Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP)

NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) LAMP is registered trademark owned by Eiken Chemical Co., Ltd. Opracowanie: Marta Jankowska Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Adam Burzyński Novazym Polska POZNAŃ 2012

Strona2 SPIS TREŚCI WSTĘP... 3 LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification)... 3 Historia... 3 Publikacje naukowe na temat LAMP... 4 Zakres wykorzystywania LAMP:... 4 WIRUSY:... 4 BAKTERIE... 5 GRZYBY:... 6 PIERWOTNIAKI:... 7 GMO:... 7 LAMP - Zasada działania reakcji... 8 Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów)... 8 Warunki reakcji LAMP... 10 Projektowanie starterów do LAMP... 11 Zasady projektowania starterów do LAMP... 11 Parametry starterów:... 12 Programy do projektowania starterów... 13 Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons )... 13 Metody detekcji... 13 1. Elektroforeza w żelu agarozowym... 13 2. Analiza turbidymetryczna... 14 3. Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym... 15 4. Analiza fluorymetryczna... 15 5. Fluorescencja w czasie rzeczywistym... 16 Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP... 17 Badanie SNP technika LAMP... 18 Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermalnej amplifikacji DNA, firmy OptiGene.... 19 Genie II zinegrowana elastyczna platforma... 19 GspSSD Polimeraza... 20 Isothermal Master Mix... 20 Zalety i wady techniki LAMP... 21 Podsumowanie... 21 Bibliografia... 22

Strona3 WSTĘP LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) Nowatorska metoda amplifikacji kwasów nukleinowych, która pozwala na szybką identyfikację patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Metoda polega na syntezie nowych nici DNA na matrycy (DNA lub RNA) w kolejnych cyklach reakcji oraz zastępowaniu (wymianie) łańcuchów DNA (ang. stand displacement) przez łańcuchy nowo zsyntetyzowane. Polimeraza wykorzystywana w reakcji posiada aktywność syntezy nici DNA w kierunku 5 ->3 oraz wymiany nici, nie posiada aktywności egzonuklotydowej. Powstałe amplifikowane produkty posiadają strukturę składającą się z naprzemian odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu DNA. Produkt LAMP jest mieszaniną łańcuchów DNA tworzących struktury typu łodyga-pętla (ang. stem-loop) różniących się wielkością, Uzyskany produkt posiada wysoką specyficzność do matrycy poprzez zastosowanie 2 par starterów komplementarnych do 6 niezależnych miejsc na matrycy w początkowym etapie reakcji oraz 4 niezależnych miejsc w kolejnych etapach LAMP. Historia Amplifikacja przebiega w warunkach izotermicznych (w stałej temperaturze). 1998 opracowanie techniki LAMP przez japońską firmę EIKEN CHEMICAL CO, LTD 2000 pierwsza publikacja naukowa nt. LAMP (Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Notomi T,Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T) 2002 pojawienie się na rynku komercyjnych zestawów do prowadzenia reakcji LAMP 2006 pojawienie się zestawów do wykrywania patogenów w żywności i w środowisku (Cryptosporidium, Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes etc.) 2009 założenie w UK firmy OptiGene Ltd 2011 - umowa licencyjna pomiędzy OptiGene Ltd i Eiken Chemical Co, Ltd. zezwalająca OptiGene na rozwijanie i sprzedaż urządzeń i produktów do prowadzenia LAMP 2011 wprowadzenie na rynek przez OptiGene Ltd w pełni zintegrowanej platformy Genie II do prowadzenia reakcji LAMP w czasie rzeczywistym 2012 umowa pomiędzy Novazym Polska s.c., a OptiGene Ltd o wyłączność dystrybucji na terenie Polski.

Strona4 Publikacje naukowe na temat LAMP Wykorzystywanie reakcji LAMP (liczba publikacji na przestrzeni lat, na podstawie PubMED) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Rysunek 1Liczba publikacji w latach 2000-2011 Obecnie >600 publikacji, (w 2012 16 publikacji) Zakres wykorzystywania LAMP: Wykrywanie obecności patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Technika jest wykorzystywana w badaniach weterynaryjnych, środowiskowych, rolnictwie, badaniach żywności, diagnostyce laboratoryjnej. Ponad 200 genów zamplifikowano techniką LAMP Szeroki zakres zastosowań (przykłady poniżej): WIRUSY: influenza A Detection of human influenza A viruses by Loop-mediated Isothermal AMPlification. Poon LL, Leung CS, Chan KH, Lee JH, Yuen KY, Guan Y, Peiris JS.J Clin Microbiol. 2005 Jan; 43(1):427-30 herpes simplex Rapid diagnosis of herpes simplex virus infection by a loop-mediated isothermal amplification method. Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Miyake F, Usui C, Suga S, Suzuki K, Kawana T, Nishiyama Y, Asano Y. Clin Microbiol. 2005 Feb; 43(2):951-5 Ebola virus Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H, Kawaoka Y, Yasuda J. J Virol Methods. 2007 Apr; 141(1):78-83. Epub 2006 Dec 27 porcine parvovirus Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification. Chen CM, Cui SJ. J Virol Methods 2009 Feb; 155(2):122-5. Epub 2008 Nov 20 epidemic diarrhea virus Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus. Ren X, Li P. Virus Genes. 2011 Apr; 42(2):229-35. Epub 2011 Feb 1 porcine circovirus type 2 Specific, simple and rapid detection of porcine circovirus type 2 using the loop-mediated isothermal amplification method. Zhao K, Shi W, Han F, Xu Y, Zhu L, Zou Y, Wu X, Zhu H, Tan F, Tao S, Tang X. Virol J. 2011 Mar 18;8:126

Strona5 human papillomavirus Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification Saetiew C, Limpaiboon T, Jearanaikoon P, Daduang S, Pientong C, Kerdsin A, Daduang J.J Virol Methods. 2011 Dec; 178(1-2):22-30 Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye.luo L, Nie K, Yang MJ, Wang M, Li J, Zhang C, Liu HT, Ma XJ.J ClinMicrobiol. 2011 Oct; 49(10):3545-50 Colorimetric detection of HPV6 and HPV16 by loop mediated isothermal amplification.lu CB, Luo L, Yang MJ, Nie K, Wang M, Ma XJ.Bing Du XueBao. 2011 Jan; 27(1):64-70 Loop-mediated isothermal amplification method for detection of human papillomavirus type 6, 11, 16 and 18 Hagiwara M, Sasaki H, Matsuo K, Honda M, Kawase M, Nakagawa H. J Med Virol. 2007 May; 79(5):605-15 BAKTERIE Mycobacterium tuberculosis Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum sample Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K.J ClinMicrobiol. 2003 Jun; 41(6):2616-22 Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimm sequence for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis Zhu RY, Zhang KX, Zhao MQ, Liu YH, Xu YY, Ju CM, Li B, Chen JD.J Microbiol Methods. 2009 Sep; 78(3):339-43. Epub 2009 Jul 17. Erratum in: J Microbiol Methods. 2009 Nov;79(2):250 Streptococcus pneumoniae Loop-mediated isothermal amplification method targeting the lyta gene for detection of Streptococcus pneumoniae Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, Tsuda H, Sato S, Maeno M.J Clin Microbiol. 2005 Apr; 43(4):1581-6 Clostridium difficile Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification Kato H, Yokoyama T, Kato H, Arakawa Y.J Clin Microbiol 2005 Dec; 43(12):6108-12 Campylobacter jejuni Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli Yamazaki W, Taguchi M, Ishibashi M, Kitazato M, Nukina M, Misawa N, Inoue K.J Med Microbiol. 2008 Apr; 57(Pt 4):444-51 Clostridium botulinum Rapid and simple detection of Clostridium botulinum types A and B by loopmediated isothermal amplification Sakuma T, Kurosaki Y, Fujinami Y, Takizawa T, Yasuda J.J ApplMicrobiol. 2009 Apr; 106(4):1252-9. Epub 2009 Jan 30 Salmonella A loop-mediated isothermal amplification method targets the phop gene for the detection of Salmonella in food samples Li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, Zheng W, Liu C, Lü D, Xiang R, Liu Y. Int J Food Microbiol. 2009 Aug 15; 133(3):252-8. Epub 2009 Jun 1 The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Ueda S, Kuwabara Y.Biocontrol Sci. 2009 Jun;14(2):73-6

Strona6 Rapid, sensitive, and specific detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated isothermal amplification Okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Takehara K, Ikedo M, Kojima T, Nakamura M.Avian Dis. 2009 Jun;53(2):216-21.) Escherichia coli O157 Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples.zhao X, Li Y, Wang L, You L, Xu Z, Li L, He X, Liu Y, Wang J, Yang L. Mol Biol Rep. 2010 Jun; 37(5):2183-8. Epub 2009 Aug 15 Staphylococcus aureus Loop-mediated isothermal amplification assays for identification of antiseptic and methicillin-resistant Staphylococcus aureus Hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K, Sato A, Watari H, Kojima T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T.J Microbiol Methods. 2011 Feb; 84(2):251-4. Epub 2010 Dec 16.) Listeria monocytogenes Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loop-mediated isothermal amplification Tang MJ, Zhou S, Zhang XY, Pu JH, Ge QL, Tang XJ, Gao YS. Curr Microbiol 2011 Dec; 63(6):511-6. Epub 2011 Sep 21 Clostridium perfringens Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods Kaneko I, Miyamoto K, Mimura K, Yumine N, Utsunomiya H, Akimoto S, McClane BA. Appl Environ Microbiol. 2011 Nov; 77(21):7526-32. Epub 2011 Sep 2 Vibrio cholerae Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loopmediated isothermal amplification Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K. BMC Microbiol 2008 Jun 12;8:94 A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, Suzuki Y, Roobthaisong A, Puiprom O, Honda T, Sawanpanyalert P. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010 Feb; 66(2):135-9. Epub 2009 Oct 7 Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae Ke XM, Chen YY, Gao LL, DU ZP, Feng XM, Liao RY, Chen ZY, Cao YC, Chen Q. Nan Fang Yi Ke Da XueXueBao. 2009 Oct; 29(10):2059-63 GRZYBY: Paracoccidiodes brasiliensis Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K.FEMS MicrobiolLett. 2004 May 1;234(1):93-7 Candida Efficient identification of clinically relevant Candida yeast species by use of an assay combining panfungal loop-mediatedisothermal DNA amplification with hybridization to speciesspecific oligonucleotide probes Inácio J, Flores O, Spencer-Martins I.J. Clin Microbiol. 2008 Feb; 46(2):713-20. Epub 2007 Dec 12 Pneumocystis pneumonia Development of a loop-mediated isothermal amplification method for diagnosing Pneumocystis pneumonia Uemura N, Makimura K, Onozaki M, Otsuka Y, Shibuya Y, Yazaki H, Kikuchi Y, Abe S, Kudoh S.J. Med Microbiol. 2008 Jan;57(Pt 1):50-7

Strona7 PIERWOTNIAKI: Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method Zhang H, Thekisoe OM, Aboge GO, Kyan H, Yamagishi J, Inoue N, Nishikawa Y, Zakimi S, Xuan X.ExpParasitol. 2009 May;122(1):47-50. Epub 2009 Feb 1 Wuchereria bancrofti Development of loop-mediated isothermal amplification method for detecting Wuchereriabancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes Takagi H, Itoh M, Kasai S, Yahathugoda TC, Weerasooriya MV, Kimura E.Parasitol Int. 2011 Dec;60(4):493-7. Epub 2011 Sep 10 Plasmodium falciparum Development of a reverse transcription - loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for clinical detection of Plasmodium falciparum gametocytes Buates S, Bantuchai S, Sattabongkot J, Han ET, Tsuboi T, Udomsangpetch R, Sirichaisinthop J, Tan-ariya P.Parasitol Int. 2010 Sep; 59(3):414-20. Epub 2010 Jun 10 GMO: Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA sequences Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. BMC Biotechnol. 2009 Feb 2;9:7 Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated isothermal amplification Liu M, Luo Y, Tao R, He R, Jiang K, Wang B, Wang L. Biosci Biotechnol Biochem 2009 Nov; 73(11):2365-9. Epub 2009 Nov 7

Strona8 LAMP - Zasada działania reakcji Kolejne cykle wydłużania i zastępowania nici prowadzone są przy użyciu odpowiedniej polimerazy oraz 2 lub 3 par starterów rozpoznających odpowiednio 6 lub 8 miejsc matrycy. Startery wewnętrzne to FIP (Forward Inner Primer) oraz BIP (Backward Inner Primer), sekwencję ich są komplementarne do dwóch różnych odległych miejsc w sekwencji matrycy (nici sensownej i antysensownej). Startery zewnętrzne F3 (Forward) i B3(Backward) komplementarne są do zewnętrznych końców matrycy. Startery zewnętrzne są krótsze od starterów wewnętrznych i ich końcowe stężenie w reakcji jest niższe, dlatego wolniej hybrydyzują do matrycy inicjując reakcję zastępowania nici. Dodatkowo dla wzmocnienia reakcji można zastosować startery zapętlające LoopF i LoopR. Zastosowanie trzeciej pary starterów zwiększa ilość punktów startowych do reakcji LAMP, tym samym zwiększając wydajność oraz czułość reakcji. Zastosowana polimeraza DNA posiada aktywność zastępowania nici DNA (ang. strand displacement activity), dzięki czemu nie potrzebna jest dodatkowa denaturacja matrycy i reakcję można prowadzić w warunkach izotermicznych. Kluczową cechą LAMP jest utworzenie w pierwszym etapie reakcji sztucznej matrycy (ssdna) o strukturze typu łodyga-pętla, przez tzw. self-priming końców matrycy. Matryca w następnych etapach jest amplifikowana, co prowadzi do powstania mieszaniny dwuniciowego DNA o strukturach podobnych do kalafiora. Proces można podzielić na etapy: 1. Tworzenie materiału startowego do LAMP 2. Cykliczna amplifikacja 3. Elongacja i recyklizacja Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów) Gdy dsdna osiągnie stan równowagi (65 C) wówczas pierwszy ze starterów wewnętrznych może przyłączyć się do komplementarnej sekwencji matrycy inicjując syntezę nowej nici DNA. Polimeraza DNA o aktywności zastępującej wydłuża starter w kierunku 5 ->3.

Strona9 Następnie starter zewnętrzny F3 hybrydyzuje do miejsca F3c matrycy i następuje jego wydłużanie. Następuje wydłużanie startera F3 w kierunku 5 ->3 oraz odsunięcie nici oflankowanej starterem FIP. Nowo powstały dsdna (powyżej) uwolniony ssdna (poniżej). Uwolniona nić ssdna oflankowana starterem FIP tworzy na końcu 5 strukturę pętli z powodu komplementarności sekwencji F1c z końca 5 do sekwencji F1 wewnątrz sekwencji. Nić ta jest matrycą dla kolejnego startera wewnętrznego BIP, następuje wydłużenie i powstanie nowej nici oraz struktura pętli powraca do formy liniowej. Następnie starter B3 przyłącza się na zewnątrz od BIP, następuje wydłużanie nowej nici i uwolnienie ssdna. Uwolniona nić ssdna tworzy strukturę pętli na obydwu końcach (struktura przypominająca hantle). Tak powstała struktura stanowi matrycę dla rozpoczęcia kolejnego etapu reakcji: cyklicznej amplifikacji. STRUKTURA STARTOWA DLA REAKCJI LAMP

Strona10 Rozpoczyna się etap cyklicznej amplifikacji, starter FIP przyłącza się do ssdna i zaczyna się synteza nowej kolejnej nici w kierunku 5 ->3, uwalniając wcześniej zsyntetyzowaną nić. Następnie na końcu 3 regionu B1 następuje wydłużenie nici i uwolnienie nici oflankowanej starterem FIP (9). Uwolniona nić tworzy strukturę hantli z pętlami na obydwu końcach (11). Powstała nić jest odwróceniem nici z etapu (8). Podobnie jak w etapach (8) do (11) następuje tzw. self-priming matrycy (11), dodatkowo starter BIP hybrydyzuje do regionu B2c i następuje wydłużanie starterów i zastępowanie i uwalnianie kolejnej nici DNA. W trakcie reakcji wydłużania starterów, self-priming matrycy oraz zastępowania nici powstają produkty składające się z na przemian odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu. Animacja reakcji LAMP: http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html Warunki reakcji LAMP Temperatura: 60-70 C (~ 63 C) warunki izotermiczne Objętość reakcji: 25 l Enzym: polimeraza DNA GspSSD, 8U/reakcję Startery: o Wewnętrzne (FIP, BIP): 0.8 M o Zewnętrzne (F3, B3): 0.2 M o Zapętlające (LF, LB): 0.4 M Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dntps): 1.4 mm każdego Matryca: 0,5-5 l / reakcję Czas reakcji: do 1 godziny

Strona11 Projektowanie starterów do LAMP Odpowiednie zaprojektowanie starterów jest kluczowym etapem poprawnego przeprowadzenia reakcji LAMP. FIP (Forward Inner Primer) starter wewnętrzny forward, zawiera na końcu 3 region F2 komplementarny do F2c matrycy oraz na końcu 5 region F1c BIP (Backward Inner Primer) starter wewnętrzny reverse, zawiera na końcu 3 region B2 komplementarny do B2c matrycy oraz na końcu 5 region B1c F3 (Forward Primer) - starter zewnętrzny forward, zawiera w swojej sekwencji region F3 matrycy komplementarny do F3c B3 (Backward Primer) - starter zewnętrzny reverse, zawiera w swojej sekwencji region B3 matrycy komplementarny do B3c Loop F (Loop Forward Primer) starter zapętlający forward, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami F2 i F1 na końcu 5 nici ssdna o strukturze przypominającej hantle (ang. Dumbell-like structure). Loop B (Loop Backward Primer) starter zapętlający reverse, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami B2 i B1 na końcu 5 nici ssdna o strukturze przypominającej hantle (ang. Dumbell-like structure). Rysunek 2. Sekwencje starterów wykorzystywane w reakcji LAMP Zasady projektowania starterów do LAMP Odpowiednie i poprawne zaprojektowanie starterów wymaga postępowania krok po kroku zgodnie z poniższymi wskazówkami: Określenie wymagań (celu) badań o Matryca: wybór odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (dawać pozytywny wynik reakcji) o Określenie odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny nie mogą być amplifikowane (dawać negatywny wynik reakcji), Zebranie dostępnych sekwencji genów dla wszystkich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, które mają dawać pozytywny i negatywny wynik reakcji, Dopasowanie i określenie regionów konserwatywnych w genomie szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane, - czułość LAMP Określenie regionów unikalnych (specyficznych) w genomie szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (regiony nie występujące w genomach mikroorganizmów, które mają dawać negatywny wynik) specyficzność LAMP Wykorzystanie dostępnych programów komputerowych do projektowania starterów.

Strona12 W przypadku, gdy zaprojektowane startery nie dają satysfakcjonującego rezultatu (brak produktu, obecność niespecyficznych sekwencji etc.) należy ponownie zaprojektować startery. Parametry starterów: Odległość pomiędzy regionami starterów: Odległość pomiędzy końcami regionu F2 i B2 (region amplifikowany przez LAMP) powinna wynosić 120 180 pz, natomiast zarówno pomiędzy F2 i F3. oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 20 pz. Odległość dla regionów tworzących strukturę pętli (pomiędzy 5' końcem F2 i 5' końcem F1 oraz 5' końcem B2 i 3' końcem B1) powinna wynosić 40 60 pz. Odległość pomiędzy regionami F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 60 pz. 5 F3 F2 B1c 3 F1c B2 B3 5 <40~60 pz> <40~60 pz> Temperatura topnienia (Tm): <0~60>pz <120~160>pz <0~60>pz Około 60-65 C dla regionów bogatych w pary GC i ok. 55-60 C dla regionów bogatych w pary AT Tm dla każdego regionu powinna wynosić odpowiednio: ok. 65 C (64-66 C) dla F1c i B1c, ok. 60 C (59-61 C) dla F2, B2, F3, i B3 oraz ok. 65 C (64-66 C) dla starterów LoopF i LoopB. Stabilność końców Końce starterów stanowią początkowy punkt dla syntezy DNA i tym samym muszą być odpowiednio stabilne. Końce 3 regionów F2/B2, F3/B3, i LF/LB oraz koniec 5 regionów F1c/B1c powinny być zaprojektowane tak by energia swobodna wynosiła 4 kcal/mol lub mniej (dla 6 pz końca). Koniec 5 regionu F1c po amplifikacji łączy się z końcem 3 regionu F1, dlatego stabilność jest bardzo istotna. (Zmiana energii swobodnej ΔG jest różnicą pomiędzy energią swobodną produktu i energią swobodną materiału początkowego) Im niższa wartość ΔG tym z większym prawdopodobieństwem startery hybrydyzują do matrycy. Zawartość par GC powinna wynosić 50-60% w przypadku matryc bogatych w pary GC oraz 40-50% dla matryc bogatych w pary AT. Tworzenie struktur dwurzędowych: Ważne jest w szczególności dla starterów wewnętrznych, aby nie tworzyły struktur drugorzędowych typu primer-dimer. Końce 3 starterów nie mogą być komplementarne względem siebie.

Strona13 Inne: Jeżeli w sekwencji występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, z wyjątkiem regionów dla starterów, mogą być użyte dla potwierdzenia zamplifikowanego produktu Programy do projektowania starterów Primer Explorer V4 Automatyczne oprogramowanie stworzone przez Fujitsu Ltd i Eiken Chemical Co, Ltd Wersja V4 Pracuje w środowisku Windows, Internet Explorer 5+ Dostępne na stronie internetowej: http://primerexplorer.jp/e/ LAMP Designer (OptiGene Ltd) Automatyczne oprogramowanie stworzone przez OptiGeneLtd Posiada wbudowany algorytm wyszukiwania najlepszych sekwencji starterowych Startery przeszukiwane są pod kątem tworzenia struktur drugorzędowych, dimerów, homologii właściwości fizycznych zgodnie z zadanymi warunkami Sekwencje matrycowe mogą być pobierane z baz danych (Acession number), z pliku w formacie tekstowym oraz wklejane bezpośrednio w okienko programu Pracuje w środowisku Windows Wersja demo dostępna na stronie internetowej: http://www.optigene.co.uk/products/lamp_designer.htm Detekcja i wizualizacja produktów LAMP Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Tabela 1. Porównanie produktów reakcji LAMP i PCR LAMP PCR Struktura pętla-łodyga dsdna dsdna Rozmiar różny jednakowy Kształt przypominający kalafior liniowy Liczba kopii genu wiele kopii/1 amplikon 1 kopia/1 amplikon Stężenie 400-800 µg/ml 10 12 kopii/reakcję, 4-40 µg/ml Metody detekcji 1. Elektroforeza w żelu agarozowym Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.) Produkty reakcji wybarwione bromkiem etydyny, rozdzielane w 2% żelu agarozowym Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji) Produkt na żelu widoczny w postaci smearu Wynik tylko jakościowy Wizualizacja w świetle UV Pozwala obserwować produkt reakcji LAMP po trawieniu restrykcyjnym.

Strona14 A Rysunek 3 A. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy HBV techniką LAMP (amplifikacja w temp. 60 C przez 60 min) Linia 1. Marker masy DNA, Linia 2-4. Amplifikowane produkty z matrycy HBV, Linia 5. Kontrola ujemna, Linia 6. Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I) Rysunek 3 B. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy PSA mrna (amplifikacja w temp. 65 C przez 60 min) Linia 1 Marker masy DNA, Linia 2. Kontrola ujemna, Linia 3-4. Amplifikowane produkty z matrycy PSA mrna, Linia 5-6. Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I) 2. Analiza turbidymetryczna B Po raz pierwszy dla LAMP w 2001 roku (Mori et al.) Powstający w trakcie reakcji produkt uboczny, pirofosforan magnezu, pozwala na ocenę wyniku poprzez analizę zmętnienia Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji) Produkt reakcji widoczny gołym okiem Wynik jakościowy W trakcie reakcji przyłączania kolejnych nukleotydów do wydłużanego łańcucha DNA podczas polimeryzacji uwalniany jest z dntp ów pirofosforan. Duża ilość powstającego piroforsforanu reaguje z jonami magnezu obecnymi w buforze reakcyjnym powstaje biały osad (zgodnie z równaniem poniżej: (DNA) n-1 + dntp = (DNA) n + P 2 O 7 4- ; P 2 O 7 4- + 2Mg 2+ = Mg 2 P 2 O 7 Zmętnienie w probówce widoczne jest kiedy stężenie pirofosforanu magnezu przekracza 0.5 mm. Do powstania pirofosforanu magnezu w stężeniu powyżej 0.5 mm potrzeba wytworzenia 4 µg DNA w 25 µl objętości reakcji. W reakcji LAMP uzyskuje się 10 µg DNA/25µl, dla porównania w reakcji PCR otrzymuje się ok. 0.2 µg DNA/25 µl, a stężenie pirofosforanu magnezu wynosi wówczas 0.02 mm, co nie pozwala na zaobserwowanie białego osadu. Dodatkowo warunki termiczne (podgrzewanie) w reakcji PCR powodują, że jony pirofosforanowe są hydrolizowane do jonów fosforanowych. Rysunek 4. Analiza turbidymetryczna produktów reakcji LAMP. Probówka 1 K(-), Probówka 2 amplikon LAMP.

Strona15 3. Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Po raz pierwszy dla LAMP w 2003 roku (Mori et al.) Pomiar w czasie rzeczywistym pozwala wyeliminować etap szacowania ilości produktu po zakończeniu reakcji Pomiar podobny do analizy spektrofotometrycznej Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji Analiza turbidymetryczna jest pomiarem pośrednim ilości DNA, gdyż opiera się na pomiarze stężenia produktu ubocznego reakcji - pirofosforanu magnezu. Określana jest zależność pomiędzy ilością powstającego pirofosforanu magnezu, a ilością powstającego DNA. Rysunek 5. Pomiar zmętnienia produktów reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. 4. Analiza fluorymetryczna Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.) Detekcja produktu przez fluorescencję Detektorami są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po związaniu się z dwuniciowym DNA, takie jak bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina etc. Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji) Analiza jakościowa Wizualizacja w świetle UV, ale produkt reakcji można obserwować gołym okiem A B Rysunek 6 A. Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: kalceina). Jony pirofosforanowe usuwają jony manganu z kalceiny, a fluorescencja wzrasta im więcej kalceiny łączy się z uwolnionymi z dntps jonami magnezu. Probówka 1 K(-), Probówka 2 amplikon LAMP Rysunek 6 B. Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: bromek etydyny) obraz w świetle UV. Probówka 1 - K-, Probówka 2 amplikon LAMP

Strona16 5. Fluorescencja w czasie rzeczywistym Pomiar w czasie rzeczywistym, pozwala to wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie, przez pomiar fluorescencji Specyficzność reakcji - analiza temperatury annealingu produktu. A B Rysunek 7A. Pomiar fluorescencji produktu reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. Rysunek 7 B. Krzywa annealingu produktu reakcji LAMP.

Strona17 Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Przed przystąpieniem do obliczania wskaźników wydajności LAMP należy: 1. określić, które z badanych prób mają dać wynik pozytywny, a które negatywny 2. zebrać jak największą liczbę prób, które będą stanowiły odniesienie (tzw. próby referencyjne) faktycznie dające wynik pozytywny oraz faktycznie dające wynik negatywny 3. zbadać każdą próbę i określić, które w reakcji LAMP dają wynik pozytywny, a które wynik negatywny 4. zebrane dane liczbowe umieścić w tabeli tzw. tablicy 2x2 Wskaźniki: P. odniesienia (+) P. odniesienia (-) Test (+) Prawdziwie dodatnie (PD) Fałszywie dodatnie (FD) suma (PD+FD) Test (-) Fałszywie ujemne (FJ) Prawdziwie ujemne (PJ) suma (FN+PN) SUMA suma (PP+FJ) suma (FD+PJ) SUMA Czułość zdolność do wykrycia badanej cechy, stosunek wyników prawdziwie dodatnich do faktycznie posiadających daną cechę. CZ = PP / (PP+FN) [%] Specyficzność część negatywnych prób odniesienia, która w reakcji dała wynik negatywny, stosunek wyników prawdziwie ujemnych do faktycznie nieposiadających danej cechy. Sp = PJ / FD+PJ [%] Predykcja dodatnia iloraz wyników prawdziwie dodatnich oraz sumy wyników prawdziwie dodatnich i fałszywie dodatnich (czyli wszystkich dodatnich wyników testu). Pd = PD / (PD+FD) [%] Predykcja ujemna iloraz wyników prawdziwie ujemnych oraz sumy wyników prawdziwie ujemnych i fałszywie ujemnych (czyli wszystkich ujemnych wyników testu). Wydajność określa jak często w reakcji otrzymujemy poprawny wynik. W = (PP+PJ) / SUMA

Strona18 Badanie SNP technika LAMP Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) jest to zmienność sekwencji DNA, która polega na zmianie pojedynczego nukleotydu pomiędzy osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającym chromosomem danemu osobnikowi. Wysoka specyficzność reakcji LAMP powoduje, że tylko docelowa dzika sekwencja (wild type allele - nie zawierająca SNP) zostanie zamplifikowana spośród sekwencji homologicznych. Występowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu można potwierdzić przez brak amplifikowanego produktu w reakcji. Możliwe to jest dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu starterów do reakcji. Startery FIP i BIP do reakcji SNP-LAMP projektowane są w taki sposób, że na końcach 5 zawierają nukleotyd SNP. Kiedy matrycą w reakcji jest sekwencja bez polimorfizmu (WT allele) wówczas w trakcie reakcji powstaje struktura startowa i reakcja jest kontynuowana. W przypadku, gdy matrycą jest zmutowana sekwencja genu zawierająca polimorfizm (MUT allele), nie otrzymujemy produktu w reakcji. Rysunek 8. Przebieg reakcji LAMP ukierunkowanej na identyfikację polimorfizmu SNP w sekwencji. Animacja reakcji LAMP:http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.html

Strona19 Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermalnej amplifikacji DNA, firmy OptiGene. OptiGene stosuje izotermalną metodę amplifikacji znaną jako LAMP, która została opracowana przez Eiken Chemical Company Ltd z Japonii. Dużą zaletą tej metody jest prowadzenie reakcji w stałej temperaturze, co eliminuje konieczność stosowania specjalistycznej aparatury. W wielu przypadkach nie potrzebna jest ekstrakcja DNA. Czas oczekiwania na wynik reakcji jest bardzo krótki, np. 10-15 min (detekcja produktu w trakcie trwania reakcji). Genie II zinegrowana elastyczna platforma Genie II to zaawansowane narzędzie, które pozwala na prowadzenie izotermalnej reakcji w czasie rzeczywistym (Real-time) w przenośnej platformie o niskim poborze mocy, dedykowanej do badań laboratoryjnych. System zamknięty prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanym produktem. Genie II jest urządzeniem wyposażonym w dwa niezależne bloki grzejne, każdy mieszczący 8 mikroprobówek (0.2 ml), odpowiednich dla urządzenia. Genie II posiada funkcję gradientową oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności amplifikowanego produktu. Najważniejsze funkcje: szybka izotermiczna amplifikacja potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do analizy krzywej topnienia produktu) niskie koszty i łatwość obsługi kompaktowe, przenośne i wytrzymałe urządzenie zasilanie sieciowe lub bateryjne łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB obsługa za pomocą komputera lub niezależnie przez ekran dotykowy. Rysunek 9. Genie II urządzenie do prowadzenia reakcji LAMP i detekcji produktu.

Strona20 GspSSD Polimeraza Polimeraza z Geobacillus sp. pozwala na uzyskanie z niewielkiej ilości matrycy aż 10 9 kopii DNA w czasie krótszym niż 30 minut. Pozwala na amplifikację matrycy w znacznie krótszym czasie w porównaniu do Bst Polimerazy. Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności. Ze względu na aktywność zastępowania nici (ang. strand displacement activity) pozwala na prowadzenie reakcji w warunkach izotermicznych bez konieczności wykorzystywania specjalistycznej aparatury jak w przypadku reakcji amplifikacji in vitro metodą PCR. Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy. Ze względu na niewielką aktywność odwrotnej transkryptazy pozwala na amplifikowanie RNA z wysoką specyficznością, bez dodatkowego dodawania odwrotnej transkryptazy. Isothermal Master Mix Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP, pozwala na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II oraz innych urządzeniach fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy 488 nm i emisję przy 520 nm. Może być także wykorzystywana w aparatach do qpcr lub Real-time PCR ustawionych na kanał FAM. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia obecności produktu. Eliminuje to konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy turbidymetrycznej oraz pozwala na prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym (close-tube system). Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to: Amplifikacja 30 minut w temp 65 C Annealing co 0,05 C w przedziale 98 C 80 C

Strona21 Zalety i wady techniki LAMP Zalety: Wady: Szybka, krótki czas reakcji (można zaobserwować produkt po 20 min) Czuła i specyficzna, dzięki zastosowaniu starterów rozpoznających 6-8 miejsc na matrycy Izotermalna, możliwość prowadzenia reakcji w stałej temperaturze Prostsze i tańsze urządzenia niż w Real-time PCR, przy porównywalnej czułości Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy Produkt reakcji można zaobserwować gołym okiem Trudniejsze i bardziej czasochłonne projektowanie starterów do reakcji w porównaniu do PCR Nie wszystkie badania DNA są specyficzne do sekwencji Biorąc pod uwagę powyższe zalety i wady, można stwierdzić, że metoda LAMP jest odpowiednia tam gdzie mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami, gdzie wyniki potrzebne są w krótkim czasie oraz prowadzone analizy są specyficzne, co do sekwencji. Natomiast nie nadaje się do analizy nieznanych sekwencji DNA i RNA. Podsumowanie LAMP jest nową innowacyjną i szybko rozwijającą się techniką amplifikacji kwasów nukleinowych LAMP doskonale nadaje się w sytuacjach, gdy mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami sprzętowymi, a prowadzone analizy wymagają bardzo szybkich wyników LAMP umożliwia specyficzną amplifikację matrycy (startery rozpoznają 6-8 różnych sekwencji matrycy) Projektowanie starterów dla reakcji LAMP jest bardziej złożone niż w przypadku PCR, ale udogodnienie stanowią specjalne oprogramowanie do projektowania Nie wymaga denaturacji matrycy, całość reakcji przebiega w stałych warunkach temperaturowych Wydajność amplifikacji jest bardzo wysoka, wyższa niż Real-time PCR LAMP pozwala na znaczące skrócenie czasu analizy (do 1h) LAMP jest mniej wrażliwy na obecność inhibitorów, nie zawsze wymagana jest izolacja DNA Pozwala na amplifikację RNA bez dodawania odwrotnej transkryptazy Produkt uboczny powstający w reakcji LAMP, pirofosforan magnezu, pozwala na obserwację wyniku w świetle UV i widzialnym (analiza turbidymetryczna) Możliwy pomiar ilościowy produktu w czasie rzeczywistym Umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym, co pozwala uniknąć zanieczyszczeń w próbie Zastosowanie zintegrowanej platformy Genie II umożliwia prowadzenie reakcji w czasie rzeczywistym i ilościowe oznaczenie produktu.

Strona22 Bibliografia Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.j BiochemBiophys Methods. 2007 Apr 10;70(3):499-501. Epub 2006 Aug 30. Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.biochembiophys Res Commun. 2001 Nov 23;289(1):150-4. Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA.J BiochemBiophys Methods. 2004 May 31;59(2):145-57. Nagamine K, Hase T, NotomiT.Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, YonekawaT, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63. Parida M, Sannarangaiah S, Dash PK, Rao PV, Morita K.Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.rev Med Virol. 2008 Nov-Dec;18(6):407-21. Strony www: http://www.optigene.co.uk/index.htm http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html http://www.novazym.com Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: info@novazym.com, www.novazym.com