MIKROBIOLOGIA KOSMETOLOGICZNA dla studentów II roku, studiów I st. kierunku KOSMETOLOGIA Ćwiczenie 6 i 7 6 Fizjologia drobnoustrojów Wymagania metaboliczne bakterii. Rodzaje podłóż mikrobiologicznych. Zasady hodowli drobnoustrojów. Techniki posiewów na podłożach płynnych i stałych. 7 Typy wzrostu mikroorganizmów w pożywkach mikrobiologicznych. Morfologia kolonii bakteryjnych. (Repetytorium obejmujące materiał z ćwiczeń 1-7) liczba godzin Zagadnienia do ćwiczeń 6 1. Występowanie i właściwości fizjologiczne bakterii.. Wymagania metaboliczne bakterii. 3. Materiały zapasowe i przetrwalniki bakteryjne. 4. Rodzaje podłóż mikrobiologicznych - podział ze względu na konsystencję, skład, zastosowanie: - płynne, półpłynne, stałe, - naturalne, półsyntetyczne, sztuczne, - proste, wzbogacone, wybiórczo-namnażające, wybiórczo-różnicujące, specjalne, transportowe. 5. Zasady hodowli drobnoustrojów (zawartość składników odżywczych w podłożu, ph, ciśnienie osmotyczne, temperatura, potencjał oksydo-redukcyjny, czas). 6. Techniki posiewów na podłożach płynnych i stałych. Zagadnienia do ćwiczeń 7 1. Typy wzrostu mikroorganizmów w pożywkach mikrobiologicznych płynnych, półpłynnych i stałych.. Cechy morfologii kolonii bakteryjnych (kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, struktura, kolor, przejrzystość, konsystencja, zapach, inne np. typ hemolizy). lp. Ćwiczenia praktyczne Duża różnorodność wymagań metabolicznych i przystosowań fizjologicznych mikroorganizmów przyczynia się do ich rozprzestrzenienia i występowania w wielu różnych środowiskach. Zróżnicowane wymagania metaboliczne i właściwości biochemiczne mikroorganizmów pozwalają także na identyfikację drobnoustrojów chorobotwórczych izolowanych od osób zakażonych. Klasyczna diagnostyka mikrobiologiczna obejmuje: - mikroskopowe badanie próbki pobranej od pacjenta wykonanie preparatu bezpośredniego, - wykonanie hodowli z tej próbki posiew na podłoża płynne i stałe, - izolację czystych szczepów i ich identyfikację metodami biochemicznymi, serologicznymi, molekularnymi, biologicznymi, - badanie lekowrażliwości wyizolowanego drobnoustroju. 1 Podłoża mikrobiologiczne sztucznie stworzone środowisko wzrostu do hodowli mikroorganizmów, stosowane do namnażania, izolacji, różnicowania, identyfikacji, określania właściwości fizjologicznych i biochemicznych, otrzymywania określonych produktów metabolizmu A Podział ze względu na konsystencję: Charakterystyka/przykłady płynne półpłynne stałe B Podział ze względu na zawartość składników: Charakterystyka/przykłady naturalne półsyntetyczne syntetyczne 1
C Podział ze względu na ilość i jakość składników: Charakterystyka/przykłady proste - płynne (bulion zwykły) - stałe (agar zwykły) wzbogacone - płynne (bulion cukrowy) - stałe (agar z 5% odwłóknioną krwią baranią) wybiórczo-namnażające - płynne (bulion z żółcią) - stałe (podłoże z cetrymidem) wybiórczo-różnicujące - stałe (Chapmana) specjalne - płynne (Tarrozziego-Wrzoska) - stałe (Loewensteina-Jensena) transportowe
Wykonywanie posiewu redukcyjnego i murawkowego na stałym podłożu agarowym - przygotować stanowisko pracy, pobrać hodowlę mikroorganizmów w podłożu płynnym (do posiewu) oraz 1 szalkę z agarem zwykłym i podzielić ją na połowy i opisać Wykonanie posiewu redukcyjnego (jedna połowa szalki): - jałową (wyżarzoną) ezą pobrać zawiesinę bakteryjną i nanieść na podłoże agarowe - posiew zacząć od górnego brzegu szalki i dynamicznym ruchem zygzakowatym kierować ezę do środka szalki, pozostawiając znaczną część powierzchni płytki wolną, - ezę wyżarzyć się w płomieniu palnika, obrócić szalkę o 45 w lewo i ponownie wykonać zygzakowate ruchy ezą, zahaczając na początku o wcześniejszą ścieżkę, - ponownie wyżarzyć ezę i powtórzyć procedurę jeszcze dwa razy, - po inkubacji w miejscach z ostatnich etapów posiewu redukcyjnego powstaną osobne kolonie bakterii wywodzące się z pojedynczych komórek Wykonanie posiewu murawkowego (druga połowa szalki): - jałową (wyżarzoną) ezą pobrać zawiesinę bakteryjną i nanieść na podłoże agarowe materiał należy rozprowadzać gęstymi, zygzakowatymi ruchami ezy na całej połowie szalki, w trzech kierunkach, bez wyżarzania ezy przy zmianie kierunku posiewu - płytki inkubować w temperaturze 37ºC, przez 48 godzin, do góry dnem - po inkubacji opisać morfologię kolonii drobnoustrojów wyrosłych na agarze zwykłym w sektorze, w którym wykonano posiew redukcyjny - opis morfologii kolonii bakteryjnych powinien obejmować następujące dane: kształt, wielkość, kolor, brzeg, powierzchnia, struktura, przejrzystość, (konsystencja, zapach) rysunek wykonania posiewów: posiew redukcyjny posiew murawkowy opis kolonii wyrosłych na agarze zwykłym: 3
3 Badanie właściwości metabolicznych mikroorganizmów - wykonywanie posiewów na podłoża diagnostyczne z podłóż stałych - jedna osoba z pary wykonuje posiew Escherichia coli, druga Pseudomonas aeruginosa A Źródła węgla A.1 Badanie zdolności do rozkładu laktozy w warunkach tlenowych - podłoże Endo wykonać posiew redukcyjny na podłożu Endo - płytki inkubować w temperaturze 37ºC, przez 4-48 godzin, do góry dnem, Podłoże Endo zawiera laktozę (źródło węgla), fuksynę zasadową i siarczyn sodowy redukujący fuksynę do bezbarwnej leukozasady. Po okresie inkubacji, bakterie fermentujące laktozę wytwarzają w procesie fermentacji aldehyd octowy, który powoduje uwolnienie fuksyny - dzięki temu podłoże oraz kolonie przybierają barwę ciemnoczerwoną z metalicznym zielono-złotym połyskiem. fermentacja laktozy - podłoże i kolonie ciemnoczerwone z metalicznym zielono-złotym połyskiem, brak fermentacji laktozy kolonie białe, przejrzyste, błyszczące. A. Badanie zdolności do rozkładu laktozy w warunkach beztlenowych - woda peptonowa z 10% laktozą pod parafiną wykonać posiew za pomocą jałowej ezy - pobrać posiewany materiał, wprowadzić ezę pod warstwę parafiny przy ściance probówki i uwolnić materiał do pożywki - inkubację prowadzić w temperaturze 37 C, przez 4-48 godzin, Woda peptonowa z 10% laktozą pod parafiną w skład pożywki oprócz laktozy wchodzi wskaźnik ph - purpura bromokrezolowa (wyjściowa barwa pożywki: fioletowo-purpurowa). Jeśli nastąpi beztlenowy, bakteryjny rozkład laktozy dochodzi do zakwaszenia (obniżenia ph) pożywki przez akumulujące się produkty przemian metabolicznych, co manifestuje się zmianą barwy pożywki po inkubacji na kolor żółty. beztlenowy rozkład laktozy: pożywka żółta, brak rozkładu laktozy: pożywka fioletowo-purpurowa (barwa wyjściowa). A.3 Badanie wykorzystywania cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla podłoże Simmonsa wykonać posiew za pomocą jałowej igły - pobrać posiewany materiał, posiew wykonać poprzez rozprowadzenie materiału zygzakowatym ruchem igły po skośnej części podłoża - inkubację prowadzić w temperaturze 37 C, do 5 dni, Podłoże Simmonsa zawiera cytrynian sodu jako jedyne źródło węgla oraz nieorganiczną sól amonową jako źródło azotu, wskaźnikiem ph jest błękit bromotymolowy wyjściowa barwa pożywki: zielona. Bakterie mające zdolność wykorzystywania cytrynianu sodu uwalniają jon amonowy z soli amonowej, co prowadzi do alkalizacji podłoża (wzrost ph) i barwa pożywki zmienia się po inkubacji na niebieską. wykorzystywanie cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla: podłoże niebieskie, brak zdolności do wykorzystywania cytrynianu sodu: brak wzrostu, podłoże zielone (barwa wyjściowa). B Źródła azotu B.1 Badanie zdolności do rozkładu mocznika - podłoże Christensena wykonać posiew za pomocą jałowej ezy - pobrać posiewany materiał, wprowadzić ezę do probówki i uwolnić materiał do pożywki - inkubację prowadzić w temperaturze 37 C, przez 4-48 godzin, Mocznik może stanowić źródło azotu dla bakterii, które posiadają enzym umożliwiający hydrolizę tego związku, tj. ureazę. Przy udziale ureazy mocznik jest rozkładany do dwutlenku węgla i amoniaku. Zdolność bakterii do rozkładu mocznika bada się z wykorzystaniem podłoża Christensena Podłoże Christensena oprócz mocznika jako jedynego źródła azotu zawiera wskaźnik ph czerwień fenolową (wyjściowa barwa pożywki: żółta, słomkowa). Jeśli testowany mikroorganizm rozkłada mocznik, następuje alkalizacja podłoża (wzrost ph) wskutek uwolnienia amoniaku i podłoże po inkubacji zmienia barwę na czerwono-fioletową rozkład mocznika: pożywka czerwono-fioletowa, brak rozkład mocznika: pożywka żółta (barwa wyjściowa). 4
3 Badanie właściwości metabolicznych mikroorganizmów odczyt cecha Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa A.1 rozkład laktozy na podłożu Endo A. A.3 rozkład laktozy w warunkach beztlenowych wykorzystywanie cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla B.1 rozkład mocznika 4 Prezentacja testu API Test API jest testem biochemicznym umożliwiającym identyfikację gatunku mikroorganizmu. Składa się z 0 miniprobówek z przezroczystego tworzywa wtopionych w pasek również wykonany z tworzywa. W każdej miniprobówce znajduje się odwodniony substrat i wskaźnik umożliwiający odczytanie reakcji. Oznaczenie polega na dodaniu zawiesiny badanych bakterii do wszystkich probówek i po inkubacji dodaniu do niektórych probówek odpowiednich odczynników. Zmiany barwy zawartości probówek umożliwiają określenie, jakie substraty są rozkładane lub jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje. Określenie grupy lub gatunku dokonuje się na podstawie załączonego przez producenta klucza diagnostycznego. Do odczytu służy książka kodowa lub program komputerowy. 5