Autoreferat. 1. Imię i nazwisko Marta Fichna. 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe

Autoreferat 1. Imię i nazwisko Marta Fichna 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe 18 czerwca 2003 Dyplom Lekarza studia medyczne ukończone z wyróżnieniem na Wydziale Lekarskim I Akademii Medycznej (obecny Uniwersytet Medyczny) im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 11 grudnia 2008 Dyplom Master of Science w zakresie diagnostyki molekularnej (studia podyplomowe ukończone z wyróżnieniem) na University of Nottingham w Wielkiej Brytanii 18 marca 2009 Dyplom Doktora nauk medycznych (z wyróżnieniem) uzyskany na Wydziale Lekarskim II Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu na podstawie rozprawy zatytułowanej Polimorfizm genu PTPN22 w wybranych chorobach autoimmunologicznych układu dokrewnego Promotor pracy: dr hab. med. Maria Gryczyńska Uzyskane specjalizacje: Choroby wewnętrzne (2011, Centrum Egzaminów Medycznych w Łodzi) Endokrynologia (2015, Centrum Egzaminów Medycznych w Łodzi) 3. Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Katedra i Klinika Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu studia doktoranckie (2004-2009) asystent (2009-2013) ½ etatu adiunkt (2013 do dziś) ½ etatu 1

Zakład Patologii Molekularnej Instytutu Genetyki Człowieka, Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu biolog (2009-2010) ¾ etatu adiunkt (2010 do dziś) ¾ etatu Zakład Immunologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu - asystent (2014-2015) ½ etatu 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) Tytuł osiągnięcia naukowego: Kliniczne, immunologiczne i genetyczne aspekty pierwotnej niedoczynności kory nadnerczy (choroby Addisona) Osiągnięcie naukowe, które przedkładam ubiegając się o uzyskanie stopnia doktora habilitowanego nauk medycznych składa się z pięciu oryginalnych artykułów opublikowanych w recenzowanych czasopismach w latach 2012-2016. Łączna wartość ich współczynnika Impact Factor (IF) wynosi 14,870 (130 punktów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego, MNiSW). Marta Fichna, Magdalena Żurawek, Piotr Fichna, Maria Gryczyńska, Jerzy Nowak, Marek Ruchała. Increased serum osteoprotegerin in patients with primary adrenal insufficiency receiving conventional hydrocortisone substitution. Journal of Physiology and Pharmacology 2012; 63: 677-82. IF 2,804; MNiSW 25 Mój wkład w powstanie tej publikacji obejmował zaprojektowanie badania, dobór odpowiednich pacjentów i zdrowych kontroli do badania, zebranie ich surowic do 2

oznaczeń krążącej osteoprotegeryny i srankl, rejestrację danych klinicznych, wykonanie analiz statystycznych oraz interpretację wyników, napisanie manuskryptu oraz jego poprawki zgodnie z zaleceniami recenzentów. Mój udział oceniam na 75%. Marta Fichna, Piotr Fichna, Maria Gryczyńska, Agata Czarnywojtek, Magdalena Żurawek, Marek Ruchała. Steroid replacement in primary adrenal failure does not appear to affect circulating adipokines. Endocrine 2015; 48(2): 677-85. doi: 10.1007/s12020-014- 0388-6. IF 3,279; MNiSW 25 Mój udział w tej publikacji polegał na zaproponowaniu hipotezy badawczej, przygotowaniu bazy danych pacjentów, udziale w zebraniu surowic, na analizach statystycznych stężeń adipokin (leptyny, adiponektyny i rezystyny) w kontekście pozostałych danych klinicznych i biochemicznych, interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu, a następnie jego modyfikacji po recenzji. Mój wkład oceniam na 75%. Marta Fichna, Magdalena Żurawek, Maria Gryczyńska, Anna Sowińska, Jerzy Nowak, Marek Ruchała. Polymorphic variants of the HSD11B1 gene may be involved in adverse metabolic effects of glucocorticoid replacement therapy in Addison s disease. European Journal of Internal Medicine 2016 Apr 13. pii: S0953-6205(16)30047-4. doi: 10.1016/j.ejim.2016.03.027. IF 2,591; MNiSW 35 Mój wkład w powstanie tego artykułu obejmował przygotowanie projektu badania, zebranie danych oraz meteriału biologicznego od pacjentów, izolację DNA z komórek krwi obwodowej, udział w genotypowaniu polimorfizmów genu dehydrogenazy 11beta- hydroksysteroidowej typu 1 (HSD11B1), interpretację wyników badania, napisanie manuskryptu i jego poprawki zgodnie z uwagami recenzentów. Swój udział oceniam na 80% nakładu pracy koniecznego do powstania tej publikacji. Marta Fichna, Anita Rogowicz- Frontczak, Magdalena Żurawek, Piotr Fichna, Maria Gryczyńska, Dorota Zozulińska- Ziółkiewicz, Marek Ruchała. Positive autoantibodies 3

to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison s disease. Endocrine 2016; 53(1): 249-57. DOI: 10.1007/s12020-016- 0916-7. IF 3,279; MNiSW 25 Mój udział w powstaniu tego artykułu obejmował sformułowanie hipotezy badawczej, dobór pacjentów do badania, zebranie ich danych klinicznych oraz surowic do oceny obecności autoprzeciwciał, analizę przeciwciał ZnT8A w surowicy z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu ELISA, opracowanie statystyczne uzyskanych wyników oraz ich interpretację, przygotowanie manuskryptu i jego redakcję zgodnie z zaleceniami recenzentów. Swój udział oceniam na 80%. Marta Fichna, Magdalena Żurawek, Eirik Bratland, Eystein S Husebye, Anna Kasperlik- Załuska, Barbara Czarnocka, Danuta Januszkiewicz- Lewandowska, Jerzy Nowak. Interleukin- 2 and subunit alpha of its soluble receptor in autoimmune Addison s disease an association study and expression analysis. Autoimmunity 2015; 48(2): 100-7. doi: 10.3109/08916934.2014.976628. IF 2,917, MNiSW 20 Mój wkład tę publikację polegał na zaprojektowaniu badania i przygotowaniu aplikacji grantowej, zainicjowaniu współpracy z Uniwersytetem w Bergen oraz Centrum Medycznym Kształcenia Podyplomowego w Warszawie, zebraniu próbek krwi od pacjentów, udziale w genotypowaniu wariantów genów IL2 i IL2RA, prowadzeniu krótkoterminowych hodowli komórkowych oraz analizie ekspresji obu genów w warunkach podstawowych i po stymulacji, opracowaniu statystycznym i interpretacji wyników, przygotowaniu manuskryptu oraz wprowadzeniu poprawek według wskazówek recenzentów. Swój udział oceniam na 75%. 4

Opis celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Pierwotna niedoczynność kory nadnerczy, zwana również chorobą Addisona (ang. Addison s disease, AD), jest schorzeniem endokrynologicznym stwarzającym zagrożenie dla życia. Pierwotna niewydolność nadnerczy może mieć różną etiologię, m.in. związaną z czynnikami infekcyjnymi (w przebiegu gruźlicy, cytomegalii, grzybic), czy rzadkimi chorobami metabolicznymi (skrobiawica, hemochromatoza), etiologię nowotworową, albo uwarunkowaną genetycznie, jednak współcześnie najczęstszą przyczyną jest autoimmunologiczna destrukcja kory nadnerczy (adrenalitis) [1,2]. Objawy kliniczne AD ujawniają się gdy zniszczone jest ~90% kory nadnerczy. Obejmują one zmęczenie, uczucie wyczerpania, jadłowstręt, utratę masy ciała, nudności, wymioty, bóle brzucha, skurcze mięśni, hipotonię ortostatyczną, łaknienie słonych pokarmów, zaburzenia elektrolitowe (hiponatremię, hiperkaliemię z towarzyszącą kwasicą metaboliczną) oraz charakterystyczną hiperpigmentację skóry i błon śluzowych wywołaną nadprodukcją proopiomelanokortyny, prekursora dla hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) oraz melanotropowego (MSH) [1,3]. Jedynym sposobem leczenia AD jest regularna substytucja hormonów kory nadnerczy: glikokortykosteroidów, mineralokortykosteroidów i opcjonalnie, androgenów nadnerczowych. Jednakże podawanie egzogennych steroidów nigdy nie jest fizjologiczne, a pacjenci mają krótszą przewidywaną długość życia i gorszą jego jakość [2,4,5]. Nawet biorąc pod uwagę niedawno wprowadzone preparaty hydrokortyzonu (HC) o zmodyfikowanym uwalnianiu, które pozwalają lepiej naśladować naturalny rytm dobowy wydzielania kortyzolu, zawsze pozostaje problem indywidualnego doboru odpowiedniej dawki dla utrzymania prawidłowej ekspozycji na kortyzol [6]. Jak oszacowano w oparciu o metodę rozcieńczeń stabilnego izotopu i spektrometrii masowej, fizjologiczna produkcja kortyzolu u osób zdrowych waha się między 5-10mg/m 2 powierzchni ciała [7]. Uwzględniając biodostępność oraz efekt pierwszego przejścia przez wątrobę, odpowiada to dawce substytucyjnej 10-12mg HC/m 2 (około 15-25mg na dobę), a zatem znacznie mniejszej niż dawniej zalecane schematy substytucji steroidowej. Jednakże w przypadku niedostatecznego zaopatrzenia w steroidy pacjenci zagrożeni są potencjalnie śmiertelnym przełomem nadnerczowym, zwłaszcza w okolicznościach ostrych towarzyszących chorób, zabiegów chirurgicznych, 5

oraz innych zdarzeń związanych ze stresem. Ryzyko przełomu nadnerczowego jest szczególnie wysokie u osób z pierwotną niedoczynnością nadnerczy oraz współistniejącymi dodatkowymi schorzeniami [5,8]. Z drugiej strony nawet nieznaczny przewlekły nadmiar glikokortykosteroidów może prowadzić do poważnych objawów niepożądanych w postaci nietolerancji glukozy, dyslipidemii, otyłości trzewnej i przyspieszonej utraty masy kostnej [2,9,10]. Metaboliczne efekty nieadekwatnego leczenia steroidami przyczyniają się do zwiększonej chorobowości i śmiertelności z przyczyn naczyniowo- sercowych wśród pacjentów z AD, opisywanej niedawno w oparciu o dane ze szwedzkich rejestrów medycznych [11,12]. Dodatkowo osoby z autoimmunologiczną AD prezentują wyjątkową skłonność do rozwoju kolejnych zaburzeń autoimmunologicznych, szczególnie chorób narządowo swoistych, jak autoimmunologiczna choroba tarczycy (ang. autoimmune thyroid disease, AITD), cukrzyca typu 1 (ang. type 1 diabetes, T1D), niedokrwistość złośliwa, czy przedwczesna niewydolność jajników (ang. premature ovarian failure, POI). Częstość współwystępowania schorzeń autoimmunologicznych przekracza 50% pacjentów z AD, a może nawet sięgać 80%, jeśli uwzględnić przypadki subkliniczne [13,14]. Typowe kombinacje chorób są klasyfikowane w odrębne autoimmunologiczne zespoły wielogruczołowe (ang. autoimmune polyendocrine syndrome, APS), stanowiące poważne wyzwanie podczas terapii AD [2,15]. Przykładowo, pacjenci z AD i nadczynnością tarczycy w przebiegu choroby Graves- Basedowa są zagrożeni przełomem nadnerczowym z powodu nasilonego klirensu kortyzolu, zatem ich zapotrzebowanie na steroidy jest zwiększone [16]. AD nakładająca się na wcześniej istniejącą T1D manifestuje się nawracającymi epizodami hipoglikemii w związku z osłabieniem glukoneogenezy i nasileniem wrażliwości na insulinę w warunkach niedoboru glikokortykosteroidów[17]. Z kolei standardowa suplementacja glikokortykosteroidowa może zaburzać kontrolę glikemii w cukrzycy w okresach nadmiaru egzogennych steroidów [18]. Dane oparte na rejestrach wykazują zwiększoną śmiertelność pacjentów z AD i cukrzycą w porównaniu z osobami obarczonymi jedynie niewydolnością nadnerczy [11]. Ponadto u chorych z AD, objawy zaburzeń wchłaniania związane ze współistnieniem celiakii, bywają interpretowane jako gastroenterologiczne przejawy niedostatecznego dawkowania glikokortykosteroidów [19]. Z kolei pewne zaburzenia obserwowane na początku AD mogą być fałszywie przypisywane współistniejącym schorzeniom. Niewielki wzrost stężenia TSH w surowicy może po prostu odzwierciedlać 6

brak supresyjnego działania glikokortykosteroidów, a niekoniecznie świadczyć o rozwoju niedoczynności tarczycy spowodowanej przewlekłym autoimmunologicznym zapaleniem. Zaburzenia miesiączkowania u kobiet z nowo rozpoznaną AD mogą ustąpić po wprowadzeniu właściwej substytucji hormonów kory nadnerczy, nie dowodząc od razu współistnienia POI [1,3]. W końcu, dodatkowe zaburzenia autoimmunologiczne, jak dysfunkcja tarczycy, hipogonadyzm, czy choroba trzewna, mogą dodatkowo zwiększać ryzyko utraty gęstości mineralnej kości, co stanowi kolejny częsty problem u pacjentów z AD [20-22]. W zgodzie z obserwowanym ogólnoświatowym zwiększeniem częstości schorzeń autoimmunologicznych, opisywano także wzrost częstości występowania AD [23,24]. Jednakże mechanizmy związane z patogenezą autoimmunizacji nadnerczowej pozostają w dużej mierze nieznane. Uważa się, że znaczenie mają sprzyjające tło genetyczne wraz z endogennymi czynnikami immunologicznymi oraz niezdefiniowanymi czynnikami spustowymi ze środowiska [25]. Istnieje kilkanaście rzadkich zespołów uwarunkowanych genetycznie, których obraz kliniczny zawiera pierwotną niedoczynność nadnerczy, jak np. adrenoleukodystrofia sprzężona z chromosomem X, wrodzony niedorozwój nadnerczy, choroba Wolmana, czy kilka postaci zespołów niewrażliwości na ACTH [26]. Ponadto różne formy wrodzonego przerostu nadnerczy spowodowane autosomalnymi recesywnymi blokami enzymatycznymi steroidogenezy, charakteryzują się niedostateczną syntezą kortyzolu. W przeciwieństwie do powyższych uwarunkowanych monogenowo schorzeń, autoimmunologiczna AD jest wyjątkowo dziedziczona zgodnie z wzorcami Mendlowskimi. Przykładem jest rzadki APS typu 1, wynikający z dziedziczonej autosomalnie recesywnie mutacji immunoregulatorowego genu AIRE i przejawiający się typowo AD w połączeniu z niedoczynnością przytarczyc i/lub nawracającą grzybicą skórno- śluzówkową [27]. Większość przypadków autoimmunologicznej AD jest jednak unikalna w rodzinach, choć krewni tych osób często chorują na różne inne zaburzenia autoimmunologiczne. Opisana ostatnio analiza sprzężeń przeprowadzona w 23 wielopokoleniowych rodzinach z >1 przypadkiem AD zebranych w Wielkiej Brytanii i Norwegii wskazała prawdopodobne nowe locus podatności na ramieniu długim chromosomu 18, obejmujące gen NFATC1 (nuclear factor of activated T- cells, cytoplasmic, calcineurin- dependent 1), kodujący czynnik transkrypcyjny ulegający ekspresji w korze nadnerczy [28]. Jednakże większość genów zasocjowanych z AD 7

została zidentyfikowana poprzez badania funkcjonalnie prawdopodobnych kandydatów. Częstość występowania AD oceniana na 60-140/milion, uniemożliwia prowadzenie liczebnych analiz w obrębie jednej populacji. Lokalne, czy nawet narodowe zbiory danych i próbek od pacjentów są zbyt małe, aby zapewnić moc badania wystarczającą do wykrycia wariantów genetycznych o mniejszym wpływie. Ostatnia próba skanowania całego genomu (ang. genome- wide association scan, GWAS) w poszukiwaniu nowych loci związanych z AD nie powiodła się ze względu na genetyczną heterogenność grup badanych z kilku europejskich krajów, których nie można było połączyć w jedną serię [29]. Najsilniejszą znaną asocjacją z autoimmunologicznym AD pozostają haplotypy głównego układu zgodności tkankowej (ang. Major Histocompatibility Complex, MHC) DRB1*03- DQA1*0501- DQB1*0201 (DR3/DQ2) oraz DRB1*0404- DQA1*0301- DQB1*0302 (DR4.4/DQ8) potwierdzone w wielu populacjach [30-32]. W obrębie kompleksu MHC wykazano też związek pomiędzy AD i allelem 5.1 nieklasycznej cząsteczki MHC, MIC- A (ang. MHC class I chain- related A) [31,32]. Pozostałe poznane geny zasocjowane z AD obejmują CIITA, CTLA4, PTPN22, CYP27B1, CLEC16A, NLRP1, STAT4, GATA3 oraz PD- L1 (CD274) i wszystkie są zaangażowane w odpowiedź immunologiczną [29,33-41]. Większość z tych genów jest związana z czynnością komórek T (CTLA4, PTPN22, STAT4, GATA3, PD- L1), a część z nich odgrywa rolę w mechanizmach odporności nieswoistej (CLEC16A, NLRP1). Ich polimorficzne warianty przyczyniają się do zwiększonego ryzyka AD, ale niektóre - CTLA4, PTPN22, CYP27B1 i PD- L1 wiążą się również z podatnością na inne choroby autoimmunologiczne układu dokrewnego, także w populacji polskiej [37,41,42,43]. Pomimo postępu badań genetycznych, które wskazują na związek genów regulacji immunologicznej z AD, bardzo mało wiadomo o procesie immunologicznej destrukcji kory nadnerczy. Podczas rozwoju autoimmunologicznej AD komórki produkujące hormony steroidowe są stopniowo zastępowane przez tkankę łączną, co prowadzi do zaniku gruczołów i ich czynnościowego regresu. W początkowych etapach obraz histologiczny jest zdominowany przez rozlane nacieki zapalne złożone z limfocytów, komórek plazmatycznych oraz makrofagów [44]. W testach migracji i proliferacji obwodowe limfocyty T pacjentów z AD wykazują reaktywność względem homogenatów kory nadnerczy [45,46]. Donoszono również o zaburzonej aktywności supresorowej komórek T regulatorowych CD4+CD25+ u osób z APS typu 2, natomiast nie 8

obserwowano tego zjawiska u pacjentów z izolowaną AD [47]. Nieuprawnione przeżycie autoreaktywnych limfocytów T w APS typu 2 może być również promowane poprzez obniżoną ekspresję kaspazy- 3, mediatora indukowanej aktywacją śmierci komórek [48]. Ponadto w AD wykazano zjawisko reaktywności komórkowej skierowanej przeciwko 21- hydroksylazie, potwierdzonej proliferacją komórek T oraz wydzielaniem interferonu gamma w odpowiedzi na peptydy pochodne tego antygenu nadnerczowego [49,50]. W przeciwieństwie do nadal słabo poznanej autoimmunizacji komórkowej, autoreaktywna odpowiedź humoralna w AD została dobrze zbadana. Autoprzeciwciała przeciwko ekstraktom kory nadnerczy były po raz pierwszy wykryte za pomocą testu wiązania dopełniacza sześćdziesiąt lat temu [51]. Następnie technika immunofluorescencji pośredniej na skrawkach nadnerczy potwierdziła obecność w surowicy autoprzeciwciał przeciwko antygenom mikrosomalnym wspólnym dla trzech warstw kory nadnerczy [52]. Współcześnie oznaczenia przeciwciał przeciwko komórkom kory nadnerczy (ang. adrenal cortex autoantibodes, ACA) oraz enzymom swoistym dla tkanek steroidogennych, 21- hydroksylazie i rzadziej, 17alfa- hydroksylazie oraz enzymowi odcinającemu łańcuch boczny cholesterolu znajdują zastosowanie w diagnostyce AD i są uznawane za wczesną oznakę choroby [53,54]. Najprawdopodobniej autoprzeciwciała nie odgrywają bezpośredniej roli w patogenezie schorzenia i są zjawiskiem wtórnym do działania limfocytów T zaangażowanych w niszczenie komórek kory nadnerczy, które uwalniają swoje antygeny wewnąrzkomórkowe, w tym enzymy steroidogenezy. Autoprzeciwciała stanowią natomiast cenny marker, wskazujący osoby o podwyższonym ryzyku rozwoju niewydolności nadnerczy, zwłaszcza wśród dzieci [55,56]. U seropozytywnych dorosłych progresja do AD jest szczególnie częsta u pacjentów z subkliniczną niewydolnością nadnerczy, wysokimi mianami ACA oraz stężeniami przeciwciał przeciwko 21- hydroksylazie, ACA wiążącymi dopełniacz oraz HLA- DR3 [56]. W okresie przedklinicznym stężenia przeciwciał przeciw nadnerczowych korelują z ciężkością upośledzenia czynności nadnerczy, choć opisywano także przypadki zaniku przeciwciał i remisji w wczesnych stadiach choroby [57]. Określenie porannego stężenia ACTH, kortyzolu, aldosteronu oraz aktywności reninowej osocza wraz z oceną wydzielania kortyzolu po stymulacji ACTH umożliwia zakwalifikowanie osób seropozytywnych do jednego z pięciu stadiów dysfunkcji kory nadnerczy [58]. Pomimo efektu hamującego steroidogenezę wykazanego w badaniach in vitro, nie udowodniono klinicznie swoistego bloku 21- hydroksylazy przez autoprzeciwciała ani 9

gromadzenia się 17alfa- hydroksyprogesteronu u osób seropozytywnych, w warunkach podstawowych, ani po stymulacji ACTH [59,60]. Większość autoprzeciwciał przeciwko enzymom steroidogenezy należy do izotypu IgG1, co dodatkowo potwierdza dominującą rolę komórek T CD4+ subpopulacji Th1 w destrukcji kory nadnerczy [61]. Komórki CD4+ Th1 są typowymi efektorami podczas infekcji bakteryjnych i wirusowych, wydzielającymi interleukinę- 2 (IL2), interferon gamma i TNFbeta, co stymuluje produkcję IgG1 i IgG3 u ludzi. Donoszono również o wyższych stężeniach chemokin CXCL10 i CXCL11, związanych z odpowiedzią typu Th1, u pacjentów z AD, podczas gdy poziomy chemokin charakterystycznych dla odpowiedzi Th2 były podobne jak u kontroli [62]. W przeciwieństwie do wielu innych schorzeń autoimmunologicznych, brak jest danych o czynnikach środowiskowych sprzyjających wystąpieniu AD. Obserwacje, iż terapia przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby interferonem alfa może indukować występowanie przeciwciał przeciw 21- hydroksylazie nasunęły sugestię roli wirusów jako czynników spustowych autoimmunizacji nadnerczowej [63]. Dodatkowo, wykazano że interferony typu I i III uwalniane podczas infekcji wirusowych działają cytotoksycznie na komórki kory nadnerczy i nasilają wydzielanie przez nie chemokin oraz ekspresję cząsteczek MHC klasy I i 21- hydroksylazy [64]. Jednakże badanie analizujące odpowiedź humoralną oraz reakcję komórek T CD8+ przeciwko cytomegalowirusowi (CMV) nie wykazało różnic między osobami z autoimmunologiczną AD i zdrowymi [65]. W rozwoju AD podejrzewano także znaczenie niedoboru witaminy D, ponieważ u pacjentów z APS stwierdzono jej niższe stężenia w surowicy, a polimorfizm genu 1alfa- hydroksylazy (CYP27B1) wiąże się z występowaniem AD [66,37,38]. Dotąd nie badano innych potencjalnych czynników spustowych ze strony środowiska, które mogłyby przyczyniać się do AD. W podsumowaniu, w odniesieniu do AD szczególne znaczenie wydają się mieć trzy główne problemy badawczo- kliniczne: 1. konieczność właściwego leczenia choroby, zapewniającego dostateczne zabezpieczenie steroidowe, a jednocześnie pozwalającego uniknąć jatrogennych efektów niepożądanych, 2. wczesne wykrywanie współistniejących schorzeń autoimmunologicznych, które powinny być właściwie diagnozowane i odpowiednio szybko leczone, 10

3. próby lepszego zrozumienia etiopatologii autoimmunologicznej AD, której dobre poznanie może wspomóc przyszłe projekty badań przesiewowych oraz dać później podstawę dla zaproponowania środków zapobiegawczych w populacjach wysokiego ryzyka. Powyższe problemy zostały podjęte przez mnie w serii pięciu oryginalnych publikacji badawczych, które zgłaszam łącznie jako osiągnięcie naukowe stanowiące podstawę do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego. Jak wspomniano powyżej, terapia substytucyjna glikokortykosteroidami budzi wiele niepokoju związanego z możliwymi efektami ubocznymi w przypadku zastosowania ich nieodpowiednich dawek. Jednym z najlepiej znanych niepożądanych skutków nadmiaru glikokortykosteroidów jest pogorszenie gęstości mineralnej kości (ang. bone mineral density, BMD) prowadzące do osteoporozy, szczególnie w obrębie kości beleczkowej. Badania BMD u leczonych pacjentów z niedoczynnością kory nadnerczy przynoszą jednak sporne wyniki, a ocena markerów obrotu kostnego nie potwierdziła jednoznacznie szkodliwego działania substytucyjnych dawek glikokortykosteroidów, które są znacznie niższe od tych, stosowanych w celach przeciwzapalnych [20-22,67]. Biorąc pod uwagę te kontrowersje, postanowiliśmy zbadać kolejnego uczestnika remodelingu kostnego, jakim jest układ Receptor Activator of Nuclear factor κb (RANK) - RANK Ligand (RANKL) - Osteoprotegeryna (OPG), który nie był nigdy wcześniej oceniany u pacjentów podczas terapii AD. Obserwacje z tego badania zawarliśmy w artykule zatytułowanym Increased serum osteoprotegerin in patients with primary adrenal insufficiency receiving conventional hydrocortisone substitution, który został opublikowany w Journal of Physiology and Pharmacology 2012; 63: 677-82. Cząsteczki RANK ulegają ekspresji na powierzchni prekursorów osteoklastów [68]. RANK jest aktywowany przez ligand RANKL, cytokinę produkowaną przez osteoblasty, śródbłonek oraz aktywowane limfocyty T [69]. Interakcja RANK- RANKL nasila różnicowanie osteoklastów, ich dojrzewanie i przeżycie [68,70]. Efekty biologiczne RANKL są równoważone przez OPG syntetyzowany przez osteoblasty rozpuszczalny receptor, który kompetycyjnie blokuje dostęp RANKL do jego receptora, RANK [70]. Podczas gdy RANKL pozostaje związany przez OPG, upośledzone są fuzja, czynność i przeżycie osteoklastów. Dlatego OPG pozostaje endogennym regulatorem sygnalizacji RANK- RANKL. Według badań in vitro, nierównowaga pomiędzy RANKL i OPG może 11

stanowić kluczowy mechanizm w indukowanej glikokortykosteroidami utracie masy kostnej [71]. Celem naszego projektu była ocena wpływu standardowego leczenia substytucyjnego z użyciem HC na stężenia OPG i RANKL w surowicy chorych z niewydolnością kory nadnerczy w relacji do ich BMD. Badaniem objęto 80 pacjentów oraz 63 zdrowe osoby. U chorych i zdrowych oceniono stężenie OPG, rozpuszczalnego RANKL oraz wykonano analizy biochemiczne. BMD badano u chorych z użyciem techniki dwuwiązkowej absorpcjometrii rentgenowskiej (ang. dual- energy X- ray absorptiometry, DEXA), a jej interpretację oparto na kryteriach WHO dotyczących wskaźnika T. Osteoporoza i osteopenia w odcinku lędźwiowym kręgosłupa zostały stwierdzone odpowiednio u 15,0% i 38,7% pacjentów, podczas gdy w szyjce kości udowej u 6,3% oraz 41,2%. Stężenie OPG w surowicy chorych (3,03 ±0,86 pmol/l) okazało się istotnie wyższe niż u kontroli (2,47 ±1,05 pmol/l, p=0,002). Natomiast stężenia rozpuszczalnego RANKL były zbliżone w obu grupach (502 ±489 vs. 478 ±358 pmol/l, p=0,430). Stężenie OPG rosło wraz z wiekiem (p<0,001) oraz czasem trwania choroby (p=0,001). Nie wykryto natomiast jego związku z dobową dawką HC. Poziom OPG korelował negatywnie z DHEA- S w surowicy (p=0,008), a także z BMD w kręgosłupie lędźwiowym (p<0,001) oraz w szyjce kości udowej (p=0,003). W modelu wielorakiej regresji wiek pacjenta i DHEA- S okazały się najlepszymi predyktorami stężenia OPG (p<0,001), podczas gdy wpływ czasu trwania choroby oraz BMI przestały być istotne statystycznie. Stężenia rozpuszczalnego RANKL korelowały negatywnie z czasem trwania choroby (p=0,029), a pozytywnie jedynie z dawką HC (p=0,018). Doświadczenia na osteoblastach, jak również dane kliniczne z krótkoterminowej terapii systemowej glikokortykosteroidami sugerują ich supresyjny wpływ na OPG [71,72]. Z kolei u pacjentów z zespołem Cushinga donoszono o podwyższonych stężeniach OPG w surowicy [73,74]. Niektórzy autorzy sugerują zatem bimodalne zachowanie OPG w odpowiedzi na nadmiar glikokortykosteroidów: początkowy gwałtowny spadek, który odzwierciedla efekt supresyjny względem osteoblastów, a następnie długotrwały wzrost syntezy OPG dla ochrony kości przed szkodliwym działaniem steroidów [74]. Rzeczywiście, wyższe stężenia OPG są stwierdzane u pacjentów z osteoporozą jako efekt nasilonego obrotu kostnego oraz jako prawdopodobna reakcja kompensująca nadmierną aktywność osteoklastów [75,76]. Dlatego możliwe jest, że to upośledzona BMD u znacznej części naszych chorych z AD przyczynia się do podwyższonych stężeń 12

OPG w tej grupie. Jednakże korelacja między OPG i BMD znikała w modelu regresji wieloczynnikowej oraz po uwzględnieniu wieku. Warto podkreślić, iż w naszym badaniu OPG korelowała negatywnie ze stężeniem DHEA- S w surowicy. Działanie androgenów obniżające poziom OPG było wcześniej wykazywane in vitro oraz potwierdzone klinicznie u mężczyzn z jatrogennym hipogonadyzmem oraz u kobiet z zespołem policystycznych jajników [77-79]. Zatem podwyższone stężenia OPG u naszych chorych mogły także wiązać się z niedoborem androgenów nadnerczowych. Uważa się, że androgeny nadnerczowe odgrywają rolę ochronną względem kości, a niedobór DHEA przyczynia się do zwiększonego ryzyka osteoporozy w przebiegu AD [80]. W przeciwieństwie do OPG, analizy in vitro wskazują iż glikokortykosteroidy nasilają ekspresję RANKL w osteoblastach [71]. Zgodnie z tymi obserwacjami stężenia RANKL w naszym badaniu korelowały z dzienną dawką HC. Ponieważ jest to główny czynnik dojrzewania osteoklastów, można było spodziewać się, że RANKL będzie korelował z nasileniem resorpcji kostnej. Jednakże, pomimo wcześniejszych doniesień, nasze badanie nie wykazało korelacji RANKL z BMD [76,81]. W podsumowaniu, powyższe badanie jest pierwszą próbą oceny efektów terapii substytucyjnej z zastosowaniem HC na stężenie OPG i rozpuszczalnego RANKL w surowicy oraz skorelowania ich z BMD. Podwyższone stężenia OPG wykryte u pacjentów z AD mogą odzwierciedlać kompensacyjną odpowiedź na nasilenie resorpcji kostnej związanej z nadmiarem egzogennych steroidów i/lub wynikać z niedoboru androgenów nadnerczowych. Podczas leczenia substytucyjnego glikokortykosteroidami stężenia RANKL pozostają w zakresie normy i korelują z dobową dawką HC. Moje kolejne badanie w pierwotnej niedoczynności kory nadnerczy, także dotyczące możliwych niepożądanych efektów substytucji glikokortykosteroidowej, miało na celu ocenę stężenia adipokin leptyny, adiponektyny oraz rezystyny w surowicy chorych z AD w trakcie przewlekłej terapii. Niedawne doniesienia szwedzkie oparte o dane z rejestrów systemu opieki zdrowotnej, sugerowały zwiększoną śmiertelność wśród leczonych pacjentów z AD [11,12]. Wzrost śmiertelności wiązał się nie tylko z przypadkami przełomów nadnerczowych, ale również wydawał się mieć statystyczny związek z chorobą niedokrwienną serca oraz udarem mózgu [11,12,82]. Kilka badań u osób z niedoczynnością kory nadnerczy 13

udokumentowało następnie wyższą częstość występowania czynników ryzyka kardiometabolicznego, takich jak otyłość brzuszna, dyslipidemia, czy upośledzona tolerancja glukozy, a zaburzenia te były przypisywane prawdopodobnemu nadmiarowi pobieranych steroidów [9,10]. Powyższe obserwacje zainspirowały mnie do analizy krążących adipokin u pacjentów z AD oraz oceny ich związku z parametrami antropometrycznymi, biochemicznymi i hormonalnymi. Adipokiny są peptydami syntetyzowanymi przez tkankę tłuszczową, które w sposób auto-, para- oraz endokrynny integrują równowagę energetyczną, pobór pożywienia i metabolizm glukozowo- lipidowy. Zaburzone stężenia adopokin są często uznawane za markery chorób kardiometabolicznych [83-85]. Do naszej analizy wybraliśmy leptynę, adiponektynę oraz rezystynę, które podlegają wpływowi glikokortykosteroidów. W skrócie, produkcja leptyny, działającej jako centralny sygnał lipostatyczny, jest stymulowana przez glikokortykosteroidy [86-88]. Większość danych dotyczących adiponektyny, zwiększającego wrażliwość na insulinę białka o działaniu przeciwzapalnym i przeciwaterogennym, dowodzi hamującego efektu glikokortykosteroidów na jej syntezę [88,89]. Z kolei ekspresja rezystyny, prozapalnej adipokiny nazwanej z uwagi na zdolność indukowania insulinooporności u gryzoni, jest nasilana pod wpływem deksametazonu, a jej podwyższone stężenia w surowicy występują w zespole Cushinga, także w przypadkach subklinicznego hiperkortyzolizmu [88,90]. Nasza analiza obejmowała 63 pacjentów oraz 63 zdrowe osoby dobrane płcią, wiekiem i BMI. Średni czas trwania terapii substytucyjnej wynosił 11,0 ±10,4 lat, natomiast średnia dobowa dawka HC wynosiła 24,1 ±5,8mg. Większość pacjentów (81%) otrzymywała też fludrokortyzon, a 19 z nich pobierało dodatkowo 10-25mg DHEA dziennie przez ostatnie 6 miesięcy. Stężenia adipokin w surowicy, profil lipidowy oraz glikemia były oceniane w obu badanych grupach. ACTH, insulina, wskaźnik HOMA- IR, DHEA- S, kortyzolemia oraz 24h wydalanie kortyzolu z moczem określano w grupie chorych. Ponadto, metodą DEXA badano skład masy ciała. Stężenia leptyny i adiponektyny w surowicy były podobne u pacjentów i osób zdrowych (odpowiednio p=0,749 i p=0,389), podczas gdy poziom rezystyny był istotnie niższy u chorych (982 ±386 vs. 1169 ±286 pg/ml, p=0,0002). Jej stężenia słabo korelowały ze współczynnikiem HOMA- IR (ang. Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance) (p=0,048) i okazały się niezależne od innych czynników. Krążąca leptyna pozytywnie 14

korelowała z insulinemią na czczo, HOMA- IR, BMI oraz zawartością tkanki tłuszczowej (p<0,001). W modelu regresji wieloczynnikowej jedynie masa ciała (p=0,017), cholesterol całkowity oraz HDL (p<0,001) okazały się istotnymi predyktorami stężenia adiponektyny. Nie wykryto korelacji pomiędzy badanymi adipokinami a stężeniami kortyzolu ani dobową dawką HC. Zarówno leptyna jak i adiponektyna były negatywnie skorelowane ze stężeniami DHEA- S, jednak żadna z tych korelacji nie przetrwała w analizie regresji wieloczynnikowej. Jakkolwiek analiza post- hoc wykazała, że pacjenci otrzymujący substytucję DHEA prezentowali niższe stężenia obu adipokin (p=0,040 dla leptyny i p=0,017 dla adiponektyny). Supresyjny efekt androgenów, pozostający w zgodzie z danymi z badań in vitro, mógłby również tłumaczyć istotnie wyższe stężenia tych adipokin obserwowane u kobiet zarówno w grupie osób z AD, jak i zdrowych [91]. Podsumowując, nasz badanie nie wykazało patologicznego profilu adipokin u pacjentów z AD leczonych substytucyjnie. Stężenia adipokin u osób chorych prezentowały podobne korelacje do tych opisywanych u zdrowych. Dalsze badania są konieczne dla potwierdzenia i wyjaśnienia zwiększonej śmiertelności z przyczyn naczyniowo- sercowych w przebiegu pierwotnej niewydolności nadnerczy. Substytucja DHEA może obniżać stężenia leptyny i adiponektyny w surowicy, co powinno być brane pod uwagę w aktualnej dyskusji nad możliwymi korzyściami uzupełniania androgenów nadnerczowych u chorych z AD. Artykuł przygotowany na podstawie powyższego badania, zatytułowany Steroid replacement in primary adrenal failure does not appear to affect circulating adipokines opublikowany został w czasopiśmie Endocrine 2015; 48(2): 677-85. doi: 10.1007/s12020-014- 0388-6. Problematykę terapii AD podjęłam także w artykule zatytułowanym Polymorphic variants of the HSD11B1 gene may be involved in adverse metabolic effects of glucocorticoid replacement therapy in Addison s disease i opublikowanym w European Journal of Internal Medicine, 2016; 31: 99-104. doi: 10.1016/j.ejim.2016.03.027. W doniesieniach o zwiększonej częstości zaburzeń tolerancji glukozy, dyslipidemii i otyłości trzewnej u osób leczonych z powodu niedoczynności kory nadnerczy sugerowano związek tych zaburzeń z nieadekwatnym dawkowaniem glikokortykosteroidów [9,10]. Niestety, brak jest sprawdzonych markerów, które 15

ułatwiałyby optymalizację substytucji steroidowej, a dawka glikokortykosteroidów jest zwykle ustalana na podstawie danych klinicznych, obejmujących m.in. informacje o samopoczuciu pacjenta, zmianach jego masy ciała, wartości ciśnienia tętniczego krwi oraz stężeń sodu i potasu w surowicy [92]. Przesłanką do naszego badania były obserwacje, iż pacjenci z AD prezentują zróżnicowane zapotrzebowanie substytucyjne. Dawki HC odpowiednie dla części z nich mogą wywoływać objawy niepożądane u innych, pomimo zbliżonej masy ciała i natężenia codziennej aktywności. To zjawisko można by wyjaśnić faktem, że działanie glikokortykosteroidów w tkankach docelowych jest modulowane poprzez lokalną dostępność aktywnego kortyzolu, uwarunkowaną aktywnością dehydrogenazy 11β- hydroksysteroidowej (11βHSD). Enzym ten występuje w dwóch izoformach, 11βHSD typu 1 i typu 2, kodowanych przez odrębne geny HSD11B1 oraz HSD11B2. Typ 1 11βHSD jest rozpowszechniony w tkankach ssaków, szczególnie w wątrobie, tkance tłuszczowej i ośrodkowym układzie nerwowym, gdzie działa głównie jako ketoreduktaza, odpowiedzialna za regenerację nieaktywnego kortyzonu do kortyzolu [93]. Rzadkie mutacje inaktywujące HSD11B1 są przyczyną niedoboru reduktazy kortyzonu, który objawia się zwiększeniem klirensu kortyzolu i ACTH- zależnym hiperandrogenizmem nadnerczowym [94]. Powszechne polimorficzne warianty HSD11B1 są wiązane z występowaniem składowych zespołu metabolicznego: nadciśnienia, otyłości, insulinooporności oraz cukrzycy typu 2 [95-97]. Wyniki badań czynnościowych wskazują, że polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) genu HSD11B1 mogą wpływać na aktywność transkrypcyjną, a w konsekwencji na ekspresję i aktywność enzymu in vitro oraz in vivo [97,98]. Transgeniczne myszy z nadekspresją Hsd11b1 rozwijają otyłość trzewną, insulinooporną cukrzycę oraz dyslipidemię [99]. W tkance tłuszczowej osób otyłych stwierdzono zwiększoną ekspresję 11βHSD typu 1, skorelowaną ze stopniem otyłości i insulinooporności [100]. Nasze badanie zostało zaplanowane dla oceny wpływu polimorfizmów HSD11B1 na indywidualne zapotrzebowanie na glikokortykosteroidy w leczeniu substytucyjnym oraz na metaboliczne efekty tej terapii. Gdyby warianty HSD11B1 okazały się klinicznie istotne, ich analiza mogłaby wspomagać rutynową opiekę nad chorymi z AD. Badaniem objęliśmy 152 pacjentów z AD leczonych substytucyjnie przynajmniej od roku. Przeprowadziliśmy genotypowanie wybranych polimorfizmów HSD11B1 - rs846910 16

G/A, rs3753519 G/A i rs12086634 T/G oraz oceniliśmy ich możliwy wpływ na parametry antropometryczne, hormonalne i metaboliczne. Stratyfikacja wg genotypów HSD11B1 nie wykazała różnic wieku, czasu trwania choroby, ani pobieranej dawki HC. W analizie porównawczej względem genotypów rs3753519 stwierdzono istotne różnice w BMI (p<0.001), glikemii na czczo (ang. fasting plasma glucose, FPG) (p<0.001) oraz HOMA- IR (p=0.021) między homozygotami typu dzikiego a nosicielami rzadszego allelu, którzy prezentowali wyższe wartości BMI, FPG i HOMA- IR. Jednakże związek z HOMA- IR utracił istotność statystyczną w modelu regresji wieloczynnikowej uwzględniającym wiek, płeć, BMI oraz dawkę HC (p=0.300) oraz po zastosowaniu poprawki Bonferroniego dla testów wielokrotnych. Z kolei homozygoty allelu dzikiego rs12086634 prezentowały wyższe stężenia trójglicerydów (p=0.035), cholesterolu całkowitego (p=0.001) i LDL (p=0.003) w surowicy. Poprawka uwzględniająca wiek, płeć, BMI i stosowaną dawkę HC spowodowała utratę istotności związku rs12086634 z krążącymi trójglicerydami (p=0.061). Całkowity cholesterol okazał się jedyną zmienną, która pozostała istotnie związana z rs12086634 po poprawce Bonferroniego. Nie wykazaliśmy natomiast związku pomiędzy rs846910 a żadną z cech klinicznych ani biochemicznych. W podsumowaniu, wyniki naszego badania sugerują rolę regulatorową wariantów HSD11B1 względem indywidualnej reakcji na glikokortykosteroidy, a zatem ich możliwy wpływ na adekwatność dawek substytucyjnych HC. Na uwagę zasługuje fakt, iż podczas recenzowania naszego manuskryptu, pojawiły się nowe niezależne dane. HSD11B1 został przeanalizowany w niewielkiej grupie węgierskich pacjentów z AD, gdzie potwierdzono związek rs4844880, polimorfizmu który pozostaje w tym samym bloku haplotypowym co rs3753519, z BMI oraz wzrostem masy ciała podczas leczenia glikokrtykosteroidami [101]. Jakkolwiek wyniki węgierskie nie powielają dokładnie naszych obserwacji, powyższe dane dodatkowo wskazują na znaczenie wariantów enzymu w farmakogenetyce niewydolności kory nadnerczy. W przyszłości, molekularna analiza HSD11B1 wraz z genotypowaniem genu receptora glikokortykosteroidów (NR3C1) mogą wspomóc indywidualny dobór dawek substytucyjnych i wskazać pacjentów wymagających szczególnie ścisłego nadzoru. W pracy badawczej skupiałam się także na problemie współistniejących schorzeń autoimmunologicznych, które dotykają pacjentów z AD i mogą poważnie utrudnić ich 17

leczenie. Rozpoczęłam od ogólnej analizy oceniającej częstość występowania różnych chorób autoimmunologicznych oraz ich postaci subklinicznych w naszej grupie pacjentów (opublikowane w Endocrine, 2010). Natomiast ostatnio, we współpracy z Kolegami z Kliniki Chorób Wewnętrznych i Diabetologii oraz Kliniki Diabetologii i Otyłości Wieku Rozwojowego naszej Uczelni, badaliśmy częstość występowania T1D oraz autoprzeciwciał specyficznych dla komórek beta u osób z autoimmunologiczną AD. Badanie obejmowało nie tylko tradycyjne markery autoimmunizacji skierowanej przeciwko komórkom beta, czyli autoprzeciwciała przeciwko insulinie (ang. insulin autoantibodies, IAA), dekarboksylazie kwasu glutaminowego (ang. glutamic acid decarboxylase antibodies, GADA) oraz fosfatazie tyrozynowej (ang. insulinoma- associated protein- 2, IA- 2), ale także niedawno zidentyfikowane przeciwciała przeciwko transporterowi cynkowemu 8 (ang. zinc transporter 8 autoantibodies, ZnT8A), nowemu swoistemu autoantygenowi w T1D [102]. ZnT8A nie były wcześniej badane w klinicznie dobrze zdefiniowanych grupach pacjentów z AD. Postanowiliśmy szczegółowo ocenić ich występowanie względem współistnienia cukrzycy, innych schorzeń autoimmunologicznych oraz innych autoprzeciwciał. Ponadto przeprowadziliśmy genotypowanie wariantu rs13266634 C/T genu SLC30A8 kodującego ZnT8 [103]. W badaniu wzięło udział 140 pacjentów z AD, w wieku 47,5 ±15,0 lat. T1D stwierdziliśmy u 10% z nich, co pokrywa się ze współczesnymi analizami wśród osób z AD z innych populacji europejskich [13]. Średni wiek w momencie rozpoznania T1D wynosił 41,6 ±15,8 lat, a średni czas trwania T1D w momencie badania 5,5 ±3,8 lat. ZnT8A były wykrywalne w surowicy u 8,5%, GADA u 20,0%, IA- 2A u 5,7%, IAA u 1,6% (pomijając pacjentów leczonych insuliną), przeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej u 67,8%, przeciwko tyreoglobulinie u 45,0%, a przeciw receptorowi dla TSH u 7,1% badanych pacjentów z AD. Łącznie, obecność autoprzeciwciał przeciw antygenom komórek beta stwierdziliśmy u 37 (26,4%) pacjentów: u wszystkich osób z T1D, 2 osób z wcześniej rozpoznaną cukrzycą typu 2 (T2D) oraz 21 bez wywiadu obciążonego cukrzycą. GADA pozostawały najczęstszym znaleziskiem, wykrywane u 71,4% osób z T1D, 11,1% z T2D i 14,5% pacjentów z AD bez cukrzycy. ZnT8A okazały się drugim co do częstości markerem autoimmunizacji trzustkowej w T1D u osób z AD (57,1%), wykrywanym też u 3,4% pacjentów bez cukrzycy. 42,9% chorych z T1D wykazywało obecność dwóch swoistości autoprzeciwciał, a dwie osoby z T1D prezentowały reaktywność względem trzech autoantygenów komórek beta. Badanie 18

ZnT8A pozwoliło wykryć autoimmunizację u dwóch (14,3%) pacjentów z T1D, którzy w oparciu wyłącznie o ocenę wcześniej znanych markerów, byliby uznani za osoby z T1D bez autoprzeciwciał. Co ciekawe, pozytywne markery serologiczne autoimmunizacji skierowanej przeciwko komórkom beta stwierdziliśmy u 21 (17,9%) pacjentów z AD bez zdiagnozowanej wcześniejszej cukrzycy. Dalsza diagnostyka wykazała, że troje spośród nich prezentowało upośledzoną tolerancję glukozy, co potwierdziło wysokie ryzyko cukrzycy oraz konieczność ścisłego nadzoru. Podział pacjentów z AD ze względu na obecność lub brak ZnT8A wykazał istotnie wyższą liczbę dodatkowych schorzeń autoimmunologicznych u chorych seropozytywnych (p<0,001). Osoby ZnT8A- pozytywne prezentowały wyższą częstość T1D oraz częstość występowania i stężenia przeciwciał przeciw innym antygenom komórek beta. Genotypowanie polimorfizmu rs13266634 genu SLC30A8 wykazało 66 (47,1%) homozygot CC, 62 (44,3%) heterozygoty oraz 12 (8,6%) homozygot TT wśród 140 chorych z AD. Homozygoty TT prezentowały najwyższą częstość oraz stężenia krążących ZnT8A w porównaniu z osobami o genotypie CT i CC (odpowiednio p=0,006 oraz p=0,002). Analogicznie do wcześniejszych doniesień w T1D, obecność allelu T była związana z wyższym ryzykiem rozwoju ZnT8A w AD (14,0% vs. 6,2%, OR 2,46 [95% CI 1,06-5,72] p=0,032) [103,104]. W podsumowaniu, powyższe badanie wykazało wysoką częstość występowania ZnT8A u pacjentów z autoimmunologiczną AD. ZnT8A wiążą się ze współistnieniem T1D oraz, wspólnie z GADA, mogą wskazywać na ryzyko rozwoju zaburzeń glikemii u osób z AD bez rozpoznanej wcześniej cukrzycy. Ponadto, pozytywne oznaczenia ZnT8A w AD sugerują szczególnie zwiększone ryzyko występowania dodatkowych zaburzeń autoimmunologicznych. W wyniku naszego badania powstał manuskrypt zatytułowany Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison s disease, który opublikowano w czasopiśmie Endocrine 2016; 53(1): 249-57. doi: 10.1007/s12020-016- 0916-7. Poza badaniami klinicznymi, byłam również aktywnie zaangażowana w analizy mające na celu zrozumienie patofizjologii zaburzeń prowadzących do autoimmunologicznej 19

niewydolności kory nadnerczy. W artykule zatytułowanym Interleukin- 2 and subunit alpha of its soluble receptor in autoimmune Addison s disease an association study and expression analysis, który został opublikowany w Autoimmunity 2015; 48(2): 100-7. doi: 10.3109/08916934.2014.976628, opisaliśmy badania dotyczące układu interleukiny- 2 (IL2) w AD. IL2 jest nie tylko czynnikiem wzrostowym dla komórek T, ale także ma krytyczne znaczenie dla rozwoju, proliferacji i homeostazy limfocytów T regulatorowych CD4+CD25+FOXP3 (Tregs), subpopulacji zdolnej do supresji autoreaktywnych komórek T, które uniknęły negatywnej selekcji w grasicy. Myszy z niedoborem IL2 rozwijają letalną uogólnioną autoimmunizację z masywnymi naciekami zapalnymi oraz obecnością wielu autoprzeciwciał [105]. IL2 działa poprzez heterotrimeryczny receptor błonowy, złożony z podjednostek beta i gamma wspólnych dla innych receptorów interleukin, oraz specyficznej podjednostki alfa (IL2Ra, znanej równej jako CD25) nadającej wysokie powinowactwo dla IL2 [106]. Łańcuch alfa ulega konstytutywnej ekspresji na Tregs i pojawia się na aktywowanych komórkach T efektorowych. Podczas aktywacji limfocytów T, rozpuszczalne IL2Ra (sil2ra) są uwalnianie do krążenia z powierzchni komórek na drodze proteolizy. Rzadkie mutacje genu IL2RA u ludzi prowadzą do ciężkiego niedoboru odporności z obfitymi naciekami komórek T oraz objawami autoimmunizacji [107]. Polimorficzne warianty genów IL2 oraz IL2RA są związane z wieloma schorzeniami autoimmunologicznymi, w tym T1D, chorobą Graves- Basedowa, celiakią, stwardnieniem rozsianym i reumatoidalnym zapaleniem stawów [108-111]. Nasze badanie zostało zaprojektowane celem analizy asocjacji między AD a polimorfizmami genów IL2 i IL2RA, oraz jako próba skorelowania genotypów z danymi funkcjonalnymi. U 223 polskich pacjentów z AD rekrutowanych w klinikach endokrynologicznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu oraz w Centrum Medycznym Kształcenia Podyplomowego w Warszawie oraz u 672 zdrowych dawców krwi genotypowaliśmy 6 wariantów: rs6822844 G/T, rs2069762 T/G i rs3136534 A/C w genie IL2, oraz rs11594656 T/A, rs3118470 T/C i rs2104286 A/G w genie IL2RA. Badania czynnościowe obejmowały analizę ekspresji obu genów na poziomie mrna oraz białka w eksponowanych na działanie 21- hydroksylazy hodowanych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (ang. peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 20

pochodzących od 24 pacjentów oraz 18 kontroli, oraz ocenę stężenia interleukin w surowicy 85 chorych i 76 zdrowych kontroli dobranych płcią i wiekiem. Częstość rzadszego allelu C rs3136534 była istotnie niższa wśród pacjentów z AD w porównaniu z kontrolami (30,7% vs. 38,6%; OR 0,71; 95%CI 0,561-0,887; p=0,003). Analogicznie różnił się rozkład genotypów w obu grupach (p=0,005). Nie wykazano natomiast różnic w częstościach genotypów i alleli pozostałych badanych wariantów IL2 ani IL2RA. Jedynie komórki osób z AD reagowały na 21- hydroksylazę zwiększeniem mrna dla IL2 oraz IL2RA (odpowiednio p=0,004 oraz p=0,009 względem kontroli), któremu odpowiadał wzrost stężenia obu cytokin z supernatancie (p=0,031 oraz p=0,001 względem kontroli). Poziom mrna IL2 w PBMCs od osób z AD stymulowanych 21- hydroksylazą korelował negatywnie z wiekiem pacjentów (p=0,036) oraz pozytywnie ze stężeniem autoprzeciwciał przeciw 21- hydroksylazie w ich surowicy (p=0,006). Nie stwierdzono różnic w ekspresji IL2 mrna po stratyfikacji względem SNP tego genu, natomiast nosiciele genotypu AA wariantu rs2104286 genu IL2RA demonstrowali wyższe poziomy mrna IL2RA po stymulacji 21- hydroksylazą niż heterozygoty AG (509 ±209 vs. 256 ±169, p=0,022). W zgodzie z powyższym, podstawowe wydzielanie sil2ra przez PBMCs od osób z AD było zasocjowane z genotypem rs2104286 (197 ±103 u nosicieli AA vs. 106 ±67pg/mL u heterozygot AG, p=0,046), a związek ten był jeszcze wyraźniejszy w przypadku wydzielania sil2ra stymulowanego 21- hydroksylazą (293 ±129 vs. 170 ±77 pg/ml, p=0,029). Stężenia IL2 w surowicy chorych z AD były istotnie podwyższone w porównaniu do zdrowych kontroli (4,61 ±4,3 vs. 1,71 ±3,2pg/mL, p<0,001), a osoby z APS prezentowały wyższe stężenia IL2 niż pacjenci z izolowanym AD (4,86 ±4,6 vs. 2,74 ±2,1 pg/ml, p=0,027). Podział według genotypów IL2 rs3136534 nie wykazał różnic w stężeniach IL2. Stężenia sil2ra w surowicy okazały się zbliżone u osób chorych i zdrowych (p=0,885) i nie były związane z genotypami IL2RA. Podsumowując, w powyższym badaniu wykazaliśmy asocjację pomiędzy locus IL2 a autoimmunologiczną AD. Polimorfizm rs313653 był pierwotnie wskazany w badaniu replikacyjnym pierwszego GWAS, gdzie wykryto jego umiarkowany związek z T1D [112]. Jednakże, pomimo poszlak in silico o jego możliwym znaczeniu funkcjonalnym, nasza analiza nie wykryła związku pomiędzy genotypami rs3136534 i syntezą IL2. Z kolei sugerowany wcześniej związek pomiędzy AD oraz IL2RA nie został potwierdzony 21

w naszym badaniu [33]. Wykazaliśmy natomiast korelację między genotypem rs2104286 oraz ekspresją IL2RA, szczególnie w warunkach stymulacji, co pozostaje w zgodzie z doniesieniami dotyczącymi sil2ra w T1D i stwardnieniu rozsianym [109]. Nowsze dane wskazują, iż homozygotyczni nosiciele wariantu ryzyka rs2104286 prezentują upośledzoną odpowiedź na IL2 pomimo normalnej lub nasilonej ekspresji CD25 na naiwnych Tregs [113]. W badaniu potwierdziliśmy, że limfocyty obwodowe osób z autoimmunologicznym AD zawierają komórki wrażliwe na 21- hydroksylazę, zdolne do odpowiedzi zwiększoną syntezą IL2 oraz łańcucha alfa jej receptora, co jest wykrywalne zarówno na poziomie mrna jak i białka. Te obserwacje uzupełniają się z wcześniejszym raportem, opisującym zwiększone uwalnianie interferonu gamma oraz IL2 w odpowiedzi na 21- hydroksylazę i jej pochodne peptydy [114]. Negatywna korelacja między wiekiem dawców PBMCs a intensywnością transkrypcji genu IL2 może być wyjaśniona naturalnym osłabieniem aktywności układu immunologicznego i stopniowym spadkiem syntezy IL2 u osób starszych [115]. Ponadto poziom mrna IL2 w stymulowanych PBMCs istotnie korelował ze stężeniem przeciwciał przeciw 21- hydroksylazie w surowicy chorych. Wcześniej opisywano podobny związek z pomiędzy nasileniem proliferacji PBMCs stymulowanych 21- hydroksylazą a przeciwciałami w surowicy [114]. Nasza analiza wskazuje zasadność prób przekładu wyników badań asocjacyjnych na mechanizmy mogące przyczyniać się do rozwoju choroby, jak na przykład nieprawidłowa sygnalizacja IL2/IL2R, która może prowadzić do zaburzeń czynności limfocytów oraz sprzyjać autoimmunizacji. Pełniejsze badania, obejmujące poszczególne subpopulacje komórkowe, są wskazane celem wyjaśnienia związku pomiędzy zaburzeniem ścieżki IL2/IL2RA a autoimmunizacją nadnerczową. Oryginalne osiągnięcie naukowe oraz możliwe implikacje kliniczne przedstawionej serii artykułów obejmują następujące odkrycia: I. Pacjenci z niewydolnością kory nadnerczy otrzymujący standardową substytucję steroidową wykazują zwiększone stężenie krążącej OPG, które może odzwierciedlać łagodny nadmiar glikokortykosteroidów i związaną z tym nasiloną resorpcję kostną i/lub może wynikać z niedoboru androgenów nadnerczowych, który także stanowi czynnik ryzyka osteoporozy. Chociaż stężenia RANKL rosną proporcjonalnie do dawki HC, pozostają w normalnym zakresie podczas 22