NOVA Gel TM Scl-70 S 708470 Do diagnostyki in vitro Przeznaczenie NOVA Gel TM Scl-70 jest systemem testów podwójnej dyfuzji do badań przesiewowych i półilościowego określania przeciwciał przeciwko Scl-70, ekstrahowalnemu antygenowi jądrowemu (ENA) w ludzkiej surowicy. Obecność przeciwciał przeciwko Scl-70 może być wykorzystana w powiązaniu z innymi testami serologicznymi i wynikami klinicznymi w celu wsparcia diagnozy twardziny. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pojęcie przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w reakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami i rybonukleoproteinami. 1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lub reumatycznymi, szczególnie SLE. Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta wrażliwość diagnostyczna doprowadziła do włączenia testowania ANA do Poprawionych kryteriów z 1982 r. klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego przez podkomisję Stowarzyszenia ds. reumatologii i zapalenia stawów. 2 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE 3 ), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Obecnym trendem w diagnozowaniu i leczeniu chorób tkanki łącznej jest łączenie wrażliwych testów przesiewowych AVA z bardziej swoistymi testami uzupełniającymi, takimi jak dsdna i/lub ENA. Testy ENA są szczególnie ważne, ponieważ dostarczają one informacje diagnostyczne i prognozowe. Przeciwciała przeciwko Scl-70 są swoistym markerem dla twardziny, 2,4 podobnie jak przeciwciała przeciwko Sm i natywnemu DNA są przeciwciałami swoistego markera dla SLE. Przeciwciała Scl-70 występują u 20-60% pacjentów z twardziną. 2,4,5,6 Szeroki zakres stwierdzonej częstotliwości przeciwciał Scl- 70 może wynikać z różnic czułości badania. 7 Gdy pacjenci z twardziną zostaną podzieleni na pacjentów z łagodniejszym zespołem CREST oraz rozproszoną lub postępującą twardziną układową, przeciwciała Scl-70 okazują się bardziej powszechne u pacjentów z twardziną rozproszoną (>70%), w odniesieniu do grupy z łagodniejszą formą choroby. 6,8 Zasada badania Test podwójnej dyfuzji, opisany przez Ouchterlony, 9 obejmuje wykorzystanie roztworu antygenu, który pasywnie przechodzi przez żelowe podłoże podtrzymujące w kierunku próbki pobranej od pacjenta i/lub przeciwciała zawierającego kontrolę. Specjalnie wyprofilowane dołki umieszczone w podłożu żelowym, pełnią funkcję zasobników, z których roztwory antygenu i przeciwciała przedostają się do siebie. W punkcie zrównoważenia antygenu i przeciwciała, w żelu tworzy się widoczna linia precypityny. Następnie można określić stan immunologiczny pacjenta, poprzez obserwowanie wzorów sąsiednich linii precypityny, formujących się w żelu, przy użyciu próbki kontrolnej znanej swoistości i nieznanej surowicy pacjenta. Technika podwójnej dyfuzji może być używana z oczyszczonym preparatem Scl-70, znaną próbką kontrolną przeciwciał Scl-70 oraz surowicą pacjenta, która prawdopodobnie zawiera przeciwciała Scl-70 w celu wykazania immunologicznej tożsamości lub braku tożsamości. Potwierdzenie aktywności autoprzeciwciał Scl-70 w surowicy pacjenta można zrealizować, jeśli jego linia precypityny w charakterystyczny sposób łączy się z linią utworzoną przez znaną próbkę kontrolną. Prawidłowa procedura testowania podwójnej dyfuzji wymaga badana wielu proporcji stężenia antygen-przeciwciało, aby nie dopuścić do uzyskania nadmiaru antygenu lub przeciwciała. Nieprawidłowe lub mylne utworzenie linii precypityny może wystąpić w przypadku nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Aby tego uniknąć, roztwory surowicy pacjenta powinny być badane wraz z tym samym preparatem antygenu. Płytki NOVA Gel S zostały opracowane z myślą o ułatwieniu tego zadania. Duże sześciokątne dołki umożliwiają pomieszczenie 1:1 lub nierozcieńczonego stężenia surowicy pacjenta lub kontroli. Małe prostokątne płytki, ze względu na swój kształt, automatycznie umożliwiają uzyskanie roztworu około 1:4 nierozcieńczonej próbki pacjenta. 1
Odczynniki 1. Płytki żelowe Nova Gel S do badań przesiewowych, każda z 7 dołkami, zawierające stabilizatory oraz azydek sodu 0,09% 2. 0,4 ml antygenu Scl-70 (z grasicy cielęcej), liofizowanej w buforze zawierającym stabilizatory i azydek sodu 0,09% 3. 1,4 ml kontroli Scl-70, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko Scl-70 w buforze zawierającym azydek sodu 0,09%. Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym kontrola Scl-70 powinna być obsługiwana w taki sam sposób jak potencjalnie zakaźny materiał. 10 2. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Do uwadniania antygenu zalecane jest używanie wody destylowanej lub dejonizowanej. 4. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmuje to temperaturę początkową odczynników, zapobieganie wylewaniu się odczynników lub próbek otrzymanych od pacjenta z dołków oraz jakość wody stosowanej do uwadniania antygenu. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 5. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Warunki przechowywania Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. Po uwodnieniu antygen zachowuje trwałość przez 2 tygodnie w temperaturze 2 8 C. W razie potrzeby można przygotować 100 μl próbek, które należy przechować w temperaturze -70 o C. Antygen przechowywany w taki sposób zachowuje trwałość przynajmniej przez 1 rok. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. 2
Badanie Dostarczone materiały 8 dziurkowanych płytek do badań przesiewowych NOVA Gel S 2 0,4 ml antygenu Scl-70, liofizowanego 1 1,4 ml kontroli Scl-70 Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o pojemności 15-100 μl Jednorazowe końcówki mikropipet 0,85% soli fizjologicznej Woda destylowana lub dejonizowana (najlepiej jałowa) Źródło światła lub pudełko do podglądu żelu Sposób przygotowania 1. Uwodnić antygen Scl-70 Ostrożnie otworzyć fiolkę z antygenem i dodać 0,4 ml destylowanej lub dejonizowanej wody do liofilizatu antygenu. W celu uzyskania optymalnych wyników zalecane jest używanie jałowej wody destylowanej lub dejonizowanej. Pozostawić uwodniony antygen na 5 minut, a następnie dobrze wywirować przed użyciem. 2. Napełnianie płytki żelowej Napełnić płytkę żelową antygenem i kontrolami (około 80 μl na duży dołek), jak przedstawiono poniżej. Każda próbka pacjenta powinna być napełniona w większym sześciokątnym dołku (około 80 μl) oraz mniejszym prostokątnym dołku (około 20 μl), jak przedstawiono. Ilości napełniania nie są krytyczne, jednak NIE NALEŻY PRZEPEŁNIAĆ DOŁKÓW. Dołki z kontrolą mogą być napełniane bezpośrednio z plastikowych gruszek laboratoryjnych lub mikropipet. W przypadku używania gruszek laboratoryjnych należy umieścić końcówkę dozownika w dołku i delikatnie ścisnąć, aby poziom płynu zbliżył się do górnej krawędzi dołka. Przykryć płytkę natychmiast po napełnieniu. Uwaga: Mniejsza objętość prostokątnego dołka redukuje lokalne stężenie przeciwciał pacjenta BEZ KONIECZNOŚCI PRZEPROWADZANIA ETAPU RZECZYWISTEGO ROZCIEŃCZANIA PRÓBKI. Końcowe rozcieńczenie w małym dołku wynosi około 1:4. Powoduje to obniżenie prawdopodobieństwa fałszywego negatywnego wyniku na skutek nadmiaru przeciwciał. 3. Inkubacja Pozostawić przykryte płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej na stabilnej płaskiej powierzchni na 24 godziny. Sprawdzić płytki i zwrócić uwagę na linie precypityny, które powstają pomiędzy próbką od pacjenta a antygenem. Sprawdzić powiązanie tej linii z linią precypityny jednej z kontroli. Ponownie sprawdzić płytki po 48 godzinach, aby przed końcową interpretacją wyników ustalić, czy powstały nowe linie. Kontrola jakości Kontrola Scl-70 powinna być umieszczona na każdej płytce w celu zapewniania, aby wszystkie odczynniki i zabiegi zostały przeprowadzone prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze -70 o C. Aby wyniki testów były traktowane jako wiążące, linia precypityny musi być widoczna pomiędzy dołkami Scl-70 i antygenu Scl-70. 3
Interpretacja wyników W celu uzyskania optymalnej analizy linii precypityny zalecane jest zastosowanie poniższej procedury: 1. Zdjąć pokrywę płytki. 2. Przytrzymać płytkę w takiej pozycji, aby maksymalnie ograniczyć odbicie powierzchni żelu. 3. Podświetlić płytkę żelową z boku (np. równolegle do powierzchni żelu). Uwaga: Należy zwrócić uwagę, aby źródło światła było zasłonięte przed bezpośrednim widokiem. 4. Linie precypityny są najlepiej widoczne, gdy są umieszczone na ciemnym tle i oglądane pod kątem. 5. Szkło powiększające może pomóc w obserwacji mniej widocznych linii lub w celu rozróżniania niezidentyfikowanych próbek. Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli po 48 godzinach nie ma żadnych widocznych linii precypityny pomiędzy dołkami pacjenta oraz dołkami antygenu. Interpretacja swoistości. W przypadku podwójnej dyfuzji swoistość jest określana poprzez porównanie relacji linii precypityny próbki z liniami znanej kontroli. W przypadku testu NOVA Gel TM Scl-70 występują następujące możliwości: Rys. 1: Brak identyfikacji Rys. 2: Tożsamość Scl-70 Linia precypityny pacjenta 1 przecina lub nie wskazuje tożsamości z kontrolą Scl-70. Wskazuje to na to, że pacjent reaguje z antygenem ENA innym niż Scl-70. Linia precypityny pacjenta 1 łączy się lub wskazuje tożsamości z kontrolą Scl-70. W tym przypadku pacjent ma przeciwciała przeciwko Scl- 70. Ograniczenia badania 1. Obecność kilku linii precypityny może utrudnić interpretację wyników. W takich przypadkach zalecane jest ponowne przebadanie próbki przy rozcieńczeniu 1:2 lub 1:4 w soli fizjologicznej, umieszczając każdy roztwór w dołku sześciokątnym i mniejszym prostokątnym. Spowoduje to uzyskanie roztworu odpowiednio 1:8 lub 1:16 w mniejszym prostokątnym dołku. Rozcieńczenie próbki może wyeliminować słabsze linie lub rozdzielić linie, dzięki czemu interpretacja będzie łatwiejsza. 2. Chociaż jest to mało prawdopodobne w przypadku tego testu z powodu geometrii dołka, to prozoning jest możliwy. Efekt prozone zachodzi, gdy występuje przytłaczająca ilość autoprzeciwciał pacjenta w stosunku do antygenu (nadmiar przeciwciał), skutkiem czego linia precypityny powstaje przy krawędzi dołka antygenu. W takich przypadkach zalecane jest ponowne testowanie możliwych pozytywnych próbek przy rozcieńczeniu 1:2 lub 1:4 w celu wyeliminowania fałszywej negatywnej interpretacji testu. 3. Jeśli do uwadniania antygenu używana jest niejałowa lub zanieczyszczona woda, antygen może wykazywać natychmiastową lub progresywną degradację. W takim przypadku może pojawić się bardzo delikatna linia precypityny lub może nie pojawić się w ogóle. 4. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 5. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 4
Spodziewane wartości Test podwójnej dyfuzji NOVA Gel TM Scl-70 został użyty do oszacowania różnorodności pacjentów z chorobami tkanki łącznej oraz 200 losowo wybranych dawców krwi. Wyniki znajdują się poniżej: Grupa pacjentów Numer Test NOVA Gel ENA na liczbę pozytywnych Pozytywne Scl-70 SLE 105 0 Toczeń polekowy 24 0 Reumatoidalne zapalenie stawów 40 0 Twardzina 24 15 Zapalenie skórno-mięśniowe 14 0 Zespół Sjogrena 14 0 Normalne 200 0 5
Piśmiennictwo 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. 2. Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964. 4. Catoggio LJ, et al. Serological Markers in progressive systemic sclerosis. Clinical Correlations, Annals of the Rheumatic Diseases 42:23-27, 1983. 5. Takehara K, Moroi Y, Ishibasi Y. Antinuclear antibodies in the relatives of patients with systemic sclerosis. Br J Dermatol 112:23, 1985. 6. Jarzabek-Chorzelska M, Blaszczyk M, Jablonska S, Chorzelski T, Kumar V, Beutner E. Scl-70 antibody-a specific marker of systemic sclerosis. Br J Dermatol 115:393-401, 1986. 7. Kumar V et al. A standardized method of detecting antibodies to extractable nuclear antigens (RNP and Sm) by gel precipitation. J Clin Lab Immunol 15:163-166, 1984. 8. Stein V, et al. Clinical Correlations and Prognosis Based on Serum Autoantibodies in Patients with Systemic Sclerosis. Arthritis and Rheumatism 31:2, 1988. 9. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, 1958. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. NOVA Gel jest zastrzeżonym znakiem Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Europejskiej: Copyright 2011. Wszelkie prawa Medical Technology Promedt Consulting GmbH zastrzeżone Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Wyprodukowano przez: Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 INOVA Diagnostics, Inc. www.mt-procons.com 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 628470POL Luty 2011 Stany Zjednoczone Ameryki Wersja 0 Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com 6