MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 103-110 Sequence-based typing molekularne typowanie szczepów Legionella pneumophila w ramach międzynarodowego sprawdzianu external quality assessment Sequence-based typing molecular typing of Legionella pneumophila strains within the framework of an international external quality assessment Katarzyna Piekarska, Magdalena Rzeczkowska, Hanna Stypułkowska-Misiurewicz Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publcznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Celem badania było molekularne typowanie szczepów przeprowadzone techniką Sequence-Based Typing (SBT) w ramach dziewiątego międzynarodowego sprawdzianu External Quality Assessment (ELDSNet Legionella pneumophila DNA SBT) oraz ocena wyników uzyskanych przez Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH na tle wyników uzyskanych przez specjalistyczne laboratoria w innych krajach EU. Materiał do badań stanowił panel 5 zakodowanych szczepów. Genotypowanie pałeczek Legionella przeprowadzono amplifikując i sekwencjonując określony region siedmiu genów. Uzyskane sekwencje nukleotydowe (forward i reverse) zamieszczono w ogólnodostępnej, międzynarodowej bazie danych. Dla każdego szczepu określono kompletny profil złożony z serii indywidualnych numerów poszczególnych alleli charakterystyczny dla znajdującego się w bazie danych typu sekwencyjnego (ang. sequence type, ST). Uzyskane wyniki potwierdzają, że Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH posiada umiejętność typowania szczepów Legionella pneumophila zgodnie z wymogami międzynarodowej klasyfikacji. Słowa kluczowe: EQA, SBT, typowanie, Legionella pneumophila ABSTRACT Introduction. The aim of the study was evaluation results of molecular typing strains that was carried by using SBT (Sequence-Based Typing) method, obtained by laboratory of Department of Bacteriology NIZP-PZH within the framework of the ninth
104 K. Piekarska, M. Rzeczkowska, H. Stypułkowska-Misiurewicz Nr 2 international external quality assessment (ELDSNet Legionella pneumophila DNA SBT) and their comparision with the results obtained by other reference laboratories in EU. Material and methods. The panel of five coded isolates of was investigated. Genomic DNA of Legionella were extracted and defined regions of seven genes were amplified by PCR and sequenced. Then, consensus sequence of the correct length were generated. In order to determine the complete allelic profile and Seqence Type (ST) forward and reverse sequence for each allele were submitted online by using the database. Results. All of L. pneumoniae isolates sent to genotyping by SBT method were correctly identified in our laboratory. Conclusions. Results of the ninth international external quality assessment have confirmed competences of laboratory of Department of Bacteriology NIZP-PZH in typing of L. pneumophila isolates accordance with the requirements of the international classification. Key words: EQA, SBT, typing, Legionella pneumophila WSTĘP Gram-ujemne, polimorficzne pałeczki Legionella, są bakteriami często zasiedlającymi naturalne i sztuczne zbiorniki wodne, sieć wody ciepłej i zimnej oraz różnego rodzaju urządzenia w tym, urządzenia klimatyzacyjne, wieże chłodnicze, chłodnie kominowe, skraplacze parowe, baseny wirowe, fontanny czy zraszacze ogrodowe, jak również sprzęt do zabiegów medycznych i terapii oddechowej (5, 7, 11). Z drugiej strony, te tzw. atypowe patogeny coraz częściej stanowią poważne zagrożenie zdrowia człowieka. Mogą być przyczyną zapalenia płuc (tzw. choroby legionistów, legionelozy) o ciężkim przebiegu, które nie odpowiada na leczenie antybiotykami β-laktamowymi (7). Do zakażenia dochodzi głównie u osób wrażliwych, najczęściej wskutek inhalacji wodnych aerozoli lub aspiracji skażonej wody (1, 3, 5, 7, 11). Zachorowania występują sporadycznie, czasem epidemicznie i podlegają obowiązkowi zgłaszania, w Polsce od 2001 roku (7). W przypadku wystąpienia zakażenia o etiologii Legionella wymagane jest również przeprowadzenie dochodzenia epidemiologicznego oraz wykonanie bakteriologicznych badań wody w celu wykrycia i identyfikacji źródła zakażenia. W dochodzeniu epidemiologicznym, przy ustalaniu źródła zakażenia istotna jest charakterystyka i typowanie szczepów klinicznych i izolowanych ze środowiska z wykorzystaniem technik biologii molekularnej. W celu dokładniejszej charakterystyki izolatów, w ramach grupy roboczej ds. zakażeń pałeczkami Legionella EWGLI (European Working Group for Legionella Infectious) opracowano schemat typowania tj. sequence-based typing (SBT) wdrożony przez European Legionnaires Disease Surveillance Network (ELDSNet) (3, 12). Ta szybka metoda typowania, stosowana przez wysokospecjalistyczne laboratoria zajmujące się diagnostyką pałeczek Legionella, polega na amplifikacji z genomowego DNA siedmiu loci (flaa, pile, asd, mip, momps, proa i neua), a następnie sekwencjonowaniu uzyskanych produktów PCR. Na podstawie sekwencji nukleotydowej (chromatogramów) umieszczanych w ogólnodostępnej bazie danych znajdującej się na stronie EWGLI (http://www.hpabioinformatics.org.uk/legionella/legionella_sbt/php/
Nr 2 Molekularne typowanie 105 sbt_homepage.php), dla każdego szczepu generowany jest kompletny profil złożony z serii indywidualnych numerów poszczególnych alleli, charakterystyczny dla określonego typu ST (sequence type) (3, 12). Metoda SBT (ang. sequence-based typing) jest doskonałym narzędziem charakteryzującym się dużą powtarzalnością i odtwarzalnością wyników. Umożliwia porównanie izolatów pochodzących zarówno z próbek klinicznych, jak i środowiskowych a uzyskane dane są bardzo pomocne przy ustalaniu źródła infekcji i epidemiologicznych powiązań (1, 2). To właśnie przy użyciu tej metody, zawleczone izolaty (travel-associted legionelosis) mogą być wykryte i badane w jednym kraju, zaś uzyskane wyniki mogą być porównywane z wynikami uzyskanymi przez inny zespół ustalający potencjalne źródło zakażenia znajdujące się w środowisku wraz ze wszystkimi powiązanymi przypadkami odnotowanymi na terenie innego kraju (1). Obecnie, rodzaj Legionella składa się z ponad 50 gatunków i ponad 70 serogrup (3, 6), przy czym powyżej 90% przypadków legionelozy wywołanych jest przez Legionella pneumophila (6). Wśród szczepów należących do 16 grup serologicznych, za zakażenia u ludzi najczęściej (80%) odpowiadają izolaty należące do serogrupy 1 (6). W niniejszym opracowaniu przedstawiono wyniki genotypowania szczepów Legionella pneumophila uzyskane w Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH w ramach międzynarodowego sprawdzianu External Quality Assessment (ELDSNet Legionella pneumophila DNA SBT), a następnie porównano je z wynikami uzyskanymi przez inne laboratoria zajmujące się diagnostyką Legionella. MATERIAŁ I METODY Badane próbki. Materiał do badań stanowił panel 5 zakodowanych szczepów, oznaczonych numerami od 52 do 56, które zostały przygotowane i przysłane przez Laboratorium Health Protection Agency w Londynie zgodnie z obowiązującymi regulacjami prawnymi przyjętymi dla transportu materiału zakaźnego. Hodowla. Szczepy stanowiące przedmiot badań, wysiano na płytki zawierające zbuforowane podłoże agarowe z węglem drzewnym i ekstraktem drożdżowym (BCYE) z dodatkiem cysteiny, jak i bez cysteiny (Oxoid), przygotowane przez Pracownię Pożywek i Sterylizacji NIZP-PZH. Test lateksowy. Przynależność badanego szczepu do serogrupy 1 i/lub serogrup 2-14 określano za pomocą Legionella Latex Test (Oxoid). Izolacja genomowego DNA. Do izolacji genomowego DNA zastosowano komercyjny zestaw HighPure PCR Template Preparation Kit (Roche) postępując zgodnie z zaleceniami producenta. PCR. Reakcję amplifikacji określonych fragmentów 7 genów przeprowadzono stosując startery (Tabela I) oraz uprzednio opisaną metodykę (3, 8, 9, 12). Sekwencjonowanie. Uzyskane produkty PCR oczyszczono za pomocą odczynnika ExoSAP-IT (Affymetrix), a następnie poddano reakcji sekwencjonowania (Genomed) stosując startery rekomendowane przez organizatorów sprawdzianu (8, 9). Analizę sekwencji nukleotydowych prowadzono przy użyciu programu CLC Sequence Viewer v. 6.3. (CLC). Uzyskane chromatogramy umieszczono w bazie danych zamieszczonej online (http://www.
106 K. Piekarska, M. Rzeczkowska, H. Stypułkowska-Misiurewicz Nr 2 Tabela I. Oligonukleotydy starterowe zastosowane do identyfikacji wybranych fragmentów genów w metodzie SBT. Gen Nazwa startera Sekwencja startera (5-3 ) flaa pile asd mip momps proa neua neua flaa-587f GCGTATTGCTCAAAATACTG flaa-960r CCATTAATCGTTAAGTTGTAGG pile-35f CACAATCGGATGGAACACAAACTA pile-453r GCTGGCGCACTCGGTATCT asd-511f CCCTAATTGCTCTACCATTCAGATG asd-1039r CGAATGTTATCTGCGACTATCCAC mip-74f GCTGCAACCGATGCCAC mip-595r CATATGCAAGACCTGAGGGACC momps-450f (PCR+sekwencjonowanie) momps-1116r (PCR) momps-1015r (sekwencjonowanie) TTGACCATGAGTGGGATTGG TGGATAAATTATCCAGCCGGACTTC CAGAAGCTGCGAAATCAG proa-110f GATCGCCAATGCAATTAG proa-1553r ACCATAACATCAAAAGCC neua-196f CCGTTCAATATGGGGCTTCAG neua-634r CGATGTCGATGGATTCACTAATAC neuah_l (nowe) ATCCAGCAGTTTTTAMAAATTTAGG neuah_r (nowe) TGGCTGCATAAAYTAATTCTTTAGCCA Temperatura annealingu ( C) Oczekiwana wielkość produktu (bp) Referencje 55 414 9, 10 55 460 3, 9, 10 55 576 3, 9, 10 55 559 4, 9, 10 55 711 3, 9, 10 55 481 3, 9, 10 55 459 4, 9, 10 55 791-794 8
Nr 2 Molekularne typowanie 107 hpa-bioinformatics.org.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php) i dla każdego szczepu oznaczano kompletny profil złożony z serii indywidualnych numerów poszczególnych alleli, charakterystyczny dla określonego typu ST (3, 8, 9, 12). Zabezpieczenia środowiska pracy i personelu. Ze względu na to, że badane próbki zawierały żywe drobnoustroje, z których sporządzano zawiesiny (prawdopodobieństwo wytworzenia aerozoli) doświadczenia prowadzone były w komorze laminarnej z zachowaniem zasad właściwej pracy laboratoryjnej. WYNIKI Wśród szczepów nadesłanych do typowania, znajdowały się dwa szczepy wyizolowane ze środowiska i 3 szczepy wyizolowane z materiału klinicznego (Tabela II). Szczepy te były epidemiologicznie niepowiązane. Oczekiwane przez organizatora wyniki sprawdzianu wraz z zestawieniem liczby laboratoriów poprawnie oznaczających daną próbkę przedstawiono w tabeli II. Trzydzieści laboratoriów spośród 37 (81%) biorących udział w sprawdzianie, w tym Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH, poprawnie oznaczyło wszystkie badane próbki tj. (5/5), 2 laboratoria poprawnie oznaczyło 4 próbki, jedno 3 próbki,dwa 2 próbki, jedno 1 próbkę, zaś jedno żadnej próbki nie oznaczyło prawidłowo. Najwięcej kłopotów przysporzyła próbka oznaczona numerem 56, błędnie oznaczona przez 5 laboratoriów (13,5%). Także próbki oznaczone jako 52, 54 i 55 zostały błędnie oznaczone odpowiednio przez cztery laboratoria (10,8%) każda. Najmniej problemów przysporzyła próbka oznaczona numerem 52, którą błędnie oznaczyło 2 laboratoria (5,4%). W każdej oznaczanej próbce największy problem dla laboratoriów biorących udział w sprawdzianie stanowiło poprawne wykrycie i określenie allelu genu neua. W przypadku próbki oznaczonej numerem 55, pałeczki Legionella zanieczyszczone były Gram-dodatnimi ziarenkowcami. Szczep, który stanowił przedmiot dalszych analiz, udało się wyizolować po wykonaniu posiewów serii rozcieńczeń zawiesiny badanej próbki tj. przy rozcieńczeniu 1:100. Ponadto, wśród pięciu szczepów nadesłanych do badania znajdowały się trzy, które nie dawały oczekiwanych produktów PCR dla wszystkich analizowanych siedmiu loci przy użyciu standardowych starterów i stosowaniu standardowej metodyki SBT. W przypadku dwóch szczepów, oznaczonych jako 52 i 56, produkt PCR dla badanego fragmentu genu neua otrzymano po zastosowaniu nowych starterów neuah (Tabela I). Natomiast w przypadku szczepu 54, produktu PCR nie otrzymano także używając nowych starterów (neuah). W tej edycji sprawdzianu, uczestnicy poza wynikami dotyczącymi SBT zostali poproszeni o dołączenie wyników serogrupowania badanych szczepów. Wyniki przynależności badanych izolatów do określonej serogrupy otrzymane w naszym laboratorium przedstawiono w tabeli III. DYSKUSJA Jednym z podstawowych założeń ECDC było ujednolicenie metod wykrywania i typowania pałeczek Legionella w krajach EU, poprzez współpracę badaczy w ramach grupy roboczej EWGLI. W celu wymiany doświadczeń stale organizowane są szkolenia
108 K. Piekarska, M. Rzeczkowska, H. Stypułkowska-Misiurewicz Nr 2 Tabela II. Charakterystyka 5 epidemiologicznie niepowiązanych izolatów przysłanych przez organizatora sprawdzianu wraz z liczbą laboratoriów, które poprawnie oznaczyły daną próbkę. Nr próbki 52 53 54 55 56 Szczep sg10 szczep środowiskowy sg1 mab subgroup Oxford/Olda szczep kliniczny sg11 szczep kliniczny sg1 mab subgroup Bellingham szczep kliniczny sg3 szczep środowiskowy Profil alleli 3,13,1,28,14,9,207 5,1,22,26,6,10,12 2,10,14,28,2,5,F 5,2,22,27,6,10,12 3,13,1,3,14,9,207 ST 1392 45 0 48 1341 Liczba laboratoriów, które poprawnie oznaczyły badaną próbkę/liczbę wszystkich laboratoriów biorących udział w sprawdzianie 33/37 35/37 33/37 34/37 32/37 Tabela III. Wyniki uzyskane w Laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH. Nr próbki Wzrost na podłożu: BCYE-bez Cys. BCYE+Cys. Wynik uzyskany w teście lateksowym Profil alleli: flaa pile asd mip momps proa neua 52 - + Sg 2-14 3 13 1 28 14 9 207 1392 53 - + Sg 1 5 1 22 26 6 10 12 45 54 - + Sg 2-14 2 10 14 28 2 5 0 N/A 55 - + Sg 1 5 2 22 27 6 10 12 48 56 - + Sg 2-14 3 13 1 3 14 9 207 1341 ST
Nr 2 Molekularne typowanie 109 i konferencje. Elementem doskonalenia są także organizowane wieloośrodkowe, międzynarodowe sprawdziany, których celem jest ocena umiejętności krajowych laboratoriów prowadzących diagnostykę pałeczek Legionella w zakresie wykrywania oraz typowania szczepów. W dziewiątej edycji sprawdzianu dotyczącego typowania pałeczek Legionella, udział wzięły 37 laboratoria z 29 krajów, w tym z: Australii, Austrii, Belgii (2), Kanady (3), Czech, Danii, Wielkiej Brytanii, Finlandii, Francji, Niemiec, Grecji, Węgier, Włoch (4), Japonii, Luxemburga, Holandii, Nowej Zelandii, Norwegii (3), Polski, Portugalii, Rumunii, Szkocji, Singapuru, Słowenii, Hiszpanii, Szwecji, Szwajcarii, Tajwanu i USA. Według organizatorów sprawdzianu ELDSNet Legionella pneumophila DNA SBT, w tej edycji laboratoria osiągnęły zadowalające wyniki, co szczegółowo zostało omówione w przysłanym do uczestników raporcie (dn. 31.01.2013). Niektóre laboratoria uczestniczące w sprawdzianie napotkały trudność polegającą na konieczności odzyskania izolatu Legionella w zanieczyszczonej próbce nr 55. Ponadto, wśród pięciu szczepów nadesłanych do typowania znajdowały się trzy, które nie dawały oczekiwanych produktów PCR dla wszystkich analizowanych siedmiu loci przy użyciu standardowych starterów i stosowaniu standardowej metodyki SBT. Problem dotyczył amplifikacji fragmentu genu neua, kodującego N-acylneuroaminate cytidylytransferase, enzymu zaangażowanego w biosyntezę lipopolisacharydu (LPS). Według ustaleń podjętych na odbywającym się we wrześniu 2012 roku w Dreźnie spotkaniu grupy roboczej EWGLI, w przypadku nie uzyskania produktu amplifikacji przy użyciu wcześniej stosowanych starterów neua-196f i neua-634r (Tabela 1) wśród szczepów należących do serogrupy innej niż 1 należy zastosować nowe startery tj. neuah_l i neuah_r, co uprzednio opisał Farhat i wsp. (2). Bowiem przy użyciu starterów z obowiązującego do tej pory schematu SBT możliwe było uzyskanie produktu PCR w przypadku wszystkich szczepów należących do serogrupy 1 oraz tylko niektórych należących do innych serogrup (2). W przypadku dwóch szczepów, oznaczonych jako 52 i 56, uzyskano produkty PCR w wyniku zastosowania nowych starterów neuah. Analiza wyników uzyskanych w tej edycji sprawdzianu pozwoliła zaobserwować, że w próbce oznaczonej numerem 54 ( sg 11), pomimo zastosowania nowych starterów nie uzyskano produktu PCR poszukiwanego fragmentu genu neua. Według informacji uzyskanych od organizatorów sprawdzianu (raport), jak dotąd przy użyciu nowych starterów produktu amplifikacji fragmentu genu neua nie udało się uzyskać tylko w przypadku trzech isolatów należących do serogrupy 11. Dlatego też, na podstawie walidacji nowych starterów neuah przeprowadzonej w ramach tego wieloośrodkowego sprawdzianu, organizatorzy zaproponowali ich włączenie do schematu typowania pałeczek Legionella pneumophila. PODSUMOWANIE Wyniki uzyskane w ramach 9 edycji międzynarodowego sprawdzianu ELDSNet Legionella pneumophila DNA SBT potwierdziły kompetencje Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH w zakresie typowania szczepów Legionella pneumophila.
110 K. Piekarska, M. Rzeczkowska, H. Stypułkowska-Misiurewicz Nr 2 PIŚMIENNICTWO 1. Afshar B, Fry NK, Bellami W, i in.external Quality Assessment of a DNA sequence-based scheme for epidemiological typing of Legionella pneumophila by an international network of laboratories. J Clin Microbiol 2007; 45:3251-6. 2. Farhat C, Mentasti M, Jacobs E, i in. The N-Acylneuraminate Cytidyltransferase gene, neua, is heterogenous in Legionella pneumophila strains but can be used as a marker for epidemiological typing in the consensus sequence-based typing scheme. J Clin Microbiol 2011, 49: 4052-8. 3. Gaia V, Fry NK, Afshar B, i in. Consensus sequence-based scheme for epidemiological typing of clinical and environmental isolates of Legionella pneumophila. J Clin Microbiol 2005; 43: 2047-52. 4. Ginerva Ch, Lopez M, Forey F, i in. Evolution of nested-pcr-derived sequence-based typing method applied directly to respiratory samples from patients with legionnaires disease. J Clin Microbiol 2009; 47: 981-7. 5. Harrison TG, Afshar B, Doshi N, i in. Distribution of Legionella pneumophila serogroups, monoclonal antibody subgroups and DNA sequence types in recent clinical and environmental isolates from England and Wales (2000-2008). Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009, 28: 781-91. 6. Kanatani J, Isobe J, Kimata K, i in. Molecular epidemiology of Legionella pneumophila serogrup 1 isolates identify a prevalent sequence type, ST505, and a distinct clona group of clinical isolates in Toyama Prefecture, Japan. J Infect Chemother 2012; DOI 10.1007/s10156-012-0537-x. 7. Kucharczyk P, Jahn-Różyk K. Patofizjologia, epidemiologia i obraz kliniczny zakażeń wywołanych przez Legionella pneumophila. Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. Family Med. 2012; 18: 76-84. 8. Mentasti M and Fry NK. Analysis of the N-Acylneuraminate Cytidyltransferase homologue (neuah) found in some non-serogrup 1 strains of Legionella pneumophila. Version 1.0. (http:// www.hpa-bioinformatics.org.uk/legionella /legionella_sbt/php/sbt_ homepage.php) 9. Mentasti M and Fry NK. Seqence-Based Typing for epidemiological typing of Legionella pneumophila. Version 5.0. (http://www.hpa-bioinformatics.org.uk /legionella legionella_sbt/php/ sbt_homepage.php) 10. Mentasti M, Fry NK, Afshar B, i in. Application of Legionella pneumophila-specific quantitative real-time PCR combined with direct amplification and sequence-based typing in the diagnosis and epidemiological investigation of Legionnaires disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 2017-28. 11. Palusińska-Szysz M, Cendrowska-Pinkosz M. Występowanie i chorobotwórczość bakterii z rodziny Legionellaceae. Postępy Hig. Med. Dośw.:2008; 62: 337-53. 12. Ratzow S, Gaia V, Helbig JH, i in. Addition of neua, the gene encoding N- acylneuraminate cytidyl transferase, increases the discriminatory ability of consensus sequence-based scheme for typing Legionella pneumophila serogrup 1 strains. J Clin Microbiol 2007, 45: 1965-8. Otrzymano: 8 VII 2013 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail: kpiekarska@pzh.gov.pl