WYSTĘPOWANIE GENÓW ZJADLIWOŚCI WŚRÓD SZCZEPÓW ENTEROCOCCUS FAECALIS IZOLOWANYCH OD PACJENTÓW I ZE ŚRODOWISKA SZPITALNEGO

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Monika Eliza Łysakowska 1, Janusz Śmigielski 2, Andrzej Denys 1 WYSTĘPOWANIE GENÓW ZJADLIWOŚCI WŚRÓD SZCZEPÓW ENTEROCOCCUS FAECALIS IZOLOWANYCH OD PACJENTÓW I ZE ŚRODOWISKA SZPITALNEGO 1 Zakład Mikrobiologii Lekarskiej i Sanitarnej UM w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. n. med. A. Denys 2 Zakład Informatyki i Statystyki Medycznej UM w Łodzi Kierownik: dr n. med. R. Zajdel Badaniami objęto 161 szczepów Enterococcus faecalis wyizolowanych na terenie oddziałów zabiegowych dwóch łódzkich szpitali. Sprawdzenie obecności genów zjadliwości ujawniło powszechne występowanie genu dla białka powierzchniowego Esp, żelatynazy i proteinazy serynowej, odpowiednio 71,2%, 85,1%, 82,6%. Stwierdzono statystycznie istotne częstsze występowanie szczepów opornych na ampicylinę i posiadających gen esp w porównaniu do szczepów wrażliwych. Bakterie należące do rodzaju Enterococcus sp. coraz częściej wywołują zakażenia szpitalne, co wiąże się z używaniem inwazyjnych procedur leczniczych i diagnostycznych, nieodpowiednim stosowaniem antybiotyków i chemioterapeutyków oraz wzrostem liczby pacjentów charakteryzujących się obniżoną odpornością. Enterokoki wykazują wrodzoną oporność na szereg stosowanych leków i co więcej, łatwo pozyskują oporność w wyniku mutacji bądź nabywania genów oporności (5). Szereg szczepów wykazuje oporność na penicyliny, ciprofloksacynę, oraz wysokie stężenia aminoglikozydów (High Level Aminoglicoside Resistance, HLAR), czy glikopeptydy i linezolid (12). Jednakże oporność na leki nie wyjaśnia w pełni udziału enterokoków w zakażeniach, ponieważ za ich przeważającą część odpowiadają szczepy E. faecalis charakteryzujące się większą lekowrażliwością (14). Sugeruje to wkład w wirulencję enterokoków innych niż oporność na leki składowych, min: substancji agregującej, cytolizyny, białka powierzchniowego Esp, hialuronidazy, metaloproteinaz (żelatynaza i proteinaza serynowa), nadtlenków, czy białek Hsp. Celem podjętych badań było określenie częstości występowania genów zjadliwości wśród szczepów Enterococcus faecalis wyizolowanych na oddziałach dwóch łódzkich szpitali, zbadanie związku pomiędzy ich występowaniem a opornością na ampicylinę oraz możliwego powiązania ich obecności z wywoływanymi objawami. Badania finansowane z grantu MJ i SW nr (W /0150)

2 126 M.E. Łysakowska, J. Śmigielski, A. Denys Nr 2 MATERIAŁ I METODY Przedmiot badania stanowiło 161 szczepów Enterococcus faecalis wyizolowanych w latach z oddziałów zabiegowych dwóch łódzkich szpitali: urologii (66), chirurgii (40), oddziału wewnętrznego (31), laryngologii (11), intensywnej terapii (8) i izby przyjęć (5). Uzyskiwano je z materiału pochodzącego od pacjentów (wymazy z ran-37, mocz-54, żółć-1, krew-1, treść jamy otrzewnej-1, wymazy z gardła-9, pachwin-2, wymazy z cewników-14 i wkłuć centralnych-2), wymazów od personelu szpitala (z rąk, fartuchów, nosa, gardła - 14 szczepów), ze sprzętu medycznego i szpitalnych powierzchni użytkowych (25 szczepów). Przynależność do rodzaju Enterococcus ustalono stosując: posiew na podłoże Columbia Agar (biomerieux) z 5% krwi baraniej, podłoże Enterococcosel Agar (Emapol), przynależność do grupy D wg Lancefield (Slidex-Strep Kit, biomerieux), określenie zdolności bakterii do wytwarzania katalazy, pyrrolidonyloarylamidazy (Lachema). Do gatunku drobnoustroje określano za pomocą testów API 20 Strep (biomerieux). Zdolność bakterii do syntezy cytolizyny stwierdzano przy użyciu podłoża Blood Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi, które inkubowano w temperaturze 37 C przez 24h w warunkach tlenowych (7). Zdolność do ekspresji żelatynazy wykrywano na agarze Todd-Hewitt z dodatkiem 3% żelatyny (7). Oceny wrażliwości bakterii na ampicylinę dokonano metodą mikrorozcieńczeń na płytkach 96-dołkowych wg zaleceń CLSI (6). Posiane płytki inkubowano w 37 przez 24 h. Kontrolę badania stanowił szczep E. faecalis ATCC DNA bakteryjne wyizolowano przy użyciu zestawu do izolacji DNA Bacteria AX (A&A Biotechnology, Polska). Przynależność do gatunku potwierdzono w PCR dla genu ligazy D-alaninowo-D-alanylowej (ddl) (11). Reakcje przeprowadzano w objętości 50 μl w termocyklerze Biometra. Mieszanina reakcyjna zawierała 0,7 U polimerazy SuperTherm (JMR, Syngen), po 600nM odpowiednich starterów (6) (IBB, Warszawa), 4,5 mm MgCl 2 (Qiagen, Syngen), 5 μl buforu PCR i 400μM dntp (Fermentas). Produkty rozdzielano w 7% żelu poliakrylamidowym w buforze TAE i wybarwiano bromkiem etydyny (Sigma). Obecność genów czynników zjadliwości (agg, cyl-l, cyl-s, esp, gele) określano za pomocą procedur opisanych przez Kariyama i wsp (11). Ponadto zastosowano startery dla genu proteinazy serynowej (spre): spra (22 pz) o sekwencji 5 -ccaagtgaatctgttctggtca-3 i sprb (21pz) o sekwencji 5 -ccatggtttcctgtttgctta-3 zaprojektowane w oparciu o sekwencję genu tej metaloproteinazy dostępną pod numerem EF_1817 na stronie Długość produktu amplifikacji wynosiła 842 pz. Mieszanina reakcyjna (25μl) dla czynników zjadliwości zawierała: 0,5 U polimerazy (Hypernova, DNA Gdańsk), po 600nM odpowiednich starterów (IBB, Warszawa), 2 mm MgCl 2 (DNA Gdańsk), 2,5 μl buforu PCR i 400μM dntp (Fermentas). Dla genów gele, esp, agg i spre zastosowano profil reakcji wg Eaton i wsp. (9), dla genów cyl-l i cyl-s wg Semedo i wsp. (19). Produkty reakcji rozdzielano na 1 % żelu agarozowym w buforze 1xTAE, barwiono bromkiem etydyny. Analizę statystyczną zależności pomiędzy występowaniem genów zjadliwości oraz opornością na ampicylinę wykonano za pomocą testów Chi kwadrat Pearsona i Chi^2 NW. WYNIKI Częstość występowania genów zjadliwości i ich ekspresja. Wśród 161 badanych szczepów określonych w reakcji PCR jako E. faecalis u 158 szczepów wykryto

3 Nr 2 Geny zjadliwości E. faecalis 127 jeden lub więcej genów dla czynników zjadliwości. Obecność genów dla podjednostki L cytolizyny stwierdzono u 83 szczepów E. faecalis (52,2%). Większość szczepów posiadała jednocześnie oba geny (n=80), jednakże uzyskano po cztery szczepy prezentujące obecność jednego z nich. Gen agg występował u 62,73% szczepów, a gen dla białka powierzchniowego Esp wykryto u 71,2% szczepów E. faecalis. Jeszcze częściej znajdowanym był gen dla żelatynazy jego obecność potwierdzono u 85,1% badanych szczepów. Gen dla transkrybowanej z tego samego promotora proteinazy serynowej znaleziono u 82,6% szczepów (Tabela I). Tabela I. Typowanie szczepów E. faecalis na podstawie obecności genów zjadliwości. Lp. Genotyp szczepów E. faecalis Liczba szczepów w obrębie genotypu 1. agg (+), cyll (+), cyls (+), esp (+), gel (+), spr (+) agg (-), cyll (-), cyls (-), esp (+), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (-), cyls (-), esp (+), gel (+), spr (+) agg (-), cyll (-), cyls (-), esp (-), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (-), cyls (-), esp (-), gel (+), spr (+) agg (-), cyll (+), cyls (+), esp (+), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (+), cyls (+), esp (+), gel (-), spr (-) 8 8. agg (+), cyll (+), cyls (+), esp (-), gel (+), spr (+) 8 9. agg (-), cyll (+), cyls (+), esp (-), gel (+), spr (+) agg (-), cyll (-), cyls (-), esp (+), gel (-), spr (-) agg (-), cyll (-), cyls (-), esp (-), gel (-), spr (-) agg (+), cyll (+), cyls (+), esp (-), gel (-), spr (-) agg (-), cyll (-), cyls (+), esp (+), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (-), cyls (-), esp (-), gel (-), spr (-) agg (-), cyll (-), cyls (-), esp (+), gel (-), spr (+) agg (+), cyll (+), cyls (+), esp (+), gel (+), spr (-) agg (-), cyll (+), cyls (-), esp (+), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (+), cyls (-), esp (+), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (-), cyls (+), esp (+), gel (+), spr (+) agg (+), cyll (+), cyls (-), esp (-), gel (+), spr (-) agg (+), cyll (+), cyls (-), esp (+), gel (-), spr (-) agg (-), cyll (-), cyls (-), esp (+), gel (+), spr (-) agg (+), cyll (+), cyls (+), esp (-), gel (+), spr (-) agg (-), cyll (+), cyls (+), esp (+), gel (-), spr (-) agg (+), cyll (-), cyls (-), esp (+), gel (+), spr (-) 1 agg- gen substancji agregującej; cyl-l- gen podjednostki większej cytolizyny; cyl-s- gen podjednostki mniejszej cytolizyny; esp- gen białka powierzchniowego Esp; gele- gen żelatynazy; spre gen proteinazy serynowej Zdolność do wytwarzania hemolizy typu ß została stwierdzona u 47 z 84 szczepów E. faecalis posiadających oba geny strukturalne cytolizyny (55,9%). Z 137 szczepów, u których wykryto obecność genu dla żelatynazy, 31 rozkładało żelatynę zawartą w podłożu Todd- Hewitt (22,6%). Wszystkie z tych szczepów posiadały oba badane geny operonu fsr.

4 128 M.E. Łysakowska, J. Śmigielski, A. Denys Nr 2 Występowanie genów zjadliwości a oporność na ampicylinę. Wśród zbadanych izolatów tylko 6,8% było opornych na ampicylinę. Szczepy niewrażliwe cechowały się obecnością 3 lub więcej genów zjadliwości, w tym zawsze genu esp. Związek pomiędzy obecnością genów zjadliwości E. faecalis a ich chorobotwórczością. Wyizolowano 118 szczepów będących etiologicznymi czynnikami zakażeń, a 28 uzyskano w ramach programu nadzoru epidemiologicznego i w czasie izolacji nie można było stwierdzić ich związku z objawami chorobowymi. 61,25% szczepów posiadających oba geny cytolizyny pochodziło z materiału klinicznego. Gen dla substancji agregującej posiadało 49,1% szczepów klinicznych, oraz 51,5% uzyskanych podczas dochodzenia epidemiologicznego. Geny dla białka powierzchniowego Esp wykryto u 113 szczepów - 56,7% z nich pochodziło z materiału klinicznego. Obecność genu gele wykryto u 68,8%, natomiast gen spre odpowiednio u 66,8% szczepów pochodzących od pacjentów (Tabela II). Tabela II. Porównanie częstości występowania genów zjadliwości u E. faecalis z źródłami ich pochodzenia. Materiał Szpital I Liczba szczepów Szpital II Liczba szczepów Geny czynników zjadliwości agg cyll+cyls esp gel spr I II I II I II I II I II Mocz Rany Krew Żółć Treść jamy otrzewnej Dochodzenie epidemiologiczne Wymazy od personelu Wymazy ze środowiska Razem Razem agg- gen substancji agregującej; cyl-l- gen podjednostki większej cytolizyny; cyl-s- gen podjednostki mniejszej cytolizyny; esp- gen białka powierzchniowego Esp; gele- gen żelatynazy; spre gen proteinazy serynowej; I szpital nr I, II- szpital numer II DYSKUSJA Cechą szczepów szpitalnych jest obecność genów wirulencji, rzadziej występującego u szczepów kolonizujących układ pokarmowy zdrowych nosicieli, czy u szczepów izolowanych z żywności (9, 19). Wskazuje się na ich obecność (np. genu esp) jako atrybut szczepów epidemicznych, ale nie niezbędny czynnik w szerzeniu się szczepów. Stwierdzono, że za przypadki epidemii odpowiadają często specyficzne klony (izolowane najczęściej na od-

5 Nr 2 Geny zjadliwości E. faecalis 129 działach intensywnej terapii), np. CC17 (23, 26), czy RENC, posiadające wiele czynników zjadliwości (18). Częstość wykrywania czynników zjadliwości. Wśród badanych izolatów E. faecalis najczęściej stwierdzano obecność wszystkich poszukiwanych genów (26% szczepów). Gen białka substancji agregującej agg wykryto u 62,7% szczepów E. faecalis (n=101). Częstość występowania genu agg okazała się istotnie statystycznie większa u szczepów E. faecalis (p<0,05) w porównaniu do izolatów E. faecium, co jest zgodne z danymi piśmiennictwa (9). Ze względu na udział białka w adherencji można byłoby się spodziewać częstego znajdowania tego genu u szczepów pochodzących z zakażeń układu moczowego (zum) (22, 25). Podobnie jak w innych badaniach (3), 37% szczepów posiadających gen agg uzyskano właśnie z tych infekcji, bądź z wymazów z cewników (n=37). Szczepy agg (+) otrzymywano z wszystkich źródeł niewielka ich liczebność w obrębie grup utrudniła analizę zależności między częstością występowania genów a ich pochodzeniem. Kolejnymi z wykrywanych genów były cyl-l i cyl-s, odpowiadające za wytwarzanie dwóch prekursorów cytolizyny, które następnie są modyfikowane i transportowane na zewnątrz komórek bakteryjnych (19). Ich występowanie zależy od źródła izolacji, np. nie stwierdzono obecności tych genów u izolatów pochodzących od pacjentów z zaburzeniami hematologicznymi (27). W niniejszej pracy najczęściej wykrywano je u szczepów izolowanych z zakażeń ran (n=22; 59,4%) i z moczu (n=26; 48,1%). Wśród 80 szczepów posiadających oba geny 55,9% szczepów syntetyzowało toksynę cytolityczną były wśród nich 24 szczepy z moczu i cewników, 13 szczepów pochodzących z ran. Zgadza się to z rezultatami badań Piekarskiej i wsp., którzy wykazali, że cytolizynę najczęściej syntetyzowały szczepy otrzymane z moczu (47,8%) oraz z wymazów z ran (36,8%) (15), a pozostaje rozbieżne z wynikami wskazującymi, że tylko szczepy izolowane z moczu prezentowały fenotyp Cyl (+) (10). Wydzielanie cytolizyny notowano najczęściej u szczepów klinicznych (do 70% izolatów), natomiast enterokoki pochodzące od zdrowych osób rzadziej cechowały się ich ekspresją (19). W niniejszej pracy potwierdzono te wyniki, bowiem 50% szczepów mających oba geny strukturalne cytolizyny pochodziło z próbek materiału klinicznego. U 68 szczepów E. faecalis stwierdzono jednoczesną obecność genów dla cytolizyny oraz genu substancji agregującej, nie wykazano jednak istnienia zależności istotnej statystycznie, pomimo że sugeruje się wspólny transfer tych genów (20). Następnym z badanych genów było białko powierzchniowe Esp, którego występowanie zostało uznane za silnie skorelowane ze zdolnością E. faecalis do wywoływania zakażeń szpitalnych (9, 13, 17). Gen esp wykrywano z materiałów klinicznych z częstością sięgającą 100%, najczęściej w przypadku epidemii klonalnych, z zakażeń krwi, czy wsierdzia (24), natomiast dane dotyczące izolacji z kału osób zdrowych, od zwierząt hodowlanych lub żywności nie były jednoznaczne (2, 9, 18). W niniejszej pracy wykryto obecność genu esp u 113 z 161 badanych szczepów E. faecalis (70,2%). Odsetek wykrywania genu esp była zbliżona: 56,7% dla szczepów klinicznych, 60,6% dla szczepów izolowanych w ramach programów nadzoru epidemiologicznego, 68% dla szczepów z wymazów środowiskowych i 60% od personelu. W niniejszej pracy wykazano statystycznie istotną zależność między występowaniem genu esp a opornością na ampicylinę, co pozostaje w zgodzie z wcześniejszymi doniesieniami (8). Gen esp został wykryty u wszystkich z 11 szczepów E. faecalis opornych na ampicylinę i u 68% szczepów wrażliwych. Wynik ten może potwierdzać zwiększoną zjadliwość szczepów posiadających gen esp i opornych na ampicylinę. Ponadto stwierdzono istotną

6 130 M.E. Łysakowska, J. Śmigielski, A. Denys Nr 2 statystycznie wyższą częstość występowania genów cyl-l/s i esp łącznie, co może sugerować wspólny ich transfer. Dane na temat częstości izolacji genu żelatynazy (gele) są różnorodne, wskazując na częstą jego obecność u szczepów pochodzących z materiału klinicznego i z żywności, a szczególnie wśród szczepów epidemicznych (1, 4, 9). W niniejszej pracy gen gele znaleziono u większości badanych szczepów E. faecalis (n=137; 85,1%): w tym u 65,2% szczepów uzyskanych z materiałów klinicznych, 93,1% szczepów pochodzących z programów dochodzenia. W porównaniu do innych źródeł (15) gen gele występował częściej u szczepów E. faecalis uzyskanych z moczu (83%) i u szczepów pochodzących z ran (81,1%). W większości przypadków szczepy gel+ posiadały również inne geny zjadliwości (n=139; 86,3%). Pomimo wysokiego odsetka izolacji szczepów gele(+), ekspresja genu była obserwowana tylko u 24 szczepów pochodzących z materiału klinicznego, dwóch izolowanych z cewników, jednego szczepu pochodzącego z wymazu z gardła oraz 9 szczepów wyosobnionych z wymazów środowiskowych. Łączna niewielka liczba izolatów Gel+ (n=36) jest zgodna z wcześniejszymi doniesieniami (16). Analiza statystyczna nie ujawniła związku między występowaniem genu gele a opornością na ampicylinę (p>0,05). Kolejnym z badanych genów był leżący w operonie fsr gen proteinazy serynowej. Jego występowanie jest skorelowane z częstością znajdywania genów dla żelatynazy, co wynika z bezpośredniej lokalizacji obu tych genów w obrębie operonu fsr (21). Łącznie wykryto go u 133 szczepów E. faecalis (82,6%). Zaobserwowano przypadki szczepów posiadających tylko jeden z poszukiwanych genów, gele lub spre (n=6), co może być wynikiem niewielkich zmian w materiale genetycznym uniemożliwiającym wykrycie tych genów za pomocą zastosowanego układu PCR. WNIOSKI Uzyskane w niniejszej pracy wyniki pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków: - wyizolowane z różnych źródeł szczepy E. faecalis wykazywały duże zróżnicowanie pod względem badanych cech genotypowych- dominującymi były szczepy posiadające dwa i więcej genów zjadliwości, co przemawia za ich zwiększoną zjadliwością. - najczęściej wykrywanymi genami były gen gele (85,1%) i spre (82,6%), natomiast najrzadziej obserwowano geny cyll/s występujące u 52,2% szczepów. - zaobserwowano statystycznie istotne częstsze występowanie szczepów esp(+) opornych na ampicylinę w porównaniu do szczepów opornych esp (-), co może sugerować pojawienie się szczepów epidemicznych E. faecalis. - stwierdzono istotnie statystycznie wyższą częstość występowania genów cyl-l/s i esp łącznie, co może sugerować wspólny ich transfer w obrębie wysp patogenności.

7 Nr 2 Geny zjadliwości E. faecalis 131 M. Łysakowska, J. Śmigielski, A. Denys OCCURRENCE OF VIRULENCE GENES AMONG ENTEROCOCCUS FAECALIS STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS AND HOSPITAL ENVIRONMENT SUMMARY The aim of this study was to evaluate occurrence of virulence genes among Enterococcus faecalis strains isolated from two hospitals in Łódź, during The second goal was to determine possible relationship between presence of those genes, resistance to ampicillin and sources of isolation. Enterococcal strains were identified to the species by PCR with ddl primers. All 161 isolates were tested for the presence of aggregation substance gene (agg), cytolisine genes (cyl-l, cyl-s), esp protein gene, gelatinase gene (gele), serine protease gene (spre). Susceptibility to ampicillin was tested by microdillution method. Both cyl-l and cyl-s genes were found in 52,2% of strains, agg gene was present in 62,73% isolates, esp gene in 71,2%. Most frequently found genes were gele (85,1%) and spre (82,6%). The presence of esp gene in isolates resistant to ampicillin was statistically higher than in susceptible strains, what might suggest appearance of epidemic strains. Besides, strains possessing both, cyl-l/s and esp genes, were found to be statistically more often isolated strains than those possessing only single genes. PIŚMIENNICTWO 1. Arciola C, Campoccia D, Baldassari L, i inni. The role of E. faecalis in orthopaedic peri-implant infections demonstrated by automated ribotyping and cluster analysis. Biomaterials 2007; 28: Billstrom H, Lund B, Sullivan A, Nord C. Virulence and antimicrobial resistance in clinical Enterococcus faecium. Int J Antimicrob Agents 2008; 32: Bittencourt de Marquez E, Suzart S. Occurrence of virulence-associated genes in clinical Enterococcus faecalis strains isolated in Londrina, Brazil. J Med Microbiol 2004; 53: Cariolato D, Andrighetto C, Lombardi A. Occurrence of virulence factors and antibiotic resistances in E. faecalis and E. faecium collected from dairy and human samples in North Italy. Food Control 2008; 19: Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall G. Vancomycin resistant Enterococci. Clin Microbiol Rev 2000; 13: Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: sixteenth informational supplement. 2006, CLSI document M100-S16. Clinical and Laboratory Standard Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA. 7. Coque T, Patterson J, Steckelberg J, Murray B. Incidence of hemolisin, gelatinase and aggregation substance among enterococci isolated from patients with endocarditis and other infections and from feces of hospitalized and community-based persons. J Infect Dis 1995; 171 : Coque T, Willems R, Cantón R i inni. High occurrence of esp among ampicillin-resistant and vancomycinsusceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients. J Antimicrob Chemother 2002; 50: Eaton T, Gasson M. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates. Appl Environ Microbiol 2001; 67: Izumi E, Dominguez Pires P, Bittencourt de Marquez E, Suzart S. Hemagglutinating and hemolitic activities of Enterococcus faecalis strains isolated from different human clinical sources. Res Microbiol 2005; 156: Kariyama R, Mitsuhata R, Chow J i inni. Simple and reliable multiplex PCR assay for surveillance isolates of vancomycin-resistant enterococci. J Clin Microbiol 2000; 38:

8 132 M.E. Łysakowska, J. Śmigielski, A. Denys Nr Kawalec M, Pietras Z, Daniłowicz E i inni. Clonal structure of E. faecalis isolated from Polish hospitals: characterization of epidemic clones. J Clin Microbiol 2007; 1: Koch S, Hufnagel M, Theilacker C, Huebner J. Enterococcal infections: host response, therapeutic, and prophylactic possibilities. Vaccine 2004; 22: Mundy L, Sahm D, Gilmore M. Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2000; 13: Piekarska K, Kochman M, Ławrynowicz-Paciorek M. Charakterystyka opornych na fluorochinolony szczepów Enterococcus faecalis izolowanych z materiału klinicznego. Med Dośw Mikrob 2005; 57: Roberts J, Singh K, Okhuysen P, MurrayB. Molecular epidemiology of the fsr locus and of gelatinase production among different subsets of Enterococcus faecalis isolates. J Clin Microbiol 2004; 5: Routsi C, Platsouka E, Willems R i inni. Detection of enterococcal surface protein gene (esp) and amplified fragment length polymorphism typing of glycopeptide-resistant Enterococcus faecium during its emergence in a Greek intensive care unit. J Clin Microbiol 2003; 41: Ruiz-Garbajosa, Bonten M, Robinson D i inni. Multilocus sequence typing scheme for E. faecalis reveals hospital-adapted genetic complexes in a background of high rates of recombination. J Clin Microbiol 2006; 6: Semedo T, Santos M, Martins P i inni. Comparative study using type strains and clinical and food isolates to examine hemolytic activity and occurrence of the cyl operon in enterococci. J Clin Microbiol 2003; 41: Shankar N, Coburn P, Pillar C i inni. Enterococcal cytolysin: activities and association with other virulence traits in a pathogenicity island. Int J Med Microbiol 2004; 293: Sifri C, Mylonakis E, Singh K i inni. Virulence effect of E. faecalis protease genes and the quorum sensing locus fsr in Caenorhabditis elegans and mice. Infect Immun 2002;10: Süssmuth S, Muscholl-Silberhorn A, Wirth R i inni. Aggregation substance promotes adherence, phagocytosis, and intracellular survival of Enterococcus faecalis within human macrophages and suppresses respiratory burst. Infect Immun 2000;68: Top J, Willems R, van der Velden S i inni. Emergence of clonal complex 17 Enterococcus faecium in The Netherlands. J Clin Microbiol 2008; 1: Tsigrelis C, Singh K, Coutinho T i inni. Vancomycin resistant Enterococcus faecalis endocarditis: linezolid failure and strain characterization of virulence factors. J Clin Microb 2007;2: Waters C, Hirt H, McCormick J i inni. An amino-terminal domain of E. faecalis aggregation substance is required for aggregation, bacterial internalization by epithelial cells and binding to lipoteichoic acid. Mol Microbiol, 2004, 4: Werner G, Klare I, Fleige C, Witte W. Incresing ratees of vancomycin resistance among Enterococcus faecium isolated from German hospitals between 2004 and 2006 are due to wide clonal dissemination of vancomyccin-resistant enterococci and horizontal spread of vana clusters. Int J Med Microb 2008; 298: Worth L, Slavin M, Vankerchoven V i inni. Virulence determinants in vancomycin-resistant Enterococcus faecium vanb: clonal distribution, prevalence and significance of esp and hyl in Australia patients with haematological disorders. J Hosp Infect 2008; 68: Otrzymano: 05 V 2009 r. Adres Autora: Łódź, pl. Hallera 1, Zakład Mikrobiologii Lekarskiej i Sanitarnej Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Tel./fax: