ZMIENNOŚĆ SZCZEPOWA U PRZEMYSŁOWYCH DROŻDŻY PIWOWARSKICH I WINIARSKICH SACCHAROMYCES CEREVISIAE PRZY ZASTOSOWANIU METODY RAPD Anna Misiewicz, Anna Dziełakowska, Agata Goryluk, Sylwia Wróblewska-Kabba INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO Zakład Mikrobiologii, Rakowiecka 36, Warszawa misiewicz@ibprs.pl Streszczenie W obecnej pracy przedstawiono wyniki dotyczące zmienności międzyszczepowej przemysłowych drożdży Saccharomycres cerevisiae obserwowanej po reakcji RAPD. Do reakcji użyto startery OPB-12, OPD-04, OPA-11, OPA-17, Dekamer 11, OPA-D4, OPA-01, OPB 16. Najbardziej różnicującym starterem okazał się starter OPA-04 i OPA-11. Słowa kluczowe: RAPD, identyfikacja drożdży, różnicowanie drożdży Summary 20 brewers strains yeasts by RAPD-PCR method were analyzed. OPB-12, OPD-04, OPA-11, OPA-17, Dekamer 11, OPA-D4, OPA-01, OPB-16 as primers were used. The highest discrimination power had OPA-04 and OPA-11 primer Key words: RAPD, yeasts identification, yeasts differentiation I. WPROWADZENIE Nazwa Saccharomyces została po raz pierwszy użyta przez Meyena w 1838 r. w odniesieniu do drożdży piwowarskich. Od tego czasu prowadzone są stale badania nad właściwą identyfikacją i charakterystyką cech biotechnologicznych drożdży. Historia rodzaju Saccharomyces, ciągłe zmiany w obrębie rodzaju i gatunków są wynikiem poszukiwań odpowiedzi na pytanie o jednoznaczną klasyfikację i identyfikację opartą na pokrewieństwie filogenetycznym, a nie na cechach fenotypowych. Te ciągłe zmiany, pokazują, jak rozwijające się nowe metody identyfikacyjne zmieniają dotychczasowe poglądy na temat klasyfikacji drobnoustrojów. Drożdże są stosowane do produkcji pieczywa, fermentacji piwa, wina czy cydru. Niestety, niektóre gatunki czy szczepy drożdży są także włączone w proces zakażania produktów żywnościowych. Szybki i prosty monitoring badania obecności mikroorganizmów, dróg zakażeń w procesie fermentacji żywności i określenie pozycji taksonomicznej izolatów mikroorganizmów może wpłynąć korzystnie na mikrobiologiczną jakość żywności Sprzyja temu gwałtowny rozwój szybkich technik molekularnych. Drożdże piwowarskie stosowane są do produkcji piwa od tysięcy lat. Po prawidłowo przeprowadzonym procesie fermentacji piwo winno zawierać 0,5-10% wag. alkoholu etylowego, składników goryczkowych chmielu - od 17 do 55 ppm izo-α-kwasów, ok. 0,5% dwutlenku węgla, poniżej 0,1 ppm tlenu oraz małą zawartość cukrów. Do fermentacji stosowane są czyste kultury drożdży Saccharomyces cerevisiae. Ze względu na rożne procesy technologiczne, którym podlegają, dzielimy je na drożdże fermentacji górnej i drożdże fermentacji dolnej. Drożdże fermentacji górnej rozwijają się głównie na powierzchni brzeczki w kadziach fermentacyjnych, drożdże fermentacji dolnej opadają na dno kadzi. Charakterystyka genetyczna, fenotypowa i czystość mikrobiologiczna produkcyjnych szczepów drożdży piwowarskich są czynnikami pozwalającymi uzyskać produkty dobrej jakości. Przemysł spożywczy wymaga w produkcji żywności czystych kultur, aby zapewnić 43
dobrą i niezmienną jakość produktów. Wymaga to ciągłego rozwoju metod różnicowania drożdży, także z wykorzystaniem metod molekularnych. Szczepy dostarczane przemysłowi powinny być scharakteryzowane nie tylko podstawowymi metodami klasycznej mikrobiologii, ale przede wszystkim, metodami biologii molekularnej, pozwalającej w rzeczywisty i obiektywny sposób identyfikować mikroorganizm, a także określić genotypową stabilność cech biotechnologicznych. W ciągu ostatnich 20. lat zostało opracowanych wiele technik opartych na analizie DNA w celu wykrycia i scharakteryzowania mikroorganizmów [Fancelli i wsp. 1998, Freeman 1996]. Technika PCR oparta na procesie amplifikacji in vitro specyficznych fragmentów DNA, w kilku modyfikacjach może służyć do charakterystyki i odróżniania izolatów mikrobiologicznych nawet w obrębie jednego gatunku [Versavaud i wsp. 1995]. Jedna z metod PCR określana jest jako Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) lub Arbitrary Primer PCR (AP-PCR). Metodą tą można sprawdzić pokrewieństwo między szczepami wyizolowanymi z różnych źródeł [James i wsp. 1994, Wernars 1994] lub zróżnicować drożdże wyizolowane z żywności [Baleiras-Couto 1994, Ibeas i wsp. 1996]. Pierwsze udane próby sekwencjonowania, czyli ustalenia kolejności nukleotydów w łańcuchu DNA podjęto w 1965 roku. Wynik sekwencjonowania jest końcowym etapem badań przeprowadzanych w pracowni biologii molekularnej. Wykrywanie nowych genów i ich funkcji jest głównym etapem analizy danych sekwencyjnych. Wraz z nagromadzeniem nowych danych sekwencyjnych, konserwatyzm sekwencji stanie się ostatecznym kryterium identyfikacji genu. Analizy budowy kwasów nukleinowych w połączeniu z tradycyjnymi metodami morfologicznymi i fizjologicznymi są przydatnym narzędziem w odróżnianiu i identyfikacji szczepów. Technika PCR-RAPD została po raz pierwszy zastosowana w 1990 r. przez Williamsa i wsp. Reakcja PCR polegająca na denaturacji matrycy, przyłączaniu starterów i wydłużaniu łańcucha DNA, przeprowadzana jest w określonej liczbie powtórzeń. W technice PCR-RAPD stosowane są pojedyncze, krótkie oligonukleotydy starterowe o długości 5-15 nukleotydów. Starter ten zawierający dowolnie wybraną sekwencję, przyłącza się do obu nici w wielu miejscach, generuje powstanie od kilku do kilkunastu produktów amplifikacji. Metoda RAPD była stosowana do identyfikacji i różnicowania wielu mikroorganizmów. Bardzo obiecujące są jej aplikacje w technologii żywności, a możliwość przechowywania obrazów elektroforetycznych w postaci plików komputerowych umożliwia identyfikacje i różnicowanie szczepów przez porównanie profili elektroforetycznych rozdziału produktów reakcji RAPD. Kariotyping i RAPD okazały się przydatnymi metodami do odróżniania nie tylko typowych szczepów S. cerevisiae i S. pastorianus, lecz także do odróżniania szczepów ale i lager [Tornai-Lehoczki, Dlauchy 1996]. Escheverigaray i wsp. [2000] charakteryzowali handlowe preparaty drożdży winiarskich będące na rynku, aby sprawdzić pokrewieństwo między drożdżami. Badaniom RAPD poddano 16 szczepów stosując 8 starterów, wybranych z 40. Z 93 uzyskanych prążków, 39 (41,3%) było polimorficznych. Po przeprowadzeniu dokładnych analiz okazało się, że wszystkie szczepy mają indywidualne wzory elekroforetyczne. Analiza klasterów wyłoniła 3 grupy. Większość szczepów (11) była w jednej grupie. Technika RAPD jest bardzo dobrą techniką dla różnicowania gatunków Saccharomyces cerevisae, Zygosaccharomyces rouxii. Zastosowanie metody RAPD jako narzędzia taksonomicznego sprawdzono poprzez porównanie danych RAPD z analizą restrykcyjną polimorfizmu rdna różnych izolatów Candida albicans. Wykazano, że ta technika ma siłę dyskryminacyjną na poziomie wewnątrzgatunkowym. Polimorfizm długości chromosomów także jest wykazywany w drożdżach piekarskich i piwowarskich. Petering 44
[1990], Vezinhet i Blondin [2005] wykazali polimorfizm u drożdży winiarskich za pomocą metody kariotypingu i restrykcji mitochondrialnego DNA, mimo to, te techniki nie mogą być proponowane do szerokiego zastosowania w przemyśle, bo są zbyt pracochłonne i złożone w porównaniu z technikami opartymi na technice PCR. Palagyi i wsp. [2004] identyfikowali drożdże wytwarzające astaksantynę metodą RAPD. Z 5. stosowanych starterów, OPC02 okazał się najbardziej przydatny. Analizę numeryczną wykonano za pomocą programu SYNTAX 5.0. Wyniki potwierdziły przydatność metody RAPD do różnicowania międzyszczepowego. Niespodziewanie dla autorów, wzory elektroforetyczne wydzieliły grupy o charakterystycznych cechach. Część drożdży nie wytwarzała zarodników, ale miała zdolność do wytwarzania mutantów oddechowych, a wielkość genomu wynosiła ok. 16Mbp. Stosunkowo wysoka międzyszczepowa różnorodność może być związana z ploidalnością lub aneuploidalnością szczepów drożdży. Izolowane z browarów szczepy drożdży zakażających identyfikowane były jako Candida sake przy pomocy testów API. Aby je zróżnicować, do reakcji RAPD zastosowano startery (GTG) 5 (GAC) 5, (GACA) 4 i M13 (5'-GAG GGT GGC GGT TCT-3'). Wyniki porównano z wynikami kolekcyjnego szczepu CBS 159. Podobieństwo sprawdzone metodą dendrogramów między badanymi szczepami Candida wynosiło tylko 37% [Robak 2002]. Do identyfikacji drożdży wyizolowanych z serów zastosowano technikę PCR-RAPD ze starterami M13 i RF2. Analizy RAPD-PCR dawały wyraźne i jednoznaczne wyniki dla typowych szczepów 42. z 48. drożdży było jednoznacznie zaliczanych do gatunków Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus (anamorf. Candida kefyr), Kluyveromyces lactis (anamorf. Candida sphaerica), Debaryomyces hansenii (anamorf. Candida famata), Yarrowia lipolytica i Torulaspora delbrueckii (anamorf. Candida colliculosa). Metoda może być stosowana w przemyśle mleczarskim [Walczak i wsp. 2007]. Sześćdziesiąt sześć szczepów drożdży wyizolowanych z nektaru różnych gatunków roślin w Europie Środkowej charakteryzowanych było metodą losowo amplifikowanego polimorficznego DNA (RAPD-PCR) oraz sekwencjonowania dużej podjednostki (26S) rdna. Przydatność obu metod do określenia i porównania nieznanych workowców i podstawczaków, została porównana i oceniona. Odtwarzalność RAPD-PCR okazała się niska, a informacja nie była tak precyzyjna, jak osiągnięta przy pomocy analizy sekwencyjnej. Autorzy kwestionują metodę RAPD jako mało przydatną do badań środowiskowych [Herzberg 2002] Brak standardowych, ujednoliconych protokołów dla RAPD-PCR i brak ogólnej bazy danych charakterystycznych prążków czyni niemożliwym identyfikację nieznanych szczepów drożdży lub rozpoznanie nowych gatunków. Gomes i wsp. [2004] podają, że różnicującymi starterami dla drożdży piwowarskich są: OPB-02 TGATCCCTGG, OPB-10: CTGCTGGGAC, OPB-11: GTAGACCGT, OPB-12: CCTTGACGCA, OPB-13: TTCCCCCGCT,OPB-17: AGGGAACGAG, OPB-20: GGACCCTTAC. Metodę RAPD-PCR można zastosować do wykrywania drożdży [Pearson i wsp. 1995, Tsuchiya i Kaneda 1992] i bakterii zakażających piwo [Baleiras-Couto 1994, Motoyama i Ogata 2000, Tompkins i in.1996]. Identyfikacja pojedynczej kolonii mikroorganizmu trwa ok. 10 godzin, czyli znacznie krócej niż oznaczanie metodami tradycyjnymi [Juvonen i Satokari 1999, Tompkins i in. 1996]. Można ją także stosować do identyfikacji drożdży z napojów mlecznych [Wyder i Puchan 1997] Różnicowanie metodą RAPD zarówno na poziomie międzygatunkowym, jak i międzyszczepowym, wskazuje, że kluczową role odgrywają tu właściwie dobrane sekwencje primerów. Fingerprinting PCR z oligonukleotydami (GTG) 5, (GACA) 4 i M13 wydaje się być przydatną metodą do różnicowania drożdży. Rejony przerywnikowe ss rdna i duża podjednostka rdna (ls rdna), tj. wewnętrzny transkrybowany przerywnik (ITS) i przerywnik między klasterami genów rybosomalnych, 45
czyli przerywnik nietranskrybowany (NTS) są bardzo zróżnicowane między i wewnątrzgatunkowo. Można tym tłumaczyć fakt, że oba rejony są konserwatywne w mniejszym stopniu niż rejony rrna, w których jest kilka ewolucyjnych zmian. Sekwencje nukleotydów genów rrna i rejonów przerywnikowych są wykorzystywane do analizowania pokrewieństwa filogenetycznego między prokaryota i eukariota. Ponieważ sekwencjonowanie nukleotydów było jeszcze kilka lat temu pracochłonne i czasochłonne, nie mogło być było wygodnym narzędziem dla przemysłu żywnościowego. Alternatywnie, enzymy restrykcyjne generują wzory restrykcyjne na amplifikowanych rdna rejonach jest to bardziej przydatne. Badania nad S. cerevisiae są bardzo szerokie, z uwagi na ich podstawową rolę w wielu procesach produkcji żywności i napojów. Mikroorganizmy II. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Analizowano 24 szczepy drożdży, tym 22 szczepy drożdży Saccharomyes cerevisiae: 10 piwowarskich fermentacji dolnej, 10 szczepów piwowarskich fermentacji górnej, 2 wzorcowe szczepy winiarskie i 2 wzorcowe szczepy z gatunku Torula casei i Trichosporon fermentans zdeponowane w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS, o następujących numerach KKP: Lp. nazwa gatunkowa nr KKP charakterystyka 1. Saccharomyces cerevisiae 169 fermentacja dolna 2. Saccharomyces cerevisiae 171 ` fermentacja dolna 3. Saccharomyces cerevisiae 172 fermentacja dolna 4. Saccharomyces cerevisiae 181 fermentacja dolna 5. Saccharomyces cerevisiae 183 fermentacja dolna 6. Saccharomyces cerevisiae 189 fermentacja dolna 7. Saccharomyces cerevisiae 192 fermentacja dolna 8. Saccharomyces cerevisiae 205 fermentacja dolna 9. Saccharomyces cerevisiae 201 fermentacja dolna 10. Saccharomyces cerevisiae 203 fermentacja dolna 11. Saccharomyces cerevisiae 199 fermentacja górna 12. Saccharomyces cerevisiae 211 fermentacja górna 13. Saccharomyces cerevisiae 212 fermentacja górna 14. Saccharomyces cerevisiae 213 fermentacja górna 15. Saccharomyces cerevisiae 217 fermentacja górna 16. Saccharomyces cerevisiae 218 fermentacja górna 17. Saccharomyces cerevisiae 219 fermentacja górna 18. Saccharomyces cerevisiae 222 fermentacja górna 19. Saccharomyces cerevisiae 223 fermentacja górna 20. Saccharomyces cerevisiae 225 fermentacja górna 21. Torula casei 313 22. Trichosporon fermentas 317 23. Saccharomyces cerevisiae 39 winiarskie 24. Saccharomyces cerevisiae 12 winiarskie Bufor A (izolacja DNA): - 10% Triton X-100 (2ml) - 10% SDS (1 ml) - 5 M NaCl (200 µl) - 1 M Tris HCl ph 8 (100 µl) 46
- 0,5 M EDTA (20 µl) - sterylna woda destylowana 6,68 ml Bufor TBE 5x stężony (g/0,5 l): - Tris (27 g) - kwas borowy H 3 BO 3 (13,75 g) - 10 ml 0,5 M EDTA - H 2 O dejonizowana do 500 ml - ph 8 Bufor TE (g/l): - 10 mm Tris (12,1 g) - 1mM EDTA (0,372 g) - H 2 O dejonizowana do 1000 ml - ph 8 Standardy DNA i polimerazy podano w tabelach 1 i 2. Tabela. 1 Standardy DNA Nazwa wzorca producent Skócona nazwa Gene Ruler 50bp DNA Fermentas 50bp DNA Ladder Ladder Gene Ruler DNA Ladder, Fermentas LR M Low Range Gene Ruler 100bp DNA Ladder Fermentas 100bp TrackIt 50bp DNA Ladder Invitrogen (50bp) Invitrogen Ideal 700bp-9000bp DNA Gdańsk Ideal 700bp-9000bp DNA Size Standard Biorad Biorad Marker DNA λ / Hind III ( DNA Gdańsk Tabela 2 Polimerazy nazwa polimerazy Yellow Opti Taq Shark 2 producent EURX DNA Gdańsk Odczynniki agaroza (Sigma) alkohol etylowy bromek etydyny (BioRad) EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) 30 mmol, 50 mmol, 100mmol (Sigma) fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), litykaza (Sigma) Aparatura i urządzenia termocykler Px2 (Thermo) amplifikator GeneAmp PCR SYS 2400 (Perkin Elmer) aparaty do elektroforezy SubGell i GT SubGell (BioRad) z zasilaczem (BioRad) 300V, 400mA, 75W 47
Sub Cell GT (Bio-Rad) z zasilaczem Power Pac Basic 300V (Bio-Rad) Wirówka próżniowa (SpeedVac Concentrator) mikroskop świetlny Axiovert 35 (Opton) spektrofotometr DU 600 (Beckman) wirówka z chłodzeniem Centrifuge 5417 R z rotorem stałokątowym 45-30-11 (Carl Zeiss Sp. z o.o.) phmetr (Metler) spektrofotometr (NanoDrop 1000) waga analityczna (RADWAG) wirówka 14 000 rpm (Eppendorf) zestaw do akwizycji obrazów żeli GeneTools (Syngene) i inny podstawowy sprzęt laboratoryjny. Izolacja DNA Drożdże przeszczepiane były z skosu brzeczkowo-agarowego na szalkę Petriego z posiewu redukcyjnego w celu wyodrębnienia pojedynczych kolonii, a następnie, pojedynczą kolonią zaszczepiano 20 ml bulionu brzeczkowego i inkubowano przez 24 godziny w 29 O C w komorze cieplnej ze stałym wytrząsaniem 300rpm. Ze szczepów wyizolowano DNA zgodnie z metodą opisaną przez Davida Amberg (State University of New York, Upstate Medical University, http://www.upstate.edu/biochem/amberg/protocols/yeast_genomic_dna.html). Elektroforeza agarozowa Do rozdziału elektroforetycznego pobierano 10μl próby po reakcji PCR i mieszano z 2,5μl buforu obciążającego (błękit bromofenolowy, sacharoza). Całość mieszaniny nanoszono na 1,5% żelu agarozowy (Sigma) z dodatkiem 4 μl bromku etydyny (Bio-Rad). Żel agarozowy został wykonany z na bazie buforu 0,5x TBE (Tris-HCl, kwas borowy, 0,5M EDTA o ph=8). Elektroforeza przebiegała przy napięciu 100V przez 120 minut w aparacie Sub Cell GT (Bio-Rad) z zasilaczem Power Pac Basic 300V (Bio-Rad). Powstałe prążki były porównywane względem markera wielkości 100bp (Gene Ruler 100bp DNA Lauder, Fermentas). Dzięki zastosowaniu programu MultiAnalyst (BioRad) i Gene Tools (Syngene) określano wielkość otrzymanych fragmentów DNA stosując odpowiednie wzorce masy molekularnej. Zdjęcia archiwizowano. RAPD PCR Dla analizowanych szczepów drożdży przeprowadzono analizę RAPD-PCR. Użyto następujące startery: Tabela 3. Startery do RAPD Lp. Nazwa Sekwencja 1. OPD-04 TCTGGTGAGG 2. OPA-11 CAATCGCCGT 3. OPA-17 GACCGCTTGT 4. Dekamer 11 ACGGTCTTGG 5. OPA-04 AATCGGGCTG 6. OPA-01 CAGGCCCTTC 7. OPB-16 TTTGCCCGGA 48
Warunki temperaturowe dla reakcji amplifikacji: 93ºC-3min; (93ºC-1min, 38ºC-1 min, 72ºC-2 min.) x35,72ºc-5 min.,4ºc-hold. Reakcję amplifikacji wykonano w aparacie Perkin Elmer 2400 (PerkinElmer) oraz Thermo Px2 (Thermo). III. WYNIKI I DYSKUSJA W badaniach zastosowano startery wymienione w Metodyce. Wyniki kolejnych reakcji przedstawiono na prezentowanych poniżej elektroforetogramach. W reakcji amplifikacji ze starterem OPD-04 wyróżniono grupę szczepów, do której należały szczepy KKP 169, KKP 192, KKP 218, KKP 223, KKP 225 i KKP 12. Widoczny był tu podwójny prążek na wysokości ok. 400pz. i dodatkowy ok. 2600pz. U pozostałych szczepów nie zaobserwowano prążka na tej wysokości. Druga grupę stanowiły drożdże KKP 171, KKP 172, KKP 181, KKP 201, KKP 203, KKP 205, KKP 199, KKP 211, KKP 212, KKP 213, KKP 217 i KKP 39 miały dodatkowe prążki powyżej pz. Szczepy KKP 313 i KKP 317 prezentowały produkty amplifikacji odmienne, właściwe dla gatunków Trichosporon fermentans i Torula casei (rys. 1). Invitrogen 169 171 172 181 183 189 192 201 203 205 199 211 212 213 217 218 219 222 223 225 12 39 313 317 Invitrogen 800 800 350 350 Rysunek 1 Wynik reakcji amplifikacji ze starterem OPD-04 Po reakcji ze starterem OPA-11 uzyskano 2 grupy drożdży. Do liczniejszej należało 18 szczepów KKP 171, KKP 172, KKP 181, KKP 183, KKP 189, KKP 192, KKP 201, KKP 199, KKP 211, KKP 212, KKP 213, KKP 217, KKP 218, KKP 219, KKP 223, KKP 225, KKP 12, KKP 395. Inne wzory elektroforetyczne miały KKP 169, KKP 203, KKP 205. W wymienionych grupach obserwowano dodatkowe niewielkie produkty amplifikacji na różnych poziomach. (rys. 2). 49
Invitrogen 169 171 172 181 183 189 192 201 203 205 199 211 212 213 217 218 219 222 223 225 12 39 313 317 Invitrogen 800 800 350 350 Rysunek 2. Wynik reakcji amplifikacji ze starterem OPA 11 Starter OPA-17 zróżnicował badane szczepy na trzy grupy, oprócz zdecydowanie innego położenia prążków u Trichosporon fermentans i Torula casei. Pierwsza grupa zawierała 10 szczepów. Były to: KKP 169, KKP 171, KKP 192, KKP 201, KKP 203, KKP 205, KKP 222, KKP 223, KKP 225 i KKP 12. Do drugiej grupy zaliczono KKP 172, KKP 211, KKP 212, KKP 213, KKP 217 i KKP 218. Do trzeciej grupy wszedł tylko jeden szczep KKP 181. Zarówno KKP 313, jak i KKP 317, miały wzory charakterystyczne dla gatunku, różne od Saccharomyces cerevisiae. 50
9000bp 50bp Invitrogen 169 171 172 181 183 189 192 201 203 205 199 211 212 213 217 218 219 222 223 225 12 39 313 317 Ideal 700bp- 9276 5982 3653 2555 1827 1241 900 800 700 350 Rysunek 3. Wynik reakcji amplifikacji ze starterem OPA- 17 W następnej reakcji, z wykorzystaniem startera Dekamera 11 (rys. 4) uzyskano bardzo czytelny profil. Szczepy KKP 169 i KKP 172 oraz KKP 171 i KKP 181 miały podobne wyniki. Podobieństwo obserwowano u KKP 183, KKP 189, KKP 199, KKP 222 oraz u KKP 192, KKP 201, KKP 203, KKP 205. Grupa kolejną stanowiły szczepy KKP 211, KKP 212, KKP 213, KKP 217, KKP 218, KKP 219, KKP 223, KKP 225, KKP 12, KKP 39. (rys. 4). Prążek na wysokości ok. 800pz może różnicować grupę drożdży fermentacji dolnej od drożdży fermentacji górnej. Dekamer 11 różnicuje szczep KKP 169 od KKP 171 Starter OPA-04 różnicuje wszystkie szczepy oprócz KKP 199 i KKP 211, które mają bardzo zbliżony do siebie wzór. Po dokładnej analizie można stwierdzić, że pozostałe szczepy prezentują osobny dla danego szczepu wzór (rys. 5). Starter OPA 04 będzie najbardziej przydatny w identyfikacji szczepów. 51
Invitrogen 50bp 169 171 172 181 183 189 192 201 203 205 199 211 212 213 217 218 219 222 223 225 12 39 313 317 Biorad 23100 9400 6600 4400 2300 2000 800 600 350 Rysunek 4. Wynik reakcji amplifikacji ze starterem Dekamer 11 Ideal λ/hind III 169 171 172 181 183 189 192 201 203 205 199 211 212 213 217 218 219 222 223 225 12 39 313 317 Ivitrogen Rysunek 5 Wynik reakcji amplifikacji ze starterem OPA-04 Zarówno produkty amplifikacji ze starterem OPA-04 (rys. 5), jak ze starterem OPA-01 (rys. 6) wykazują znaczne zróżnicowanie międzyszczepowe, w obrębie gatunku Saccharomyces cerevisiae. 52
Ideal λ/hind III 169 171 172 181 183 189 192 201 203 205 199 211 212 213 217 218 219 222 223 225 12 39 313 317 Invitrogen 50bp 800 350 Rysunek 6. Wynik reakcji amplifikacji ze starterem OPA 01 53
Tabela4. Zestawienie wyników z podziałem na wyodrębnione grupy. Szczep RAPD primer OPD-04 OPA-11 OPA-17 DEKAMER11 OPA-04 OPA-01 169 A A A A A A 171 B B A B B B 172 B B B A A C 181 B B C B C B 183 - B - C C - 189 - B - C C - 192 A B A D A A 201 B B A D B D 203 B A A D A - 205 B A A D A D 199 B B - C D D 211 B B B E D D 212 B B B E E D 213 B B B E D D 217 B B B E D E 218 A B B E D D 219 - B B E D D 222 - - A C - F 223 A B A E E - 225 A B A E A D 12 A B A E F D 39 B B A E G D 313 C C D F H G 317 D D E G - H Uzyskane wyniki świadczą o dużej zmienności genomu drożdży fermentacji dolnej i górnej w badanym zakresie. Analizując podobieństwa produktów amplifikacji drożdży Saccharomyces cerevisiae wyodrębniono 6 grup. Największą zmienność wykazano stosując startery OPA 01 i OPA 04, gdzie stwierdzono 6 różnych wzorów amplifikacyjnych. Produkty amplifikacji uzyskane ze starterami OPA 17 i Dekametr 11 podzielono kolejno 3 i 5 grup. Najmniejszą zmienność wykazano stosując primer OPA-04 i OPA- 11. Metodyka wykorzystywana w pracach różnicujących/identyfikujących drożdże jest bardzo różna w różnych laboratoriach. Duże znaczenie ma prawidłowy dobór startera, stężenia reagentów, czasu i temperatury. Wynik może być także zależny od metody izolacji DNA, od ilości badanego DNA i stężenia chlorku magnezu. Wśród metod molekularnych różnicujących drożdże, RAPD, jest metodą najprostszą, nie wymaga bowiem znajomości żadnej sekwencji potrzebnej do procesu amplifikacji. RAPD, czyli przypadkowa, losowa amplifikacja jest z powodzeniem stosowana do różnicowania większości mikroorganizmów. Standaryzacja metody i sformalizowanie procedur badawczych pozwoli na zastosowanie jej w laboratorium akredytowanym do badań żywności. 54
IV. WNIOSKI 1. Obserwowana heterogenność wśród szczepów S. cerevisiae uzyskana technikę RAPD zależy od stosowanych starterów. 2. Wszystkie zastosowane startery różnicowały drożdże gatunku Saccharomyces cerevisiae od drożdży Torula casei i Trichosporon fermentans. 3. Najmniejszą siła dyskryminującą miał starter OPD-04 i OPA-11. 4. Starter OPA- 04 różnicuje wszystkie szczepy oprócz KKP 199 i KKP 211, które mają bardzo zbliżony do siebie wzór. Po dokładnej analizie można stwierdzić, że pozostałe szczepy prezentują osobny dla danego szczepu wzór. Starter OPA -04 będzie najbardziej przydatny w identyfikacji szczepów. V. PIŚMIENNICTWO 1. Andrighetto C., E. Psomas, N. Tzanetakis, G. Suzzi and A. Lombardi Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) PCR for the identification of yeasts isolated from dairy products. Lett. Appl. Microbiol. 30 (1) 5 9 2. Baleiras-Couto M.M., van der Vossen J.M.B.M., Hofstra H., Huis in't Veld J.H.J. (1994). RAPD analysis: a rapid technique for differentiation of spoilage yeasts. Intern. J. System. Bacteriol. 24 249-260 3. Escheverigaray S., S. Paese-Toresan, J.L. Carrau: (2000), RAPD marker polymorphism among commercial winery yeast strains, World J. Microbiol. Biotechnol. 16, (2/March) 2000 4. Gomes L. H., Duarte K. M. R., Argueso J. L., Echeverrigaray S., Tavares F. C. A., (2000), Food Microbiol.,17, 217-223. 5. Fancelli S., Castaldini M., Ceccherini M. T., Di Serio C., Fani R., Gallori R., Marangolo M,. Miclaus N., Bazzicalupo M. (1998). Use of random amplified polymorphic DNA markers for the detection of Azospirillum strains in soil microcosmos. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 221-225 6. Freeman S., Katan T., Shabi E. (1996), Characterization of Colleotrichum gloeosporiodes Isolates from Avocado and Almond Fruits with Molecular and Pathogenity Tests. Appl. Environm. Biotechnol. 62 3 1014-1020 7. Ibeas J.I., Lozano I., Perdigones F., Jimenez J. (1996). Detection of Dekkera-Brettanomyces Strains in Sherry by a Nested PCR Method. Appl. Environm. Microbiol. 62 3 998-1003 8. Ibeas J., J. Jimenez (1996), Mitochondrial DNA Loss Caused by Ethanol in Saccharomyces Flor Yeasts, App. Environm.Microbiol.Jan. 1997, p. 7 12 9. James S.A., Collins M.D., Roberts I.N. (1994). The genetic relationship of Lodderomyces elongiosporus to other ascomycete yeast species as revealed by smallsubunit rrna gene sequences. Lett. Appl. Microbiol. 19 308-311 10. Juvonen, R., Satokari, R., Mallison, K. and Haikara, A., (1999), Detection of spoilage bacteria in beer by polymerase chain reaction. J. Am. Soc. Brew. Chem. 57, 99-103. 11. Herzberg M, Fischer R, Titze A. (2002), Conflicting results obtained by RAPD-PCR and large-subunit rdna sequences in determining and comparing yeast strains isolated from flowers: a comparison of two methods. Int J Syst Evol Microbiol. 55
Jul;52(Pt 4):1423-33 12. Motoyama Y., Ogata T. (2000), Detection of Pectinatus spp. by PCR Using 16S-23S rdna Spacer Regions. J. ASBC 58 (1) 4-7 13. Palágyi Z. T., Papp M., Takó, Á., Nagy M., Pesti, C., Vágvölgyi (2004), Genetic variability of astaxanthin-producing yeasts:random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Phaffi a rhodozyma and Xanthopyllomyces dendrorhous. Acta Biol. Szegediensis 48(1-4):35-38 14. Pearson B. P., Carter A.T., Furze J.M., Roberts I.N. (1995), A Novel Approach for Discovering Retrotransposons: Characterization of a Long Terminal Repeat Element in the Spoilage Yeast Pichia membranaefaciens and Its Use in Strain Identification. Inter. J. of System. 45 2 386-389 15. Petering, J., Langridge, P., Henschke, P. (1990), Identification of yeast strains by molecular biology techniques. In Ninth International Oenological Symposium, Cascais, Portugal, pp. 178-199. Breisach, Germany: International Association for Modern Winery Technology and Management 16. Vezinhet F., Blondin B., Hallet J.-N. (2005), Chromosomal DNA patterns and mitochondrial DNA polymorphism as tools for identification of enological strains of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, (5/February), 1990 17. Robak M., Borowska K., Barszczewski W., Wojtatowicz M. (2005), RAPD jako metoda różnicowania i identyfikacji drożdży. Biotechnologia 4(71) 142-155 18. Tompkins T. A., Stewart R., Savard L., Russell I., Dowhanick T. M. 1(996), RAPD- PCR Characterization of Brewery Yeast and Beer Spoilage Bacteria. J. ASBC 54(2) 91-96 19. Tornai-Lehoczky J., Peter G., Dlauchy D., Deak T. (1996), Some remarks on a taxonomic key for the genus Saccharomyces (Vaughan Martini and Martini). Antonie van Leeuwenhoek 69 229-233 20. Tsuchiya Y., Keneda H. (1992). Detection of Beer Spoilage Organisms by Polymerase Chain Reaction Technology. J. ASBC 50(2) 64-67 21. Versavaud A., Courcoux P., Roulland C., Dulau L., Hallet J-N. (1995), Genetic Diversity and Geographical Distribution of Wild Saccharomyces cerevisiae Strains from the Wine-Producing Area of Charentes, France. Appl. Environ. Microbiol. 61 (10) 3521-3529 22. Walczak E., Czaplińska A., Barszczewski W., Wilgosz M., Wojtatowicz M., Robak M.; (2007), RAPD with microsatellite as a tool for differentiation of Candida genus yeasts isolated in brewing. Food Microbiol. 24, (3) 305-312 [8 page(s) (article)] (3/4 p.) 23. Wernars K. (1994), Application of DNA-amplification for detection and typing of food-borne microorganisms in Rapid Meth. a. part 3 24. Wyder M-T., Puhan Z. 1997. A rapid method for identification of yeasts from kefyr at species level. Milchwissenchaft 52(6) 327-329 56