WYSTĘPOWANIE I ZRÓŻNICOWANIE GENÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA OPORNOŚĆ NA TETRACYKLINĘ SZCZEPÓW ENTEROCOCCUS FAECALIS IZOLOWANYCH W REGIONIE GDAŃSKIM.

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 13-17 Tomasz Jarzembowski 1), Aleksandra Dybikowska 2) Maria Dąbrowska-Szponar 1) WYSTĘPOWANIE I ZRÓŻNICOWANIE GENÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA OPORNOŚĆ NA TETRACYKLINĘ SZCZEPÓW ENTEROCOCCUS FAECALIS IZOLOWANYCH W REGIONIE GDAŃSKIM. 1) Katedra Mikrobiologii, Zakład Mikrobiologii Lekarskiej AM w Gdańsku p.o. kierownika: dr M. Dąbrowska-Szponar 2) Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii AM w Gdańsku Kierownik: prof. dr hab. med. A. Hellmann Porównano częstość występowania u E. faecalis genów tet(m) i tet(s) oraz transpozonów Tn916 i Tn5397, na których najczęściej zlokalizowane są powyższe geny. Stwierdzono istotne różnice w częstości występowania transpozonów i genu tet(s) w izolatach klinicznych oraz komensalnych. Filogenetyczna analiza genu tet(m), wykazała podobieństwa genetyczne niezależne od pochodzenia szczepu, co może wskazywać na swobodne rozprzestrzenianie się genu tet(m) pomiędzy szczepami. Powszechne stosowanie antybiotyków prowadzi do selekcji szczepów opornych nie tylko wśród chorobotwórczych bakterii, ale również wśród szczepów uważanych za komensalne. Powstaje w ten sposób rezerwuar genów oporności, który dzięki transferowi może przyczyniać się do gwałtownego wzrostu liczby szczepów opornych. Grupą bakterii pełniąca taką rolę są często paciorkowce kałowe, w tym E. faecalis (10,15). Powyższy mechanizm doprowadził do dramatycznego wzrostu oporności na tetracykliny (2,6). Antybiotyki te, charakteryzujące się szerokim spektrum działania, hamują syntezę białek u bakterii G(+) i G(-) poprzez blokowanie łączenia się trna z podjednostką 30S rybosomów (10). Oporność na tę grupę antybiotyków może być warunkowana przede wszystkim przez dwa główne mechanizmy: blokowanie łączenia się antybiotyku z rybosomem przez białka cytoplazmatyczne zaliczane do 6 klas tet M, tet O, tet B, tet Q, tet S, otra (3, 8, 9, 13) oraz aktywne usuwanie tetracykliny z komórki (7). Trzeci mechanizm, enzymatyczny rozkład antybiotyku, jest bardzo rzadki (11). Obecnie szczepy E. faecalis, oporne na tetracykliny, są izolowane zarówno od ludzi, zwierząt jak i z produktów spożywczych. Wiadomo, że oporność szczepów klinicznych jest najczęściej warunkowana przez geny tet(m) i tet(s) rozprzestrzeniające się wraz z transpozonami Tn916 i Tn5397 (1,5). Natomiast informacje na temat oporności szczepów komensalnych są bardzo ograniczone i oparte z reguły na badaniach fenotypowych (4). Celem niniejszej pracy była identyfikacja genów oporności na tetracykliny u szczepów E. faecalis izolowanych w regionie gdańskim oraz analiza rozprzestrzeniania się genów

14 T. Jarzębowski, A. Dybikowska, M. Dąbrowska-Szponar Nr 1 tet(m) i tet(s) kodowanych na transpozonach Tn5397 i Tn916, na podstawie stopnia podobieństwa sekwencji DNA. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono na 24 szczepach E. faecalis wyizolowanych z kału zdrowych osób oraz 27 szczepach wyizolowanych z różnych próbek materiału klinicznego, jako etiologiczny czynnik zakażenia, od pacjentów hospitalizowanych w jednym ze szpitali Gdańska. Oznaczenie lekowrażliwości szczepów na tetracyklinę przeprowadzono metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z zaleceniami NCCLS. DNA izolowano przy użyciu komercyjnego zestawu A&A Biotechnology, zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Wykorzystując metodę PCR, przy użyciu starterów przedstawionych w tabeli I, identyfikowano geny warunkujące oporność na tetracykliny tet(m) i tet(s). Obecność transpozonów koniugacyjnych w badanej populacji szczepów oznaczono przy pomocy metody PCR, badając odpowiednio geny xis-tn transpozonu Tn916 i tndx transpozonu Tn5397. W skład mieszaniny reakcyjnej, o objętości 50 μl, wchodziło: dntp w końcowym stężeniu 200 µm, 1 jednostka polimerazy DNA Pfu (Fermentas), 20 pmoli każdego z pary starterów (Tabela I) oraz 5 µl matrycy DNA w stężeniu ok. 5 ng/µl. Reakcję PCR przeprowadzono wg następującego protokołu: wstępna denaturacja 3 min 94 C; 35 cykli: denaturacja 1 min 94 C; przyłączanie starterów 1 min w optymalnej temperaturze (Tabela I); wydłużanie 3 min 72 C. Tabela I. Sekwencje starterów użytych w reakcji PCR. Startery Sekwencja 5 3 Tet(M)-2 Tet(M)-3 TetS-fw TetS-rv xis-tn916-1 xis-tn916-2 Tn5397-tndX-1 Tn5397-tndX-2 TGGAGCGATTACAGAATTA GCAGAAATCAGTAGAATTGC GAAAGCTTACTATACAGTAGC AGGAGTATCTACAATATTTAC GCCATGACCTATCTTATA CTAGATTGCGTCCAA ATGATGGGTTGGACAAAGA CTTTGCTCGATAGGCTCTA Temperatura przyłączania starterów Literatura ( C) 52 1 50 2 34 1 54 1 Produkty reakcji PCR rozdzielano w 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny i oglądano w świetle UV. Uzyskane produkty amplifikacji genu tet(m) zostały następnie sekwencjonowane z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych dideoksynukleotydów BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, USA). Produkty reakcji sekwencjonowania rozdzielano w 4-kapilarnym aparacie ABI PRISM 3130. Sekwencjonowanie wykonano w Laboratorium Biotechnologii i Ochrony Środowiska Pomorskiego Parku Naukowo-Technologicznego w Gdyni. Analizę podobieństw przeprowadzono przy użyciu programu Mega 4 (12). Częstość występowania poszczególnych genów oceniono testem χ 2.

Nr 1 Geny oporności na tetracykliny u E. faecalis 15 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W niniejszej pracy badano częstość występowania genów tet(m) i tet(s) oraz obecność transpozonów koniugacyjnych zarówno u szczepów pochodzących z różnych materiałów klinicznych jak i od zdrowych osób. Z danych przedstawionych w tabeli II wynika, że częstość występowania genu tet(m) w szczepach izolowanych z zakażeń jest znacznie niższa w porównaniu do danych piśmiennictwa, gdzie obecność genu tet(m) stwierdza się u około 95% enterokoków (5, 6). Jak wynika z naszych badań, różnice w częstości występowania genu tet(m) w grupie szczepów komensalnych i izolowanych jako czynnik etiologiczny nie były istotne statystycznie. W odniesieniu do genu tet(s) różnica była już wyraźnie widoczna i potwierdzona testem χ 2 (Tabela II). Wśród izolatów klinicznych stwierdzono znacznie wyższą, niż u szczepów komensalnych, częstość występowania transpozonów. Była ona zbliżona do obserwowanej przez innych autorów i wynosiła 82% (1,14). Należy ponadto zauważyć, że u wszystkich szczepów pochodzących z zakażeń, u których występował gen tet(m), wykryto również przynajmniej jeden z transpozonów. Można przypuszczać, że we wszystkich przypadkach gen ten był zlokalizowany na transpozonie. W przypadku 50% szczepów komensalnych nie udało się zidentyfikować żadnego z transpozonów, co może sugerować, że gen tet(m) był zlokalizowany na innym elemencie mobilnym, takim jak na przykład plazmidy (9). Uzyskane wyniki różniły się pod tym względem od doniesień innych autorów. Wykazywali oni związek obecności transpozonu z opornością na tetracykliny również u szczepów niechorobotwórczych, ale również rzadsze występowanie genów tet(m) w tej grupie bakterii (6). Tabela II. Częstość występowania genów tet(m), tet(s) oraz transpozonów koniugacyjnych xis-tn, tnd-x w szczepach izolowanych od osób chorych i zdrowych. Geny Szczepy tet(m tet(s), xis-tn tnd-x Z zakażeń (n=27) 14 (51,8%) 4 (14,8%) 24 (88,9%) 4 (14,8%) Komensalne (n=24) 16 (66,7%) 0 (0%) 12 (50%) 0 (0%) Stwierdzone różnice w częstości występowania badanych genów sugerujące istnienie bariery w rozprzestrzenianiu się oporności na tetracyklinę pomiędzy szczepami enterokoków izolowanych z próbek materiału klinicznego oraz szczepami pochodzącymi od zdrowych osób, skłoniły nas do wykonania analizy podobieństwa sekwencji genu tet(m) Podobnie jak w badaniach innych autorów (6), wśród badanych sekwencji genu tet(m) wyróżniono 4 grupy o wysokim stopniu podobieństwa SGH (sequence homology group) genu tet(m) (Ryc.1). Grupa I i IV obejmowała szczepy pochodzące z materiałów klinicznych oraz szczepy od zdrowych osób, pozbawione badanych transpozonów. Grupę II stanowiły sekwencje stwierdzone wyłącznie u enterokoków pochodzacych z zakażeń. Natomiast w skład grupy III wchodziły sekwencje pochodzące ze szczepów z zakażeń i komensalnych pozbawionych lub posiadających transpozon. Duże podobieństwo pomiędzy genami izolowanymi ze szczepów o różnym pochodzeniu wskazuje na bardzo efektywne rozprzestrzenianie się transpozonu kodującego gen tet(m) w środowisku.

16 T. Jarzębowski, A. Dybikowska, M. Dąbrowska-Szponar Nr 1 Ryc.1. Analiza podobieństwa sekwencji genu tet(m) metodą UPGMA. Zak szczep z zakażeń; Kom szczep komensalny; szczep+tn szczep, u którego wykryto transpozon; SGH (sequence homology group) grupa o wysokiej homologii. Przy gałęziach podano wartości testu boostrap. Ze względu na stosunkowo dużą zmienność badanego genu stwierdzenie wysokiej homologii sekwencji pochodzących ze szczepów o różnych właściwościach epidemiologicznych może świadczyć o swobodnym rozprzestrzenianiu się genu tet(m) pomiędzy szczepami enterokoków. T. Jarzembowski, A. Dybikowska, M. Dąbrowska-Szponar THE PREVALANCE OF TETRACYCLINE RESISTANCE GENES IN CLINICAL AND COMMENSAL STRAINS OF ENTEROCOCCUS FAECALIS ISOLATED IN GDAŃSK. SUMMARY The common use of antibiotics is responsible for selecting of drug resistance not only in pathogenic, clinical bacteria but also in commensal, not pathogenic strains which could cause the rapid dissemination of the resistance to these antibacterial agents. However, information regarding the antibiotic resistance of commensal bacteria is very scarce, and the data is based mostly on phenotypical research. Therefore the use of genotyping methods for detection of tetracycline resistance genes, in commensal and medical isolates of bacteria, is essential, for understnding the spread of antibiotic resistance. In this study 24 commensal and 27 clinical isolates of Enterococcus faecalis has been screened by PCR methods for tet(m), tet(s) genes and Tn916 and Tn5397 transpozons. Subsequently, the tet(m) gene amplicones were sequenced and phylogenetic analysis was performed. We have found that the prevalence of tet(s) gene varied significantly between commensal and clinical strains. Moreover,

Nr 1 Geny oporności na tetracykliny u E. faecalis 17 the frequency of transpozons in clinical isolates was much higher comparing to strains isolated from healthy individuals. The phylogenetic analysis did not show significant differences between clinical and commensal strains but it could suggest that the genetic similarity between these two groups could be favourable factor for broad range spread of tet(m) gene. PIŚMIENNICTWO 1. Agersø Y, Pedersen AG, Aarestrup FM. Identification of Tn5397-like and Tn916-like transposons and diversity of the tetracycline resistance gene tet(m) in enterococci from humans, pigs and poultry. J Antimicrob Chemother 2006; 57: 832 9 2. Aminov RI, Garrigues-Jeanjean N, Mackie RI. Molecular ecology of tetracycline resistance: development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins. Appl Environ Microbiol 2001; 67: 22 32. 3. Burdet V. Purification and characterization of Tet(M), a protein that renders ribosomes resistant to tetracycline. J Biol Chem 1991; 266: 2872 7. 4. Doherty N, Trzcinski K, Pickerill P i inni. Genetic diversity of the tet(m) gene in tetracyclineresistant clonal lineages of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 2979 84. 5. Gevers D, Danielsen M, Huys G, Swings J. Molecular characterization of tet(m) genes in Lactobacillus isolates from different types of fermented dry sausage. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 1270 5. 6. Huys G, D Haene K, Collard JM, Swings J. Prevalence and molecular characterization of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from food. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 1555 62. 7. Levy SB. Active efflux mechanisms for antimicrobial resistance. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 695 703. 8. Manavathu EK, Fernandez CL, Cooperman BS, Taylor DE. Molecular studies on the mechanism of tetracycline resistance mediated by Tet(O). Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 71 7. 9. Roberts MC. Tetracycline resistance determinants: mechanisms of action, regulation of expression, genetic mobility, and distribution. FEMS Microbiol Rev 1996; 19: 1 24. 10. Schnappinger D, Hillen W. Tetracyclines: antibiotic action, uptake, and resistance mechanisms. Arch Microbiol 1996; 165: 359 69. 11. Speer BS, Salyers AA. Novel aerobic tetracycline resistance gene that chemically modifies tetracycline. J Bacteriol 1989; 171:148 53. 12. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 2007; 24: 1596-9. 13. Taylor DE, Chau A. Tetracycline resistance mediated by ribosomal protection. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 1 5. 14. Rice LB. Tn916 family conjugative transposons and dissemination of antimicrobial resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 1871 7. 15. Roberts AP, Davis IJ, Seville L, Villedieu A i inni. Characterization of the ends and target site of a novel tetracycline resistance-encoding conjugative transposon from Enterococcus faecium 664.1H1. J Bacteriol 2006; 188: 4356 61. Otrzymano: 12 II 2008 r. Adres Autora: 80-227 Gdańsk, ul. Do Studzienki 38, Zakład Mikrobiologii Lekarskiej AM w Gdańsku