Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 WPŁYW ODGLEBOWEGO WIRUSA BURAKA CUKROWEGO (BEET SOIL-BORNE VIRUS, BSBV) NA PLON I ZAWARTOŚĆ CUKRU RÓŻNYCH ODMIAN BURAKA CUKROWEGO W WARUNKACH POLOWYCH NATASZA BORODYNKO, NATALIA RYMELSKA, BEATA HASIÓW-JAROSZEWSKA, HENRYK POSPIESZNY Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Władysława Węgorka 20, 60-318 Poznań N.Borodynko@ior.poznan.pl I. WSTĘP W latach 2005 2008 przeprowadzone były badania dotyczące występowania w Polsce wirusa nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka (Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV), odglebowego wirusa buraka (Beet soil-borne virus, BSBV) i wirusa Q buraka (Beet virus Q, BVQ). Wykazały one nierównomierny rozkład występowania badanych wirusów: BNYVV najliczniej wykrywano w części zachodniej i południowej kraju, natomiast w Polsce centralnej i północnej w większym nasileniu stwierdzono obecność BSBV i BVQ (Borodynko i Pospieszny 2007). Dotychczas w Polsce badania prowadzone były wyłącznie pod kątem szkodliwości BNYVV powodującego rizomanię, przy czym, jak wykazały badania późniejsze, prowadzono je w warunkach występowania wszystkich trzech wirusów odglebowych występujących w kompleksie z mątwikiem burakowym (Borodynko i Pospieszny 2008.). W doświadczeniach odmianowych stwierdzano negatywny wpływ kompleksu wirusów na wzrost buraków. W warunkach prowokacyjnych osiągano bardzo niskie plony korzeni z hektara (straty plonu sięgające nawet 50%) oraz spadek zawartości cukru w korzeniach (Piszczek i Jeżewska 2004). Objawy jakie obserwowano na zainfekowanych roślinach to żółknięcie blaszek liściowych, ich pokarbowanie oraz tworzenie się brody na korzeniu. Na przekroju poprzecznym przez korzeń widoczna była wyraźna nekrotyzacja wiązek przewodzących. W roku 2006 po raz pierwszy stwierdzono występowanie BSBV w Polsce (Borodynko i wsp. 2006), a w kolejnych latach badań wykazano jego masowe występowanie (Borodynko i Pospieszny 2007). Prowadząc monitoring występowania odglebowych wirusów buraka cukrowego wykazano, że BSBV występuje w Polsce zdecydowanie częściej niż BNYVV. Przy czym, na wszystkich polach gdzie stwierdzano BNYVV występował również BSBV. W latach 2007 2008, na polach, gdzie wcześniej stwierdzono obecność BSBV i brak BNYVV, we współpracy z firmą nasienną KWS Polska Sp z o.o. oraz z British
1250 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 Sugar Overseas (BSO Polska S.A.) założono na terenie Cukrowni Glinojeck doświadczenie odmianowe. Celem prowadzonych doświadczeń była ocena wpływu BSBV na plon buraków cukrowych i zawartość cukru w badanych odmianach. II. MATERIAŁ I METODY W latach 2007 i 2008 na polach, gdzie wcześniej stwierdzono obecność BSBV i brak BNYVV, wykonano w dwóch powtórzeniach doświadczenie odmianowe (w warunkach produkcyjnych), przy czym na jednym polu buraki wysiano po burakach, na drugim po zbożach. W doświadczeniu użyto 6 odmian buraka cukrowego: jedna standardowa, wrażliwa na wirusa rizomanii (ST), jedna z podwójną tolerancją na wirusa rizomanii i mątwika burakowego (Heterodera schachtii) (+N) i cztery odmiany tolerancyjne na wirusa BNYVV (). W okresie wegetacji na polach wykonywano standardowe zabiegi agrotechniczne w uprawie buraka cukrowego oraz zgodnie z zaleceniami ochronę chemiczną roślin przed szkodnikami, chorobami grzybowymi oraz chwastami. Pole nie było nawadniane, co miało miejsce w doświadczeniach wcześniejszych (poletkowych), zakładanych w celu stwierdzenia szkodliwości BNYVV. Pod koniec okresu wegetacji próby zebrano i przekazano do dalszych badań. Do oznaczeń ilościowo-jakościowych pobrano z każdego doświadczenia, z każdego powtórzenia i z każdej odmiany kolejnych 25 buraków. Zebrane korzenie zważono i w celu oznaczenia jakości produkcyjnej soku, wysłano na linię VENEMA w Kutnowskiej Hodowli Buraka Cukrowego w Straszkowie. Z tych samych odmian i kolejnych powtórzeń zbierano po 5 korzeni, bez względu na objawy chorobowe widoczne na liściach, do badań serologicznych i molekularnych, mających na celu potwierdzenie obecności BSBV w roślinach. W sumie przetestowano 18 prób buraków (łącznie 90 korzeni). Ze względu na zbliżone wyniki ze wszystkich powtórzeń wyciągnięto średnią. Pierwszym testem wykonanym w celu potwierdzenia obecności BSBV w badanych próbach był test serologiczny TAS-ELISA, z zastosowaniem komercyjnego zestawu surowicy i konjugatu (DSMZ, Niemcy). Następnym etapem badań było przygotowanie wszystkich testowanych prób do badań molekularnych izolacja całkowitego RNA metodą fenol-chloroform (Sambrook i wsp. 1989) oraz test RT-PCR ze starterami amplifikującymi określony fragmenty sekwencji dla identyfikowanego wirusa, dostępnymi w literaturze (Meunier i wsp. 2003; Lennefors i wsp. 2005). Do syntezy pierwszej nici DNA używano ~1 µg RNA i hybrydyzowano go ze starterem reverse przez 5 minut w 70 C. Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono przez 60 minut w 37 C, przy zastosowaniu odczynników firmy Fermentas. Otrzymane cdna denaturowano przez 3 minuty w 95 C i prowadzono dalej reakcję łańcuchową polimerazy 35 cykli (denaturacja 1 min. w 94 C, dołączanie starterów: 1 min. w 63 lub 51 C w zależności od starterów, wydłużanie nici: 1 min. 30 s w 72 C) stosując odczynniki firmy Fermentas. Reakcję kończono siedmiominutową inkubacją w 72 C. Otrzymane produkty amplifikacji wizualizowano w świetle UV.
Wpływ odglebowego wirusa buraka cukrowego 1251 Produkty reakcji RT-PCR oczyszczano z żelu, następnie klonowano do wektora pgem-t Easy Victor System firmy Promega i hodowano w bakteriach przez noc. Oczyszczone plazmidy sekwencjonowano w Zakładzie Wirusologii i Bakteriologii (Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy) ze starterów hybrydyzujących do wektora (T7 i Sp6), a otrzymane sekwencje porównano z innymi sekwencjami odglebowego wirusa buraka dostępnymi w Banku Genów. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Obserwowane w okresie wegetacji rośliny nie wykazywały żadnych objawów chorobowych, charakterystycznych dla tych powodowanych przez BNYVV (żółknięcie i pokarbowanie blaszek liściowych, nekrotycznego żółknięcia nerwów czy tworzenie brody korzeniowej oraz nekrotyzacji wiązek przewodzących). Obserwowano jedynie niewielkie różnice w pokroju części naziemnej roślin pomiędzy poszczególnymi odmianami. Średni plon korzeni dla odmiany standardowej wyniósł 50 ton z hektara, a dla odmiany o podwójnej tolerancji 60 ton. Dla czterech odmian standardowych plon korzeni wahał się od 52 do 56,8 ton (tab. 1). Średnia dla 6 testowanych odmian wyniosła 54,67 kg, a odchylenia od średniej, dla poszczególnych testowanych odmian przedstawione zostały na wykresie (rys. 1). Podobnie wyliczono i przedstawiono średnią zawartość cukru i średni plon cukru technologicznego (rys. 1). Dane wykazały niewielkie odchylenia od średniej, co może sugerować, że wirus nie wpłynął negatywnie na wzrost roślin testowanych odmian buraków, a wahania w uzyskanych plonach mogą być powodowane cechami odmianowymi. +N ST 60 70 80 90 100 110 120 Zawartość cukru Plon korzeni Technol. plon cukru Content zawartość of sugar cukru plon Crop of korzeni roots Crop technol. of technological plon cukru sugar Rys. 1. Doświadczenie odmianowe w warunkach produkcyjnych w obecności wirusa BSBV w glebie Fig. 1. Experiment with six varieties in the field under condition of BSBV
1252 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 Tabela 1. Doświadczenie odmianowe na polu ze stwierdzoną obecnością wirusa BSBV Table 1. Experiment with six varieties in the field under condition of BSBV Odmiana Variety Plon korzeni t z ha Crop t from ha Zawartość Content [mval/100 g ] Zawartość cukru Content of sugar [%] K Na N-a- NH2 Zawartość cukru technol. Content of technological sugar [%] Plon cukru technologicznego t z ha Crop of technological sugar t from ha Straty cukru w melasie Loss of sugar in molasses [%] +M 60,00 16,69 36,8 2,10 36,8 14,72 8,83 1,97 52,00 17,37 36,5 3,40 26,6 15,46 8,04 1,91 55,20 16,55 39,9 4,70 30,3 14,45 7,97 2,10 53,60 16,41 36,3 2,70 29,5 14,51 7,77 1,91 56,80 15,45 33,7 2,90 26,3 13,66 7,76 1,79 ST 50,40 16,63 39,9 4,50 31,8 14,52 7,32 2,11 Średnia Avarage 54,67 16,52 37,2 3,38 30,2 14,55 7,95 1,97 Odglebowego wirusa buraka, w teście TAS-ELISA wykrywano we wszystkich zainfekowanych próbach z odmiany standardowej, wrażliwej na wirusa rizomanii. W próbach buraków pochodzących z odmian tolerancyjnych z różnych firm nasiennych tylko sporadycznie wykrywano BSBV. Natomiast nie wykrywano wirusa w odmianie o podwójnej tolerancji. W reakcji RT-PCR, startery zaprojektowane przez Meuniera i wsp. (2003) oraz przez Lennefors i wsp. (2005), pozwoliły na potwierdzenie obecności BSBV; otrzymano odpowiednio produkty o wielkościach 399 i 545. Uzyskane sekwencje polskiego izolatu porównane zostały z sekwencjami izolatów niemieckiego, francuskiego i amerykańskiego i wykazały one 98 99% podobieństwa na poziomie nukleotydowym. Spośród 18 przetestowanych prób (90 korzeni buraka) nie znaleziono ani jednej odmiany, w której nie stwierdzano za pomocą testu molekularnego obecności BSBV. Wyniki z dwóch testowanych odmian tolerancyjnych ( i + N) przedstawione zostały na rysunku 2. RT-PCR, metoda dużo czulsza od testu serologicznego pozwoliła na wykrycie wirusa będącego w niskiej koncentracji w roślinie. Otrzymane wyniki mogą wskazywać na fakt, że odmiany tolerancyjne na wirusa BNYVV są również tolerancyjne na BSBV. Wirus wnika do rośliny, ale nie powoduje zaburzeń w jej wzroście, przypuszczalnie, m.in. ze względu na niską koncentrację w roślinie.
Wpływ odglebowego wirusa buraka cukrowego 1253 M K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rys. 2. Elektroforeza produktów mrt-pcr: M marker Hyperladder IV (Bioline), K kontrola negatywna, 1 5 testowane próby (odmiana ), 6 9 testowane próby (odmiana +N) Fig. 2. Electrophoretic mobility of mrt-pcr products: M Hyperladder IV (Bioline), K negative control, 1 5 tested samples (variety ), 6 9 tested samples (variety +N) IV. WNIOSKI 1. Testem ELISA w odmianie tolerancyjnej na BNYVV, sporadycznie wykrywano BSBV. 2. Testem RT-PCR wykrywano BSBV we wszystkich odmianach: wrażliwej i tolerancyjnych, ze wszystkich firm nasiennych. 3. Doświadczenie w warunkach infekcji BSBV nie wykazało dużych różnic we wzroście roślin. 4. Wpływ porażenia roślin buraka przez BSBV na plon był nieznaczny. 5. Niewielkie różnice w pokroju roślin oraz w uzyskanym plonie mogą być powodowane cechami odmianowymi. Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2006 2009 jako projekt badawczy N31001731. Autorzy pracy serdecznie dziękują Panu dr Wacławowi Wiśniewskiemu z firmy KWS Polska, za pomoc w przygotowaniu i prowadzeniu doświadczenia.
1254 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 V. LITERATURA Borodynko N., Pospieszny H. 2007. Identyfikacja i występowanie odglebowych wirusów buraka cukrowego w Polsce. Prog. Plant Protection/Post. Ochrony Roślin 47 (2): 55 61. Borodynko N., Pospieszny H. 2008. Zagrożenie dla buraka cukrowego: wirusy odglebowe czy mątwik buraczany? Prog. Plant Protection/Post. Ochrony Roślin 48 (2): 399 405. Borodynko N., Hasiów B., Pospieszny H. 2006. First Report of Beet soilborne virus in Poland. Plant Dis. 90, s. 112. Lennefors B.L., Savenkov E.I., Mukasa S.B., Valkonen J.P. 2005. Sequence divergence of four soilborne sugarbeet-infecting viruses. Virus Genes 31 (1): 57 64. Meunier A., Schmit J.F., Stas A., Kutluk N., Bragard C. 2003. Multiplex Reverse Transcription- PCR for Simultaneous Detection of Beet Necrotic Yellow Vein Virus, Beet Soilborne virus, and Beet Virus Q and Their Vector Polymyxa betae Keskin on sugar beet. Appl. Environ. Microb. April 2003: 2356 2360. Piszczek J., Jeżewska M. 2004. Rizomania w Polsce w latach 1999 2003. Prog. Plant Protection/Post. Ochrony Roślin 44 (1): 280 285. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd ed. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2344 ss. NATASZA BORODYNKO, NATALIA RYMELSKA, BEATA HASIÓW-JAROSZEWSKA, HENRYK POSPIESZNY HARMFULNESS ASSESSMENT OF BEET SOIL-BORNE VIRUS (BSBV) SUMMARY In 2007 and 2008 experiments with six varieties of sugar beet under conditions of BSBV were carried out. The following varieties were: one rhizomania susceptible, four rhizomania unsusceptible and one rhizomania and Heterodera schachtii unsusceptible varieties. Polyclonal antibodies against BSBV used in TAS-ELISA show a positive reaction only with samples of sugar beet from rhizomania susceptible varieties. In every sample BSBV was detected by RT-PCR with specific primers designed by Meunier and Lennefors. The weight and sugar content in rhizomania susceptible roots was slightly lower than in the other varieties. Probably the differences among tested varieties were caused by the features of varieties. In this work a lack of harmfulness of BSBV was shown. Key words: BNYVV, ELISA, RT-PCR, detection, sugar beet quality, harmfulness