Akademia Humanistyczno-Ekonomiczna w Łodzi 90-222 Łódź, ul. I~ewolucji 1905 r. nr 64 tel.: (0-42) 63 15 000, 63 15 800; fax: (0-42) 63 15 834; 63 15 888 e-mail : uczelnia@ahe.lodz.pl Internet: www.ahe.lodz.pl NIP 7251014115 Łódź, dnia 13 lutego 2015 r. Szanowny Pan prof. dr hab. n. med. Maciej Misiołek Dziekan Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Plac Traugutta 2 41-800 Zabrze Wielce Szanowny Panie Dziekanie, Uprzejmie dziękuję za powierzenie mi recenzji pracy mgr Magdaleny Kowalskiej - doktorantki Stacjonarnego Studium Doktoranckiego na Wydziale Lekarskim z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu SUM w Katowicach na temat: Przeciwzapalne właściwości f10retyny i jej pochodnych w badaniach in-vitro. Moja recenzja jest pozytywna. z wyrazami poważania ~~ ) prof. Andrzej Denys V
Łódź, dnia 13.02.2015 r. RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr Magdaleny Kowalskiej pod tytułem "Przeciwzapalne właściwości floretyny i jej pochodnych w badaniach in vitro" Układ immunologiczny spełnia ważne funkcje w ustroju, a mianowicie: zwalczanie zakażeń wirusowych, bakteryjnych, grzybiczych, pierwotniakowych, dzięki możliwościom odróżnienia "swego" od obcego; odrzucanie obcych przeszczepów tkankowych (zabezpieczenie integracji ustroju), przeciwstawianie się komórkom nowotworowym i pasożytom. Wyróżniamy odpowiedź swoistą i nieswoistą. Odpowiedź nieswoista obejmuje szereg mechanizmów obronnych takich jak: bariery naturalne, fagocyty, reakcja zapalna, komórki NK. Odpowiedź nieswoista realizowana jest przez granulocyty wielojądrzaste i makrofagi w reakcjach fagocytozy i syntezy mediatorów zapalnych. Wyróżniamy następujące elementy odpowiedzi swoistej takie jak odpowiedź humoralna zależna od przeciwciał, odpowiedź komórkowa - działanie bezpośrednie na komórki docelowe, działanie pośrednie poprzez syntezę cytokin. Celem jest eliminacja czynnika inwazyjnego. Głównym problemem ocenianej rozprawy jest zagadnienie zapalenia jako procesu wstępnej obrony organizmu. Temat pracy uważam za w pełni uzasadniony. Obszerny wstęp dotyczy omówienia udziału w tym procesie mechanizmów służących przywróceniu homeostazy organizmu. Główne znaczenie mają właściwości czynnika uszkadzającego, z drugiej strony uwalniane mediatorów zapalnych i przeciwzapalnych. Dynamika procesu zapalnego obejmuje zjawiska rozszerzenia naczyń, zwiększenia przepuszczalności i pojawienia się wysięku, pojawiają się cząsteczki adhezyjne, biorące udział w przyciąganiu leukocytów - następuje sekrecja cytokin prozapalnych. Zapalenie ostre może przejść w zapalenie przewlekłe z komplikacjami, między innymi rozwojem procesu nowotworowego. Kluczową rolę w zwalczaniu patogenów i utrzymaniu homeostazy w tkankach odgrywają makrofagi, jest to heterogenna populacja komórek, posiadająca zdolność do polaryzacji w kierunku aktywności prozapalnej i przeciwzapalnej. Aktywność makrofagów rozpoczyna reakcje obronne w procesie zapalnym.
Lipopolisacharyd jest bodźcem stymulującym makrofagi do sekrecji czynników prozapalnych. TNF -u wykazuje synergistyczny efekt z IL - 1, następuje aktywacja szlaku sygnalizacji zapalnej czynnika jądrowego Kappa B. Aktywność makrofagów w wytwarzaniu cytokin prozapalnych może być hamowana przez czynniki przeciwzapalne - 11-4, IL-lO, 11-13, TGF - p, szczególnie silnie działa IL-lO. Jednym z istotnych mechanizmów stanu zapalnego wytwarzanego przez makrofagi jest tlenek azotu - moduluje on uwalnianie cytokin - IL-6, TNF - p, cyklooksygenazy. Kolejnym mechanizmem umożliwiającym eliminację patogenu przez makrofagi jest fagocytoza, dochodzi do wewnątrzkomórkowego zabijania bakterii poprzez mechanizmy zależne i niezależne od tlenu. Następuje wzrost zapotrzebowania na tlen i uwalnianie dużych ilości aktywnych fonn tlenu (wybuch tlenowy). Zjawisko to można badać między innymi w reakcji chemiluminescencji. Czynnik transkrypcyjny NF-kB ulega aktywacji po pobudzeniu makrofagów przez bodziec zapalny, czynnik ten kontroluje ekspresję licznych genów, związanych z przebiegiem reakcji zapalnej. Kolejny fragment wstępu omawia lipopolisacharydy, które wchodzą w skład ściany komórkowej bakterii, decydują o procesach życiowych bakterii. Stymulacja makrofagów przez LPS przebiega za pośrednictwem czynników transkrypcyjnych NF -kb i AP-l, udział bierze także rodzina receptorów dla IL-l. Aktywne czynniki transkrypcyjne w jądrze makrofaga indukują ekspresję wielu genów dla mediatorów reakcji zapalnej. Interferony zaliczamy do rodziny cytokin prozapalnych produkowanych w odpowiedzi na zakażenie. Interferon czyli immuno-interferon wzmacnia ścieżkę sygnałową LPS. Ostatnia część wstępu dotyczy omówienia llawonoidów, są to wtórne metabolity roślin występujące w liściach, kwiatach, owocach i inasionach, pełnią funkcję obronne przed atakiem patogenów, ponadto pełnią funkcję honnonów, regulatorów wzrostu, regulatorów reakcji enzymatycznych. Flawonoidy występują w diecie człowieka, źródłem są owoce, warzywa, rośliny strączkowe, kawa, herbata, wino i piwo, przyprawy. W obrębie llawonoidów można zaobserwować dużą różnorodność w budowie cząsteczki. Chalkony stanowią produkt pośredni w reakcji biosyntezy llawonidów, są to związki nietrwałe znajdujące się w równowadze z odpowiednimi llawonoidami. Chalkon jest prekursorem wszystkich związków z grupy llawonidów. Chalkony posiadają właściwości przeciwbakteryjne, działają na bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, są aktywne wobec niektórych wirusów, działają przeciwgrzybiczo. Ich aktywność przeciwzapalna wiąże się z działaniem na komórki
układu immunologicznego, działają cytotoksycznie w stosunku do komórek linii nowotworowych, mogą zmiatać rodniki tlenowe, obniżają ciśnie krwi, mają działanie przeciwwrzodowe- korzystnie działają na błonę śluzową żołądka i dwunastnicy. Dihydroalkony stanowią zredukowaną postać chalkonów do naturalnie występujących zaliczamy floretynę i florydzynę oraz asebogenin i asebotin. Floretyna i florydzyna były używane w medycynie chińskiej, asebogenin w medycynie Afryki środkowej. Oceniają ogólnie wstęp - stanowi on wystarczające uzasadnienie podjęcia się przez Doktorantkę badań których celem było: ocenić przeciwzapalne właściwości wybranych dihydroalkonów: floretyny i jej dwóch pochodnych - asebogeninu i florydzyny. Reasumując: stwierdzam, iż jest to bardzo staranne opracowanie uwzględniające współczesny stan wiedzy. Modelem były komórki makrofagowe linii 1774A1 stymulowane kombinacją LPS i IFN-y. Oceniono działanie cytotoksyczne badanych substancji, produkcję tlenku azotu, generację chemiluminescencji, produkcję cytokin, aktywnośćczynnika transkrypcyjnego NF-kB. Zastosowane materiały i metody opisano dokładnie, podając na wstępie charakterystykę komórek z obrazem mikroskopowym, następnie źródło otrzymania związków należących do grupy dihydrochalkonów, ich strukturę. Jako stymulatorów użyto LPS, rekombinowany mysi interferon, octan 12-mirystyniano- 13-forbolu; hodowle komórkowe prowadzono w typowy sposób. Odczynniki do oceny cytotoksyczności, odczynniki do oznaczenia tlenku azotu, odczynniki do oznaczania stężenia cytokin, odczynniki do oznaczania aktywności NF-kB pochodziły z wiarygodnych źródeł. Opisano także aparaturę pozostającą na wyposażeniu Zakładu i użytą w badaniach. Również dokładnie opisano sposób przechowywania komórek linii 1774A.1, przygotowanie badanych związków, stymulację komórek, ocenę cytotoksyczności wg oznaczenia aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej, oznaczeme dehydrogenazy mleczanowej wykorzystując zdolność jej do katalizowania reakcji redukcji soli tetrazoliowej do barwnego formazanu, oraz oznaczenie stężenia azotynów, oznaczenie chemiluminescencji i oznacza nią stężenia prozapalnych cytokin. Ekstrakcję białek jądrowych i oznaczenie aktywności NF-kB wykonano według procedur podanych przez producenta. W pracy zastosowano metody statystyczne adekwatne do potrzeb. W rozdziale wyniki Autorka prezentuje cytotoksyczność dihydroalkonów na komórki
J774Al niestymulowane oraz stymulowane LPS i IFN-y, wyniki przedstawione jako procent żywych komórek w stosunku do kontroli. Różnice statystyczne zaobserwowano w hodowli z dodatkiem floretyny, nie zaś asebogeninu i florydzyny. Żywotność komórek stymulowanych LPS i IFN-y nie uległa zmianie w obecności zbadanych stężeń testowanych dihydroalkonów. Nie spostrzegano także różnic w cytotoksyczności komórek mierzonej testem LDH. Zarówno natywne komórki J774A.l jak i z dodatkiem dihydroalkonów uwalniały śladowe ilości NO-2. Najsilniejszy efekt hamujący zaobserwowano w przypadku asebogeninu. Natomiast floretyna i asebogenina silnie hamują chemiluminescencje generowaną przez stymulowane komórki J774A.I. W zjawisku wydzielanie, prozapalnych cytokin przez stymulowane komórki J774AI: IL-I, TNF-a, IL-6 oraz IL-12p40, spostrzegano zwiększenie stężenia badanych cytokin po stymulacji LPS i IFN-y. Wpływ dihydroalkonów na stężenie wymienionych cytokin był zróżnicowany. Najsilniejsze właściwości inhibicyjne w stosunku do produkcji cytokin wykazywał asebogenin, dodanie do hodowli komórkowej florydzyny zmniejszało syntezę tylko TNF-L i IL-12p40. Ocenę aktywności wiązania podjednostki p65 NF-kB w ekstraktach jądrowych niestymulowanych oraz stymulowanych LPS i IFN-y komórek J774A.l prowadzono z zastosowaniem testu ELISA i przedstawiono jako otrzymane absorbancje produktu reakcji immunologicznej. Wszystkie badane dihydroalkony redukowały aktywność podjednostki p65 NF-kB najsilniejsze działanie odnotowano dla asebogeninu. W rozdziale dyskusja Autorka omawia mechanizm reakcji zapalnej jako reakcji obronnej organizmu w odpowiedzi na infekcję, uraz. Następnie uzasadnia użycie w tych badaniach linii J774A.l. Konfrontując wyniki badań własnych z danymi z piśmiennictwa Autorka uzasadnia użycie metod zbadania żywotności komórek, syntezy cytokin prozapalnych, tlenku azotu, reaktywnych form tlenu, dla oceny przeciwzapalnych aktywności chaikonów. Autorka uzyskała wyniki zmniejszenia uwalniania NO przez aktywowane makrofagi pod wpływem chaikonów. Najefektowniejszym inhibitorem syntezy NO- 2 okazał się asebogenin. Zbadane związki floretyna i asebogenin wykazują silne właściwości hamujące intensywność chemiluminescencji wzmocnionej luminolem. Tłumaczenie mechanizmu wpływu chalkonów na produkcję cytokin obejmuje zagadnienia biologii molekularnej procesu zapalnego związanego z TNF -L, IL-I, IL-6. Aktywność NF-kB zachodzi w stanach zapalnych. Udowodniono w pracy że wszystkie
badane dihydroalkony znacząco hamują indukowaną LPS i IFN-y aktywność NF-kB w komórkach J774A.l. Badania te uzupełniają dane z piśmiennictwa. W podsumowaniu dyskusji Autorka podkreśla zdolność dihydroalkonów do wielokierunkowej modulacji reakcji zapalnej z udziałem komórek makrofagowych J774A.l. Wyniki uzyskane dla asebogeninu mają charakter pionierski. Piśmiennictwo obejmuje 149 pozycji, właściwie cytowanych w tekście. W oparciu o przeprowadzone badania Autorka zredagowała pięć wniosków. Odpowiadają one założonym celom badawczym, są logiczne i interesujące. Praca doktorka mgr Magdaleny Kowalskiej dotyczy ważnego problemu, badania zostały wykonane bardzo rzetelnie, a ich opis jest przekonujący. Opierając się na powyższej ocenie stwierdzam, iż praca spełnia ustawowe wymagania pracy doktorskiej i wobec powyższego proszę Radę Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Krakowie o dopuszczenie mgr Magdaleny Kowalskiej do dalszych etapów postępowania doktorskiego. ~ prof. Andrzej Denys