie aplikacji. Działanie substancji wzrostowych zaleŝy takŝe od wieku kultur [ORLIKOWSKA 1997]. Niestety zdarza się, Ŝe kalus embriogeniczny ma powolny wzrost i szybko traci kompetencję do embriogeniczności [RAGHAVAN 1997]. RóŜnicowanie zarodków w stadium torpedy Somatyczne zarodki tulipana w stadium torpedy, długości 5-10 mm, obserwowano w 8 i 12 tygodniu prowadzenia kultury, odpowiednio u odmiany Apeldoorn i Rosy Wing. U obu badanych odmian więcej zarodków uformowało się po 12 tygodniach kultury, w porównaniu z pozostałym okresem trwania doświadczenia (rys. 3, 4). BOUMAN i in. [1999] otrzymywali w pełni wykształcone zarodki tulipana po 10 tygodniach na poŝywkach niezawierających auksyn. BACH i PTAK [2001] natomiast obserwowały formowanie się pierwszych zarodków w 12. tygodniu od chwili załoŝenia kultur. Rys. 3. Wpływ czasu trwania kultury i stęŝenia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy u odmiany Apeldoorn Fig. 3. Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped embryos of cv. Apeldoorn StęŜenie auksyny nie miało wpływu na liczbę otrzymanych zarodków w stadium torpedy. U obu badanych odmian, więcej (o ponad 30%) uformowanych zarodków na poŝywce z 5 µm Picloramu nie stanowiło istotnej róŝnicy w stosunku do poŝywki ze stęŝeniem Picloramu równym 10 µm (tab. 2). PTAK i BACH [2007] największą liczbę somatycznych zarodków tulipana uzyskały na poŝywkach z przewaŝającym udziałem Picloramu nad BA.

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH... 167 Rys. 4. Wpływ czasu trwania kultury i stęŝenia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy u odmiany Rosy Wing Fig. 4. Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped embryos of cv. Rosy Wing Tabela 2; Table 2 Liczba zarodków w stadium torpedy, z 1 g kalusa, w zaleŝności od genotypu i stęŝenia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury Number of torpedo-shaped embryos, from 1 g of callus, depending on genotype and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation PoŜywka; Medium Apeldoorn Odmiana; Cultivar Rosy Wing 10 µm Picloram, 1 µm BA 5,32 ab 1,6 a 5 µm Picloram, 1 µm BA 7,96 b 2,6 a Średnia; Average 6,64 b 2,1 a Podobnie jak w przypadku róŝnicowania zarodków globularnych, liczba uzyskanych zarodków w stadium torpedy takŝe zaleŝała od genotypu rośliny. Średnio 6,64 zarodków otrzymano z 1 g kalusa tulipana Apeldoorn w ciągu 20 tygodni, niezaleŝnie od poŝywki. Odmiana Rosy Wing uformowała w tych samych warunkach trzykrotnie mniej zarodków (tab. 2). Porównana przez autorów [BACH, PTAK 2002] odmiana Apeldoorn równieŝ charakteryzowała się większą efektywnością procesu somatycznej embriogenezy w stosunku do odmiany Red Matador (mieszaniec Darwina). Z kolei w badaniach PODWYSZYŃSKIEJ i in. [1997] odmiana Apeldoorn okazała się mieć najsłabsze zdolności do róŝnicowania, w porównaniu z innymi odmianami tulipana. Analiza histologicza Analiza histologiczna otrzymanych regularnych, dwubiegunowych struktur, z uformowanym liścieniem, pasmem wiązek przewodzących i merystemem pędowym potwierdziła, Ŝe w przeprowadzonych badaniach istotnie formowały się zarodki

168 M. Maślanka, A. Bach somatyczne, które swoją budową odpowiadały zarodkom zygotycznym (fot. 1). Niestety, zregenerowane zarodki tulipana nie posiadały korzenia. WzdłuŜ somatycznych zarodków tulipana PODWYSZYŃSKA i MARASEK [2003] równieŝ zaobserwowały podłuŝne pasma wiązek naczyniowych, nie odnotowały natomiast formowania się korzonka zarodkowego. Brak korzeni u somatycznych zarodków tulipana moŝna tłumaczyć wysoką temperaturą (20-23 C) kultur in vitro i obecnością cytokinin, które opóźniają ich rozwój [PODWYSZYŃSKA, MARASEK 2003]. Fot. 1. Przekrój podłuŝny przez somatyczny zarodek tulipana (pow. 30, li - liścień, mp - merystem pędowy) Photo 1. Longitudinal section of the tulip somatic embryo (magnification 30, li - cotyledon, mp - shoot meristem) Wnioski 1. Długość okresu prowadzenia kultury odgrywała istotną rolę w somatycznej embriogenezie tulipanów. Wzrost róŝnicowania zarodków globularnych obserwowano do 8-12 tygodnia kultury in vitro, a formowanie zarodków w stadium torpedy nasiliło się po 3 miesiącach kultury. 2. StęŜenie auksyny w zakresie 5 i 10 µm nie miało istotnego wpływu na róŝnicowanie zarodków globularnych i formowanie torped. 3. Wydajność somatycznej embriogenezy zaleŝała od genotypu. Zarodki globularne róŝnicowało średnio 36% eksplantatów Apeldoorn i 22% Rosy Wing. Tulipan Apeldoorn uformował większą liczbę zarodków somatycznych (średnio 6,6) niŝ

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH... 169 Rosy Wing (średnio 2,1) z 1 g kalusa. 4. Analiza histologiczna potwierdziła formowanie zarodków somatycznych w stadium torpedy. Literatura BACH A., PTAK A. 2001. Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of Tulipa gesneriana L. in in vitro cultures. Acta Horticulturae 560: 391-394. BACH A., PTAK A. 2002. Nowa metoda mikrorozmnaŝania tulipana (Tulipa gesneriana L.) z tkanek zaląŝni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: 13-19. BACH A., WARCHOŁ M. 2000. Effect of light quality on proliferation of embryogenic callus of Hyacinthus orientalis cv. Delft s Blue. Acta Biologica Cracoviensia 42: 17. BOUMAN H., LANGENS M., SCHOO W., DIJKEMA M. 1999. Somatic embryogenesis of tulip. Acta Biologica Cracoviensa 41: 34. DE VROOMEN C.O.N. 1997. Farm management aspects of somatic embryogenesis for tulip bulb production. Acta Horticulturae 430: 383-388. FILUTOWICZ A., KUśDOWICZ A. 1951. Mikrotechnika roślinna. PWRiL, Warszawa. GUDE H., DIJKEMA M.H.G.E. 1997. Somatic embryogenesis in tulip. Acta Horticulturae 430: 275-280. KĘPCZYŃSKA E. 2006. Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Biotechnologia 4(75): 78-94. MAŚLANKA M., BACH A. 2007. Wpływ kwasu abscysynowego oraz światła na wzrost i rozwój zarodków somatycznych tulipana (Tulipa gesneriana L.). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 523: 155-161. MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Plant Physiology 15: 473-497. ORLIKOWSKA T. 1997. Regulatory roślinne w kulturach in vitro, w: Regulatory wzrostu i rozwoju roślin. Zastosowanie w ogrodnictwie, rolnictwie, leśnictwie i w kulturach tkanek. Jankiewicz S.L. Praca zbiorowa, PWN, Warszawa: 219-247. PODWYSZYŃSKA M., MARASEK A. 2003. Effects of thidiazuron and paclobutrazol on regeneration potential of tulip flower stalk explants in vitro and subsequent shoot multiplication. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 72(3): 181-190. PODWYSZYŃSKA M., MARASEK A., GABRYSZEWSKA E. 1997. Indukcja tworzenia pędów przybyszowych i zarodków somatycznych w kulturach in vitro tulipana. Zeszyty Naukowe AR w Krakowie 318: 195-198. PTAK A., BACH A. 2007. Somatic embryogenesis in tulip (Tulipa gesneriana L.) flower stem cultures. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 43: 35-39. RAGHAVAN V. 1997. Molecular embryology of flowering plants. Somatic embryogenesis. Cambridge University Press: 467-499. SZWEYKOWSKA A. 1994. Procesy róŝnicowania w kulturach tkanek i komórek roślinnych. Prace Ogrodu Botanicznego Polskiej Akademii Nauk 5/6: 9-18.

170 M. Maślanka, A. Bach Słowa kluczowe: tulipan, somatyczna embriogeneza, zarodki globularne, torpedo Streszczenie Kalus embriogeniczny tulipanów odmian Apeldoorn i Rosy Wing, uzyskany z eksplantatów zaląŝni, wykładano na poŝywki z obniŝoną zawartością substancji wzrostowych, w stosunku do poŝywki namnaŝającej, w celu formowania zarodków somatycznych. W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury tkanki embriogenicznej, na poŝywkach z 10 i 5 µm Picloramu, określano procent eksplantatów róŝnicujących zarodki w fazie rozwoju globularnego w zaleŝności od genotypu, stęŝenia auksyny i czasu trwania kultury. Określano równieŝ liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w stadium torpedy. Największy procent eksplantatów róŝnicujących zarodki globularne odnotowano po 8 i 12 tygodniach prowadzenia kultury, wynoszący odpowiednio 62% i 50% dla odmiany Apeldoorn oraz 32% i 30% dla odmiany Rosy Wing. RównieŜ po 3 miesiącach kultury uzyskano najwięcej zarodków w stadium rozwoju torpedo (blisko 14 szt. u Apeldoorn i 4 szt. u Rosy Wing ), po tym czasie obniŝała się liczba pozyskiwanych zarodków. Formowanie zarodków somatycznych uzaleŝnione było od genotypu badanej rośliny. Średnio 6,64 zarodków otrzymano z kalusa odmiany Apeldoorn w ciągu 20 tygodni, niezaleŝnie od poŝywki, co stanowiło trzykrotną, istotną przewagę nad odmianą Rosy Wing. DYNAMICS OF SOMATIC EMBRYO FORMATION IN TULIP in vitro CULTURES Małgorzata Maślanka, Anna Bach Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków Key words: tulip, somatic embryogenesis, globular and torpedo-shaped embryos Summary Embryogenic callus of tulips cv. Apeldoorn and Rosy Wing, obtained from ovary explants, was put on medium with a lower level of growth regulators, as compared to the proliferation medium, in order to produce somatic embryos. During 20 weeks of the embryogenic tissue cultivation, treated with 10 and 5 µm Picloram, the effect of genotype, auxin concentration and cultivation time on the globular embryo differentiation were investigated. The number of torpedo-shaped embryos obtained from 1g of callus were also examined. The highest percentage of explants forming globular embryos were observed after 8 and 12 weeks of cultivation. For Apeldoorn it was 62 and 50%, and for Rosy Wing 32 and 30%, respectively. After three months of the embryogenic callus cultivation, the highest number of torpedo-shaped embryos (about 14 for Apeldoorn and 4 for Rosy Wing ) were obtained. However, during the prolongation of culture the embryo number decreased. Somatic embryo formation closely depended on the genotype. During 20 weeks of cultivation, Apeldoorn tulip produced, on the average, 6,64 embryos, independently of medium composition. It trebled the results of Rosy Wing.

DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH... 171 Dr inŝ. Małgorzata Maślanka Katedra Roślin Ozdobnych Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: maslankam@ogr.ar.krakow.pl