Katarzyna Pancer AUTOREFERAT. Zakład Wirusologii. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie

Transkrypt

1 Katarzyna Pancer Zakład Wirusologii Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie AUTOREFERAT Warszawa 2017

2 1.Imię i nazwisko: Katarzyna Pancer 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe Doktor nauk medycznych z zakresu biologii medycznej (2000) Państwowy Zakład Higieny w Warszawie, tytuł rozprawy: Wybrane właściwości taksonomiczne i biologiczne szczepów Vibrio cholerae non-01 izolowanych z próbek wody z rzeki Bug, promotor prof. dr hab. Hanna Stypułkowska-Misiurewicz, recenzenci: prof. dr hab. Danuta Naruszewicz-Lesiuk, prof. dr hab. Krystyna Pietkiewicz. Dyplom Diagnosty Laboratoryjnego Dyplom specjalisty I o stopnia w zakresie mikrobiologii (1998) Magister biologii, specjalność mikrobiologia (1991) Uniwersytet Warszawski, Wydział Biologii 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Laboratorium BSL3 Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego -Państwowego Zakładu Higieny o Od r. Kierownik Laboratorium BSL3 oraz adiunkt w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego -Państwowego Zakładu Higieny o Od r.- adiunkt p/o Dyrektora Regionalnego Centrum Doskonałości WHO Global SalmSurv Pracownia Shigella, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego -Państwowego Zakładu Higieny o r. adiunkt o asystent o biolog o stypendystka Studium Doktoranckiego przy PZH o biolog Pracownia Bakteriologii w PSK nr 3 AM - Dziecięcym Państwowym Szpitalu Klinicznym Akademii Medycznej nr 3 w Warszawie o r.-młodszy asystent 4. Łączny IF po uzyskaniu stopnia doktora: 17,802 Jako pierwszy autor: IF - 6,269, w tym 6,033 IF prace oryginalne oraz 0,236 IF praca poglądowa I. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art.16 ust.2 ustawy z dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. nr 65, poz.595 z późniejszymi zmianami) A. Tytuł osiągnięcia naukowego: Zagrożenie legionelozą jako zdrowotny problem także w Polsce. B. Wykaz publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe 2 z 32

3 Osiągnięcie stanowi cykl 13 publikacji wymienionych poniżej w kolejności opisania badań i zagadnień badanych w ramach osiągniecia naukowego: Zagadnienie: typowanie genetyczne oraz antygenowe szczepów L. pneumophila w poszerzonej analizie zagrożenia zakażeniem 1. Pancer K. Sequence-based typing of Legionella pneumophila strains isolated from hospital water distribution systems as a complementary element of risk assessment of legionellosis in Poland. AAEM 2013, 20: (IF-0,0 ukarane czasopismo w 2013r. 1 ; MNiSzW -30) 2. Pancer K, Matuszewska R, Bartosik M, Kacperski K, Krogulska B. Persistent colonization of 2 hospital water supplies by L. pneumophila strains through 7 years: sequence based typing and serotyping as useful tools for a complex risk analysis. AAEM 2013,20: (IF-0,0 ukarane czasopismo w 2013r.; MNiSzW -30) 3. Pancer K, Jahnz-Różyk K, Kucharczyk A, Gut W, Kucharczyk P, Elverdal PL, Litwińska B: Sequence based typing and pre-absorption test in retrospective analysis of a pseudo-outbreak of Legionella infections differentiates true cases of legionellosis. AAEM 2012, 19: (IF-3,060; MNiSzW -25) 4. Pancer K, Rabczenko D, Krogulska B, Matuszewska R, Ozygała J, Stanisławska A, Trzcińska A, Stypułkowska-Misiurewicz H. Mikrobiologiczna ocena zagrożenia legionelozą oraz zastosowanie metody eliminacji Legionella pneumophila z sieci wodnych budynków szpitalnych. Przegl Epidemiol, 2008; 62: (MNiSzW- 9) Zagadnienie: wpływ zasiedlenia przez L. pneumophila systemów wodnych na wytwarzanie przeciwciał przez narażone osoby 5. Pancer K, Rabczenko D, Stypułkowska-Misiurewicz H. The influence of contamination of a hospital hot-water system with Legionella pneumophila on serum antibody production by staff members. Indoor Built Environ, 2006; 15: (IF-0,535; Pkt MNiSzW- 20) 6. Pancer K, Stypulkowska-Misiurewicz H, Krogulska B, Matuszewska R: Hospital tap water system as a source of nosocomial Legionella infections for staff members and patients. Indoor Built Environ., 2003; 12:31-36 (IF- 0,525; Pkt MNiSzW- 8) Zagadnienie: różnicowanie odpowiedzi swoistej na zakażenie L.pneumophila od reakcji krzyżowych lub nieswoistych 7. Pancer KW. Problem of immunoglobulin M co-detection in serological response to bacterial and viral respiratory pathogens among children suspected of legionellosis. Cent Eur J Immunol. 2015, 40: (IF-0,309; MNiSzW-15) 8. Pancer KW. Cross-reactions in IgM ELISA tests to Legionella pneumophila sg1 and Bordetella pertussis among children suspected of legionellosis; potential impact of vaccination against pertussis? Cent Eur J Immunol. 2015, 40: (IF-0,309; MNiSzW-15) 9. Pancer K. Patient s age and the dynamics of IgM for L. pneumophila sg1. Przegl Epidemiol 2014, 68, (MNiSzW-7) Zagadnienie: sytuacja epidemiczna legionelozy w Polsce na tle sytuacji w Europie 10. Pancer K. Legionelozowe zapalenie płuc wiązane z podróżą (TAP-LD) w Polsce i w Europie. Nowa Klinika. Medycyna Zakażeń 2009; 16: (MNiSW-2) 1 Gdy w lipcu 2012r. złożono manuskrypt do czasopisma Annals of Agricultural Environmental Medicine (AAEM) było ono wtedy ocenione na 3,06 IF. W 2014r., IF wynosił 1,126 i jedynie w 2013r. IF wynosiło 0 w związku z ukaraniem czasopisma. 3 z 32

4 11. Stypułkowska-Misiurewicz H, Pancer K, Krogulska B, Matuszewska R. Ognisko choroby legionistów na oddziale okulistycznym. Szpitalne zakażenie Legionella pneumophila po raz pierwszy obserwowane w Polsce. Przegl Epidemiol 2007; 61: (MNiSzW- 9) 12. Pancer K, Napiórkowska A, Gut W, Stypułkowska-Misiurewicz H. Charakterystyka demograficzna zachorowań na legionelozę w Polsce w latach w świetle danych gromadzonych przez European Working Group for Legionella Infections (EWGLI). Przegl Epidemiol 2011, 65: (MNiSzW-7) 13. Stypułkowska-Misiurewicz H, Pancer K. Legioneloza w Polsce w latach na tle sytuacji epidemiologicznej w Europie. Przegl. Epidemiol., 2003,57: (MNiSzW- 4) Ogółem publikacje stanowiace osiągnięcie: Punkty MNiSzW 181 IF 4,738 W tym publikacje, w których jestem pierwszym lub korespondencyjnym autorem: 11/13 C. Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Zagrożenie legionelozą jako zdrowotny problem także w Polsce. Bakterie Legionella pneumophila są to Gram-ujemne pałeczki, zaliczane do Legionellaceae, występujące w środowisku wodnym, przede wszystkim stworzonym przez człowieka. Odkryte zostały w 1976r. jako czynnik etiologiczny epidemii ciężkiego zapalenia płuc, nazwanego następnie chorobą legionistów, LD (inaczej legionelozowym zapaleniem płuc). Może mieć ono różny przebieg od łagodnego do zagrażającego życiu i zdrowiu chorego, śmiertelność waha się od 3% do nawet 50% - w zależności od kategorii zachorowania, stanu ogólnego zdrowia pacjenta oraz właściwości szczepu bakteryjnego. Do zakażenia dochodzi poprzez inhalację aerozolu wodno-powietrznego skażonego tymi bakteriami. Ze względu na sposób szerzenia się zakażeń istnieje możliwość wystąpienia ognisk liczących nawet kilkadziesiąt lub kilkaset przypadków (np. w 2014r. w Portugalii >400 osób; w pierwszych miesiącach 2017r. w Dubaju >30 osób). Odpowiednio przeprowadzone dochodzenie epidemiologiczne pozwala wykryć i wyeliminować źródło zakażeń, którym często jest skolonizowany system i instalacje wody ciepłej (ponad 80% przypadków), system chłodniczy (tzw. wieże chłodnicze), spryskiwacze, fontanny, baseny perełkowe, jacuzzi, prysznice i in. Jest to więc jeden z problemów, których pojawienie się można wiązać z rozwojem cywilizacyjnym. Istnieje możliwość zapobiegania występowaniu zakażeń bakteriami Legionella sp. dzięki prawidłowo prowadzonej diagnostyce różnicującej w atypowych zapaleniach płuc i innych zakażeniach dróg oddechowych oraz odpowiednio prowadzonemu nadzorowi nad stanem instalacji wodnych w budynkach użyteczności publicznej i prywatnych, dochodzeniom epidemicznym. Badania nad występowaniem legionella-podobnymi patogenami ameb (Legionellalike amoebal pathogens, LLAP) prowadzone były w Polsce już od lat 50 XX wieku, ale skupiały się one na występowaniu tych bakterii w środowisku wodnym oraz ich interakcji z amebami 2. W latach XX wieku, badania u ludzi ograniczane były do zakażeń wywołanych przede wszystkim przez bakterie L. pneumophila zaliczane do serogrupy 1 2 Drożański W. i wsp. Electron microscopic studies of Acanthamoeba castellanii infected with obligate intracellular bacterial parasite. Acta Microbiol Pol,1979, 28: z 32

5 Autoreferat Katarzyna Pancer: Zagrożenie legionelozą jako zdrowotny problem także w Polsce (L. pneumophila sg1). Dotyczyły one przede wszystkim wybranych grup ryzyka czyli osób narażonych w środowisku życia lub pracy na skażony tymi bakteriami aerozol wodnopowietrzny (ogrodnicy, pracownicy platform wiertniczych). U tych osób poszukiwano przeciwciał przeciw L. pneumophila sg1. Dopiero konieczność przeprowadzania dochodzenia epidemiologicznego w podejrzeniu legionelozowego zapalenia płuc, wykrywanego dzięki międzynarodowej współpracy w ramach Europejskiej Grupy Roboczej ds. zakażeń Legionella (EWGLI), spowodowała wzrost zainteresowania polskich władz zagrożeniem, jakie mogą stanowić dla ludzi te bakterie występujące w systemach wody ciepłej - także w naszym kraju. Podjęta została oficjalna współpraca w ramach EWGLI w 1997r.. W PZH3 powstał zespół badaczy, który został nominowany przez Ministra Zdrowia do uczestniczenia w dochodzeniach epidemiologicznych i badaniach prowadzonych w ramach tej międzynarodowej grupy ekspertów. Jednak dopiero w 2002r. wprowadzono w Polsce obowiązek zgłaszania zachorowań wywołanych przez pałeczki Legionella sp. (Międzynarodowa Statystyczna Klasyfikacja Chorób i Problemów Zdrowotnych, ICD-10, kody: A48.1 i A48.2), a w 2005r. również obowiązek zgłaszania dodatnich wyników badań w kierunku zakażeń tymi bakteriami, ponieważ pałeczki L. pneumophila zostały uznane za jeden z patogenów alarmowych. Począwszy od 1997r. aktywnie uczestniczyłam w opracowywaniu metod diagnostycznych w celu wykrycia i potwierdzenia zakażenia bakteriami L. pneumophila oraz w, prowadzonych na terenie całej Polski, dochodzeniach epidemiologicznych w podejrzeniach legionelozy. Mimo, że od 14-tu lat przypadki legionelozy są w Polsce obowiązkowo zgłaszane, a od ośmiu lat wszystkie placówki użyteczności publicznej powinny kontrolować systemy wody ciepłej, to liczba wykrywanych i raportowanych legionelozowych zapaleń płuc w naszym kraju drastycznie odbiega od liczby wykrywanych w większości krajów europejskich. Średnia zapadalność w Europie wyliczona na podstawie danych z 30 krajów przekracza 1,0/100tys., natomiast w Polsce oscyluje pomiędzy 0,03 0,23/100tys. Należy rozważyć, czy przyczyną takiego stanu rzeczy w Polsce jest brak zagrożenia zakażeniem bakteriami Legionella sp., czy też system wykrywania i zgłaszania zakażeń nie jest odpowiednio sprawny? Celem przedstawianego cyklu prac było zbadanie zagrożenia legionelozą w Polsce poprzez poznanie: 1. potencjału chorobotwórczego szczepów Legionella pneumophila izolowanych z systemów wodnych; 2. określenie korelacji między występowaniem bakterii L. pneumophila w środowisku a obecnością przeciwciał u osób narażonych np. personelu szpitala; 3. różnicowanie swoistej odpowiedzi na zakażenie tymi bakteriami od reakcji nieswoistych lub krzyżowych; oraz 4. analizę danych z nadzoru w Polsce na tle sytuacji epidemicznej legionelozy w Europie. Badania te obejmowały 4 równoległe bloki tematyczne. Zagadnienie 1. Analiza zagrożenia zakażeniem bakteriami L. pneumophila na podstawie wyników typowania genetycznego oraz antygenowego szczepów wyizolowanych z systemów wodnych w placówkach opieki medycznej. Wyniki dotyczące tego zagadnienia przedstawiono m.in. w poniższych pracach: (1) Pancer K. Sequence-based typing of Legionella pneumophila strains isolated from hospital water distribution systems as a complementary element of risk assessment of legionellosis in Poland. AAEM 2013, 20: (2) Pancer K et al. Persistent colonization of 2 hospital water supplies by L. pneumophila strains through 7 years: sequence based typing and serotyping as useful tools for a complex risk analysis. AAEM 2013,20: (3) Pancer K et al. Sequence based typing and pre-absorption test in retrospective analysis of a pseudo-outbreak of Legionella infections differentiates true cases of legionellosis. AAEM 2012, 19: (4) Pancer K et al. Mikrobiologiczna ocena zagrożenia legionelozą oraz zastosowanie metody eliminacji Legionella pneumophila z sieci wodnych budynków szpitalnych. Przegl Epidemiol, 2008; 62: Państwowy Zakład Higieny (PZH) został w 2010r. przemianowany na Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny, NIZP-PZH 5 z 32

6 Ze względu na zgłaszane w ramach EWGLI przypadki legionelozy wiązanej z pobytem obcokrajowców w hotelach lub sanatoriach w Polsce, nasza uwaga była skierowana przede wszystkim na określenie zagrożenia zakażeniem bateriami L. pneumophila w hotelach i placówkach opieki medycznej. Na przełomie XX i XXI wieku nastąpiła istotna zmiana w podejściu naukowców do problemu czynników wywołujących legionelozę. Uznano, że zachorowania mogą być spowodowane nie tylko przez bakterie L. pneumophila sg1, ale także przez te należące do serogrup Szczególnie często są one czynnikiem zakażeń szpitalnych w regionie Europy Środkowej (Helbig i wsp r.). Z tego względu podjęto w NIZP-PZH badania ukierunkowane na wykrywanie i różnicowanie bakterii Legionella sp. występujących w systemach wody ciepłej w szpitalach, sanatoriach i innych placówkach opieki medycznej. Celem badań było opracowanie algorytmu pozwalającego ocenić zagrożenie zakażeniem bakteriami L. pneumophila na podstawie różnicowania/typowania wyizolowanych szczepów. W pierwszym etapie badań analizę zagrożenia przeprowadzono w dwóch dużych szpitalach (>500 łóżek) w okresie 7 lat ( ). W tym czasie pobrano 134 próbki wody i wyizolowano bakterie L. pneumophila. Spośród wyizolowanych, wybrano losowo 105 szczepów, które typowano pod względem antygenowym z zastosowaniem panelu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw antygenom L. pneumophila i pozwalającym na wyróżnienie piętnastu serogrup (sg; od 1 do 15). Zastosowano także przeciwciała MAb1/3 wykrywające antygen 1/3, którego obecność uznawana jest za cechę wyróżniającą szczepy L. pneumophila o wyższym potencjale chorobotwórczym (tzw. Panel Dresden ). Szczepy określone jako sg1 były dalej typowane w celu określenia ich przynależności do jednej z wyróżnionych podgrup: Knoxville, Philadelphia, Benidorm, France/Allentown, OLDA, Oxford, Bellingham, Heysham, Camperdown. W kolejnym etapie, wybrano na podstawie miejsca izolacji oraz właściwości antygenowych, 53 szczepy, które zostały zsekwencjonowane wg. schematu przyjętego przez EWGLI. Na podstawie sekwencji fragmentów 7 genów określano allele i dzięki dostępowi do bazy SBT EWGLI ustalano typ sekwencyjny (ST). Dodatkowo zbadano obecność genu kodującego toksynę RTX (rodzina repeats-in-toxin), której ekspresja wiązana jest ze zjadliwością bakterii. W wyniku analizy uzyskanych wyników stwierdzono: 1. wysokie zróżnicowanie szczepów L. pneumophila oraz 2. znacznie większą różnorodność genetyczną niż antygenową badanych szczepów. Wśród wyizolowanych szczepów wyróżniono także 4 o nieznanej do tej pory konfiguracji alleli i zgłoszono nowe typy sekwencyjne do bazy SBT EWGLI. 3. wykazano występowanie w instalacjach wodnych tych dwóch szpitali szczepów L. pneumophila o różnych właściwościach. Było to możliwe dzięki zastosowaniu łącznie różnych metod typowania pałeczek L. pneumophila. W szpitalu nr I stwierdzono trwałe zasiedlenie trzema spośród 7 wyróżnionych w tej placówce szczepów L. pneumophila. Były to szczepy L. pneumophila sg6, ST114; L. pneumophila sg6 ST835 i L. pneumophila sg3, ST87. Pozostałe 4 scharakteryzowane szczepy występowały nielicznie i okresowo. Szczep sg6 ST959 (nowo opisany) wykazywał obecność genu kodującego toksynę RTX. Zmiana kompozycji izolowanych szczepów mogła być związana z losowym doborem szczepów, jak również mogła być wynikiem prowadzonych procedur dezynfekcyjnych, które choć częściowo lub czasowo eliminowały/redukowały poszczególne szczepy L. pneumophila. Natomiast w szpitalu nr II wyróżniono tylko cztery szczepy, które jednak trwale kolonizowały system wodny, w tym należący do uznawanej za najgroźniejszą, serogrupy1. 4.Helbig JH et al. Pan-European study on culture-proven Legionnaires' disease: distribution of Legionella pneumophila serogroups and monoclonal subgroups. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002,21: z 32

7 Wyizolowane szczepy zostały określone jako: L. pneumophila sg1 subgrupa OLDA, ST1 i RTX+; L. pneumophila sg3 ST992; L. pneumophila sg3 ST87 i L. pneumophila sg6 ST114. Wyniki te wskazują na możliwość wieloletniego kolonizowania systemu wody ciepłej przez pałeczki L. pneumophila, nawet przy wprowadzaniu metod mających na celu ograniczenie liczby tych bakterii (jak widać -nieskutecznych). Rozszerzona analiza ryzyka (oparta o typowanie szczepów i badania mikrobiologiczne próbek wody) zakażeniem bakteriami L. pneumophila w obu szpitalach wykazała znaczne różnice - mimo podobnych wartości ogólnej liczby Legionella sp. wykrywanych w próbkach wody. W związku ze stałym zasiedleniem szczepem L. pneumophila sg1 OLDA ST1 posiadającym gen kodujący toksynę RTX, zagrożenie zakażeniem szpitalnym w szpitalu nr II było znacznie większe niż w szpitalu nr I. Szczepy te bowiem występują na całym świecie i są uznanym czynnikiem zakażeń człowieka, szczególnie zakażeń szpitalnych. Informacja o takim zagrożeniu powinna spowodować przeanalizowanie w szpitalu nr II: 1. przypadków atypowego zapalenia płuc, których czynnik etiologiczny nie został określony, a objawy pojawiły się w trakcie hospitalizacji; 2. zastosowanych dotychczas metod dezynfekcji i ograniczeń w zakresie możliwych do zastosowania innych procedur dezynfekcyjnych (np. materiał z którego wykonane są rury itp.); 4. Możliwych do zastosowania zmian w utrzymaniu systemu wody ciepłej (np. podwyższenie temperatury wody ciepłej z 45 C do 60 C) lub ewentualnych zmian konstrukcyjnych (np. odcięcie nieużywanych odnóg). Ocenę zagrożenia z zastosowaniem analizy metod genotypowania oraz typowania antygenowego L. pneumophila w oparciu o analizę danych bazy SBT EWGLI przeprowadzono następnie dla większej liczby szpitali w Polsce. Ogółem przebadano 111 szczepów L. pneumophila wyizolowanych z instalacji wodnych 10 szpitali w różnych regionach Polski. Szczepy scharakteryzowano przy użyciu opisanych powyżej metod sekwencjonowania, różnicowania genetycznego oraz antygenowego. Podobnie jak we wcześniejszych badaniach, stwierdzono większe zróżnicowanie genetyczne niż antygenowe izolowanych szczepów. Wśród badanych szczepów wyróżniono 6 różnych serogrup: 1,2,3,6,10,12 oraz 19 typów sekwencyjnych (ST), w tym 7 opisanych po raz pierwszy. Wśród szczepów L. pneumophila sg 1 wyróżniono 5 typów genetycznych: ST1, ST42, ST59, ST152 oraz nowy ST960. Wyróżniono także 5 podgrup antygenowych, w tym uznawane za najbardziej chorobotwórcze: Philadelphia i Benidorm; średnio chorobotwórcze: OLDA i OLDA/Oxford oraz o niskim potencjale chorobotwórczym: Camperdown. Szczepy te ogółem występowały w 6 szpitalach. Przeprowadzono analizę danych EWGLI dotyczącą: 1. częstości izolowanych na świecie poszczególnych genotypów L. pneumophila; materiału z jakiego były one izolowane (próbka kliniczna vs. środowiskowa) oraz występowania związku z zachorowaniem na chorobę legionistów (czynnik zakażenia lub szczep wyizolowany w trakcie dochodzenia epidemiologicznego lub szczep izolowany w ramach innych badań). Następnie porównano uzyskane dane z wynikami prezentowanych badań. Stwierdzono, że w bazie EWGLI najwyższy odsetek szczepów, izolowanych jako czynnik zachorowania ludzi w Europie i na świecie, obserwowany jest dla genotypu 42 (ponad 75%). W Polsce szczep zaliczany do ST42 był przyczyną wystąpienia ogniska szpitalnego i śmierci 3 osób. Kolejnymi genotypami, które w ponad 30% przypadków wiązane są z zakażeniami ludzi oraz często izolowane w trakcie dochodzenia w ognisku szpitalnym, to ST1 oraz ST59. W naszych badaniach typ ST1 OLDA obecny był w systemach wodnych 2 szpitali, natomiast ST59 Camperdown w 1 szpitalu. Spośród innych wyizolowanych szczepów zaliczanych do serogrupy 1, najmniej przypadków klinicznych wiązanych jest ze szczepem ST152, ale izolowany jest on często z próbek wody w trakcie dochodzenia epidemicznego w szpitalach w Europie. 7 z 32

8 Spośród innych szczepów L. pneumophila występujących dość powszechnie w Europie i na świecie i powodujących zakażenia u ludzi, stwierdzono występowanie L. pneumophila sg6 ST114 w 3 szpitalach, oraz L. pneumophila sg3 ST87 w 4 szpitalach. Oba te genotypy izolowane były w różnych regionach, także w Rosji. Inne opisane uprzednio genotypy zgłaszane były do bazy SBT EWGLI z mniejszą częstością, choć także jako czynnik etiologiczny legionelozowego zapalenia płuc. Szczepy należące do genotypów ST81 i ST421 zgłaszane były jako czynnik choroby legionistów nabytej w szpitalu (HAP- LD). W moich badaniach obecne one były w 3 szpitalach. Na podstawie uzyskanych wyników można określić zagrożenie jako najwyższe w szpitalu J (ST42 sg1 Benidorm; ST87 oraz ST957 o nieznanym potencjale), następnie w kolejności malejącej: szpital E (ST152 OLDA/Oxford; ST960 Philadelphia; ST421), szpital K (ST1 OLDA), szpital C (ST1 OLDA; ST87, ST114 i nowy ST992). Dalszej analizy wymaga sytuacja w szpitalu D gdzie stwierdzono obecność L. pneumophila sg1 Camperdown ST152 - konieczne byłoby określenie obecności markerów zjadliwości takich jak toksyna RTX, system transportu typu IV (geny dot/icm, lvh) i in. Należy jednak uwzględnić w analizie obecność także szczepów ST114 w instalacji wodnej szpitala D dość powszechnie wykrywanych także w przypadkach zakażeń człowieka. Wyniki prezentowanych prac wskazują, że ocena zagrożenia zakażeniem bakteriami L. pneumophila w szpitalu powinna zostać rozszerzona - jeśli wyniki badań próbek wody wskazują na możliwą kolonizację systemu wodnego tymi bakteriami lub gdy analiza przypadków atypowych zapaleń płuc wykaże wzrost liczby przypadków lub wzrost zużycia antybiotyków aktywnych przeciw tym bakteriom (głównie fluorochinolony). Wskazanie prawdopodobnego zagrożenia zakażeniem bakteriami L. pneumophila powinno znaleźć odzwierciedlenie w możliwości i zakresie diagnostyki mikrobiologicznej. Metody typowania genetycznego znalazły także zastosowanie w retrospektywnej analizie podejrzenia wystąpienia ogniska zakażenia szpitalnego na przełomie roku. W szpitalu tym diagnostykę zakażeń L. pneumophila opierano wyłącznie o badania PCR. W okresie od czerwca 2009r. do kwietnia 2010r. uzyskano wynik dodatni w >90% oznaczeń. Wykazano, że przyczyną tak wysokiego odsetka wyników dodatnich było stosowane odczynników, które uległy skażeniu DNA Legionella sp. Moim zadaniem było stwierdzenie czy wyniki dodatnie badań PCR były jedynie efektem skażenia odczynników, czy występowały zakażenia u ludzi; a jeśli tak, to czy były to zakażenia z tego samego źródła. Jedynym dostępnym materiałem do badań były próbki surowicy pacjentów. Z próbek tych wyizolowano DNA i wykonano oznaczenia w kierunku L. pneumophila poszukując genu kodującego jednostkę rybosomalną 16S RNA. W 7-miu próbkach, w których uzyskano wynik dodatni, przeprowadzono sekwencjonowanie tą samą metodą, jaką zastosowano do genotypowania szczepów środowiskowych. Możliwość przeprowadzenia sekwencjonowania bezpośrednio w próbce materiału klinicznego była wówczas przedmiotem badań prowadzonych w ramach EWGLI. U jednego pacjenta uzyskano pełen typ sekwencyjny ST36. U pozostałych pacjentów otrzymano jednoznaczne wyniki sekwencjonowania tylko niektórych genów (np. 5 spośród 7), ale analiza tych wyników wskazuje na co najmniej 3 różne szczepy L. pneumophila, które były przyczyną zachorowania pacjentów. Wykluczono tym samym, że wszyscy ci pacjenci ulegli zakażeniu wywołanemu przez jeden szczep L. pneumophila. Jednocześnie potwierdzono tezę o dość powszechnym występowaniu narażenia na zakażenie tymi bakteriami, które wykazują znaczne zróżnicowanie. W Polsce pierwsze opisane ognisko zakażenia szpitalnego L. pneumophila wystąpiło w grudniu 2006r. na oddziale okulistycznym. Po włączeniu naszego zespołu w dochodzenie epidemiologiczne potwierdzono zakażenie u 4 osób (3 osoby zmarły). W systemie wodnym szpitala wykryto szczep L. pneumophila sg1, który został następnie 8 z 32

9 Autoreferat Katarzyna Pancer: Zagrożenie legionelozą jako zdrowotny problem także w Polsce scharakteryzowany jako Benidorm ST42 czyli szczep o wysokim potencjale chorobotwórczym. Na podstawie przeprowadzonej wówczas przez nasz zespół analizy mikrobiologicznego zagrożenia opracowano zalecenia dla Ministra Zdrowia, które stały się podstawą Rozporządzenia MZ z dnia 29 marca 2007r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (Dz. U. nr 61, poz. 417 z późn. zm.), wprowadzającej obowiązek monitorowania obecności Legionella sp.. Począwszy od 2008r. występowanie pałeczek Legionella sp. w środowisku wodnym systemów wodnych szpitali i innych budynków użyteczności publicznej w Polsce jest dość dobrze poznane dzięki wejściu w życie wspomnianego Rozporządzenia MZ. Zakres obowiązków i wymagań w zakresie monitorowania jakości wody przeznaczonej do spożycia zostały następnie rozszerzone w Rozporządzeniu MZ z dnia 13 listopada 2015 (Dz.U.2015, poz.1989). Badania wykonywane zgodnie z powyższymi rozporządzeniami pozwalają określić liczbę tych bakterii i wstępnie - stopień zasiedlenia systemu wodnego. Na tej podstawie Państwowa Inspekcja Sanitarna ocenia zagrożenie zakażeniem pałeczkami Legionella sp. w danym budynku/placówce. Stopień zasiedlenia oraz liczba Legionella jtk w 100 ml są ważnymi parametrami oceny stanu utrzymania danego systemu wodnego, ale jednak nie pozwalają na pełniejsze oszacowanie ryzyka. Jak wykazano w prezentowanych badaniach, dopiero uzupełnienie informacji o dane nt. obecności i udziale L. pneumophila sg1 wśród wyizolowanych szczepów, obecności bakterii należących do innych grup serologicznych, charakterystyka genetyczna w postaci typu sekwencyjnego oraz zdolność do wytwarzania toksyn pozwalają na pełniejszą analizę zagrożenia zakażeniem tymi bakteriami oraz ocenę ryzyka wystąpienia zachorowania w danej placówce. Wnioski: 1. W Polsce, podobnie jak w innych krajach Europy, występują szczepy L. pneumophila o właściwościach wskazujących na podwyższony lub wysoki potencjał chorobotwórczy (np. L. pneumophila należące do grupy serologicznej 1, podgrupy Benidorm, genotypu ST42). 2. Wysoka różnorodność szczepów L. pneumophila izolowanych ze środowiska oraz trwałe zasiedlanie przez poszczególne szczepy instalacji wodnych wskazuje na powszechne występowanie tych bakterii w naszym środowisku. Wydaje się, że jednymi z najpowszechniejszych typów są L. pneumophila sg3 i sg6. 3. Ryzyko zakażenia bakteriami L. pneumophila może być całkowicie różne w różnych budynkach, pomimo uzyskania bardzo podobnych wyników mikrobiologicznych oznaczeń w próbkach wody wykonanych zgodnie z Rozp. MZ z dnia 13 listopada 2015r. 4. Ocena zagrożenia legionelozą w placówkach opieki medycznej, ze względu na obecność osób w immunosupresji, nie może być prowadzona wyłącznie na podstawie wyników obowiązkowych badań mikrobiologicznych próbek wody zgodnie z Rozp.MZ z dnia 13 listopada 2015r. Wskazane byłoby co najmniej określanie obecności i udziału bakterii L. pneumophila sg1. Ponadto należy analizować wszystkie przypadki atypowego zapalenia płuc oraz zapewnić możliwość wykonania badań diagnostycznych co najmniej 2 różnymi metodami. Zagadnienie 2. Zasiedlenie instalacji wodnej przez bakterie L. pneumophila a obecność przeciwciał u osób narażonych na zakażenie. Wyniki dotyczące tego zagadnienia przedstawiono m.in. w poniższych pracach: (5) Pancer K et al. The influence of contamination of a hospital hot-water system with Legionella pneumophila on serum antibody production by staff members. Indoor Built Environ, 2006; 15: (6) Pancer K et al. Hospital tap water system as a source of nosocomial Legionella infections for staff members and patients. Indoor Built Environ., 2003; 12: z 32

10 Oznaczenia serologiczne w latach poprzedzających prezentowane badania prowadzone były wyrywkowo w wybranych grupach i miały na celu przede wszystkim określenie ryzyka zawodowego. Ze względu na dostępność testów diagnostycznych większość tych badań dotyczyła wykrywania przeciwciał IgM i IgG lub IgM+IgG skierowanych tylko przeciw L. pneumophila sg1. Jednak w badaniach próbek wody, prowadzonych w ramach projektów naukowych i inicjowanych przez EWGLI dochodzeń epidemicznych w miejscach wskazanych jako prawdopodobne źródło zakażenia obcokrajowca, izolowano głównie L. pneumophila należące do grup serologicznych Konieczne stało się więc opracowanie systemu badań serologicznych w podejrzeniu legionelozy, wywołanej bakteriami L. pneumophila sg1 oraz L. pneumophila sgs Celem tego zadania było zbadanie: 1. powszechności występowania przeciwciał przeciw bakteriom Legionella u zdrowych osób; 2. związku między zasiedleniem systemu wodnego tymi bakteriami a obecnością przeciwciał anty-l.pneumophila u osób narażonych. Badania powszechności występowania przeciwciał wykonywano u zdrowych pracowników szpitali i sanatorium oraz dawców krwi. Jako metodę wybrano test mikroaglutynacji (MAT) pozwalający na ilościowe określenie humoralnej odpowiedzi dla poszczególnych grup serologicznych L. pneumophila i innych gatunków Legionella sp. wyrażonej w postaci miana surowicy. Badania wykonano z zastosowaniem antygenów uzyskanych ze szczepów referencyjnych z kolekcji ATCC: szczepów L. pneumophila należących do 15 grup serologicznych (sgs 1-15) i szczepów 4 innych gatunków Legionella: L. micdadei, L. bozemanii, L. jordanis i L. anisa. Na podstawie analizy statystycznej wyników w grupie dawców krwi wyznaczano osobno dla każdego antygenu poziom odcięcia. Miano uznawane za znamienne wahało się od 1:64 (np. dla L. pneumophila sg 1, sg 2, sg4, sg10 i in.) poprzez 1:128 (dla L. pneumophila sg3, sg7, L. micdadei i in.) do 1:256 (np. dla L. pneumophila sg 6, sg12, L. bozemanii i L. anisa). Zgodnie z zaleceniami EWGLI potwierdzeniem legionelozy było wykazanie w badaniu kolejnej próbki surowicy co najmniej 4-krotnego wzrostu miana przeciwciał, ale z założeniem że co najmniej jeden z porównywanych wyników osiągnął wartość 1:128 (lub punkt odcięcia gdy cut-off >1:128). Opracowaną metodę zastosowano także do oznaczania poziomu przeciwciał dla L. pneumophila sgs 1-15 i 4 gatunków Legionella sp. w próbkach surowicy pobranych od pacjentów z zakażeniem dróg oddechowych hospitalizowanych w jednym ze szpitali, którego personel był również badany. Ogółem wykonano 4314 oznaczeń, a wynik dodatni stwierdzono w 2,56% oznaczeń w próbkach od dawców krwi oraz 3,7% od pracowników szpitali i pacjentów. Na podstawie tych badań stwierdzono, że odpowiedź dla L. pneumophila sg 6, sg3 i sg12 występuje we wszystkich badanych grupach na zbliżonym poziomie (brak znamiennych różnic) co może sugerować przebyte zakażenia tymi bakteriami, w tym także zakażenie bezobjawowe. Wyniki te znajdują odzwierciedlenie we wcześniej prezentowanej analizie charakterystyki środowiskowych szczepów L. pneumophila. Stwierdzono bowiem dość powszechne występowanie bakterii L. pneumophila należących do grupy serologicznej 3, 6 w instalacjach wodnych szpitali. W celu zbadania wpływu zasiedlenia przez bakterie L. pneumophila systemu wodnego na wytwarzanie przeciwciał przez osoby narażone, wykonano badanie testem MAT (tak jak wyżej opisano) w grupie pracowników szpitali i sanatorium - ale z zastosowaniem antygenów uzyskanych ze szczepów tzw. środowiskowych L. pneumophila sgs czyli wyizolowanych z instalacji wodnej jednej z placówek. Do badań wybrano losowo 4 szczepy L. pneumophila sgs 2-14 wyizolowane z jednego systemu wody ciepłej. Stwierdzono istotny wpływ skażenia systemu wodnego bakteriami L. pneumophila na poziom przeciwciał u osób narażonych w tym wypadku pracowników 10 z 32

11 Autoreferat Katarzyna Pancer: Zagrożenie legionelozą jako zdrowotny problem także w Polsce szpitala lub sanatorium. Wykazano wytwarzanie przez osoby narażone przeciwciał na zróżnicowanym poziomie w stosunku do badanych szczepów środowiskowych L. pneumophila sg Stwierdzono także, że u niektórych osób odpowiedź na jeden spośród badanych szczepów środowiskowych była znacznie wyższa niż na pozostałe (np. miano 1:512), ale reakcja ta nie była jednakowa u wszystkich pracowników danej placówki. Poszczególne osoby reagowały w różny sposób, co mogło być spowodowane m.in. różnym stopniem narażenia związanym z wykonywanymi obowiązkami, przebywaniem w pomieszczeniach o szczególnie wysokim natężeniu skażonego aerozolu wodno-powietrznego, lub zakażeniem w innym miejscu itp.. Bardzo ważnym było stwierdzenie, że odpowiedź personelu na te same szczepy środowiskowe oraz szczepy referencyjne była różna w różnych placówkach, co wskazuje na zróżnicowane zagrożenie związane z poszczególnymi typami L. pneumophila. W niektórych placówkach widoczny był wyraźny wzrost wytwarzania IgM i IgG przez pracowników w odpowiedzi na antygeny charakterystyczne tylko dla jednej serogrupy. Stwierdzona częsta i znamiennie wyższa odpowiedź na antygeny L. pneumophila sg7 w jednym spośród badanych szpitali może wskazywać na narażenie pracowników na zakażenie bakteriami należącymi do grupy serologicznej 7. Zakażenia te mogły być w większości bezobjawowe lub o łagodnym, grypo-podobnym przebiegu. Natomiast w innych placówkach wyniki już nie były tak jednoznaczne obserwowano występowanie przeciwciał skierowanych przeciw kilku różnym serogrupom np. dla sg 12 i sg 2, co mogło być m.in. związane z odpowiedzią na zróżnicowane narażenie (np. w wielu różnych miejscach), lub z uprzednim zakażeniem wywołanym przez bakterie L. pneumophila. Uzyskane wyniki potwierdzają znacznie częstsze niż uprzednio sądzono narażenie ludzi na zakażenie bakteriami L. pneumophila. Takie zakażenie bezobjawowe lub objawowe ale nierozpoznane, znajduje odbicie w wytwarzaniu przeciwciał przeciw danemu typowi bakterii. Na podstawie badań seroprewalencji można także wskazać zagrożenie, jakie występuje w środowisku danej grupy, w miejscu pracy itp. Należy także zauważyć, że przeciwciała powstałe przy wcześniejszym zakażeniu mogą utrudnić diagnostykę w przypadku kolejnego zakażenia. Wnioski: 1. W naszym środowisku życia, pracy, wypoczynku, leczenia mamy dość powszechny kontakt z bakteriami L. pneumophila sgs 2-14, w szczególności sg 3, sg 6 i sg Narażenie pracowników na zakażenie bakteriami L. pneumophila jest różne w poszczególnych placówkach/obiektach i zależy od zasiedlających je szczepów oraz przebywania w pomieszczeniach o różnym stopniu skażenia oraz przeprowadzania różnych procedur medycznych lub porządkowych (zakres obowiązków itp.). 3. Dzięki wyznaczeniu punktów odcięcia, osobno dla każdego antygenu/szczepu L.pneumophila i Legionella sp. w teście MAT, możliwe było zastosowaniu tego testu do badań diagnostycznych oraz określania seroprewalencji. Zagadnienie 3. Różnicowanie swoistej odpowiedzi na zakażenie bakteriami L. pneumophila sg1 i sgs 2-14 od reakcji nieswoistych lub krzyżowych. Wyniki dotyczące tego zagadnienia przedstawiono m.in. w poniższych pracach: (3) Pancer K et al. Sequence based typing and pre-absorption test in retrospective analysis of a pseudo-outbreak of Legionella infections differentiates true cases of legionellosis. AAEM 2012, 19: (7) Pancer KW. Problem of immunoglobulin M co-detection in serological response to bacterial and viral respiratory pathogens among children suspected of legionellosis. Cent Eur J Immunol. 2015, 40: (8) Pancer KW. Cross-reactions in IgM ELISA tests to Legionella pneumophila sg1 and Bordetella pertussis among children suspected of legionellosis; potential impact of vaccination against pertussis? Cent Eur J Immunol. 2015, 40: (9) Pancer K. Wiek pacjentów a dynamika swoistych IgM u osób zakażonych L.peumophila sg1. Przegl Epidemiol 2014, 68, z 32

12 Jak wykazano wcześniej, przebywanie w środowisku gdzie występuje aerozol wodno-powietrzny skażony bakteriami L. pneumophila, powoduje zakażenia, które mogą pozostać niezauważone z uwagi na łagodne i nietypowe objawy chorobowe np. zmęczenie, bóle głowy lub przypominających przeziębienie. Śladem tych zakażeń jest obecność przeciwciał dla L. pneumophila. Jednak u części osób narażonych na skażony aerozol, dochodzi do zakażenia o znacznie poważniejszych objawach 5 co wymaga wykonania badań diagnostycznych. W takich przypadkach odpowiedź na wcześniejsze, często nierozpoznane zakażenie bakteriami Legionella sp. może powodować problemy z interpretacją wyników badań serologicznych. Z tego względu wprowadzenie serologicznej diagnostyki legionelozy w Polsce wymagało dokładnego poznania tzw. tła serologicznego, charakterystyki pacjentów, a także najważniejszych czynników wpływających na interpretację wyników. Test Mikroaglutynacji charakteryzujący się wysoką swoistością (>90% jeśli badane są 2 próbki), ale stosunkowo niską czułością jest bardzo pracochłonny i czasochłonny ponieważ wymaga przygotowywania antygenów. Pociąga to za sobą konieczność dołączania wielu kontroli oraz walidacji każdej partii antygenów. Alternatywą stały się komercyjne zestawy ELISA do wykrywania IgM i IgG. Koniecznym stało się więc przeprowadzenie analizy wyników uzyskanych metodą ELISA w celu różnicowania swoistej odpowiedzi chorych na bieżące zakażenie L. pneumophila od odpowiedzi na poprzednie zakażenia jak również eliminację ewentualnych nieswoistych reakcji. Wyróżniono następujące problemy: 1. Czy przeciwciała przeciw bakteriom L. pneumophila występują u pacjentów w każdym wieku czy też, jak wskazywałyby dane EWGLI/ELDSNet 6, głównie u dorosłych mężczyzn w wieku 50+? 2. Czy dynamika przeciwciał jest taka sama u dorosłych i u dzieci? 3. Czy są to przeciwciała swoiste dla L. pneumophila? Problem 1. Występowanie przeciwciał klasy M lub G przeciw L. pneumophila sg1 w zależności od wieku pacjentów. W tym celu analizie poddano wyniki serologicznych oznaczeń uzyskanych w ramach badań naukowych oraz rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej w kierunku legionelozy prowadzonej w PZH w latach W okresie tym oznaczenia wykonano u 574 pacjentów (w 658 próbkach surowicy), w tym 270 dzieci oraz 304 osób dorosłych. Wyróżniono 7 grup wiekowych: < 2lata, 2-4 lata, 5-9 lat, lat, lat, lat oraz 60+lat. Potwierdzono występowanie przeciwciał klasy IgM przeciw L. pneumophila we wszystkich grupach wiekowych, zarówno u dzieci, jak i osób dorosłych na podstawie uzyskanych dodatnich wyników oznaczeń testem ELISA (anti-l. pneumophila sg1 IgM). Ogółem wynik dodatni stwierdzono u 22,9% badanych. Najniższy odsetek wyników dodatnich IgM występował w grupie dzieci poniżej 2 lat (7,1%), natomiast najwyższy w grupie wiekowej lat (32,5%). Zaobserwowano jednak istotne różnice w poziomie IgM w zależności od wieku: najniższy odnotowano w grupie dzieci najmłodszych (<2 r.ż.) oraz u osób najstarszych (60+r.ż.) i odbiegał on od wyników uzyskanych w pozostałych grupach wiekowych. Analiza statystyczna wyników potwierdziła znamienne różnice poziomu przeciwciał w klasie IgM w zależności od wieku pacjentów (test Mood s Median). Natomiast obecność IgM najczęściej obserwowano u tzw. młodych dorosłych czyli osób 5 Pancer K. Legionelozowe zapalenie płuc czynniki ryzyka zachorowania, charakterystyczne objawy kliniczne. Przegląd Epidemiologiczny 2010,64: W 2010r. utworzono przy ECDC do celów nadzoru epidemiologicznego ELDSNet na bazie EWGLI. W 2012r. na bazie EWGLI utworzono ESGLI = grupę skupiającą ekspertów do spraw Legionella sp. w ramach ESCMID. 12 z 32

13 w wieku lat, co może wskazywać na największe narażenie tej grupy wiekowej na zakażenie L.pneumophila. Tymczasem obecność przeciwciał w klasie IgG dla L. pneumophila sg1 obserwowano u osób dorosłych i u dzieci, z wyłączeniem najmłodszych, poniżej 2 r.ż. Metodami analizy statystycznej nie potwierdzono jednak znamiennych różnic poziomów przeciwciał IgG w zależności od wieku. Ogółem obecność IgG dla L. pneumophila sg 1 wykryto w 8% próbek surowic (335 badanych), w tym u dzieci w wieku 2-4r.ż. ( 8,8%). W przeciwieństwie do przeciwciał w klasie IgM, obecność swoistych IgG najczęściej wykrywano u osób dorosłych w wieku 40+, a ich poziom był najwyższy u osób najstarszych. Wnioski: 1. Zakażenie bakteriami L. pneumophila może wystąpić u każdej osoby, niezależnie od wieku. 2. Obserwowany wyższy poziom przeciwciał w klasie IgG u osób dorosłych powyżej 40 r.ż., prawdopodobnie jest wynikiem kolejnych zakażeń i może wskazywać na występowanie zakażeń bezobjawowych. Problem 2. Analiza dynamiki przeciwciał IgM w zależności od wieku W celu oceny dynamiki przeciwciał IgM dla L. pneumophila sg1 analizowano wyniki oznaczania poziomu IgM dla L. pneumophila sg 1 w próbkach surowic 77 pacjentów, w tym 44 dorosłych i 33 dzieci, od których uzyskano do badań więcej niż 1 próbkę surowicy. Serokonwersję czyli zmianę poziomu IgM z ujemnego na dodatni (lub odwrotnie) stwierdzono u 12 osób (dorosłych i dzieci). Ponieważ dwukrotny przyrost/spadek absorbancji w teście ELISA wielu badaczy uznaje za znamienny i potwierdzający zakażenie, poszukiwano też takiej zmiany wśród próbek surowic bez wykazanej serokonwersji. Jednocześnie, przyjęto ograniczenie, że za znamienną zmianę poziomu IgM można uznać tylko taką, gdy co najmniej jeden z wyników mieścił się w zakresie wartości granicznych lub dodatnich (np. oba wyniki dodatnie lub zmiana graniczny/dodatni). Ogółem u 18 pacjentów wykazano serokonwersję lub co najmniej 2-krotny przyrost poziomu IgM w teście ELISA (12 dzieci i 6 dorosłych). Nie stwierdzono różnicy w zależności od wieku pacjenta w obserwowanym przyroście IgM - przedstawianym jako wielokrotność pierwszego wyniku. Natomiast stwierdzono istotną różnicę w dynamice IgM w badaniach dzieci i dorosłych. Wykazano bowiem znamienną zależność między odstępem w pobraniu drugiej próbki surowicy a poziomem IgM (analiza zmiany IgM w funkcji czasu) w związku z wiekiem chorego. U dzieci najwyższą zmianę poziomu IgM (przyrost lub spadek) obserwowano gdy odstęp między pobraniem próbek wynosił 1,5-2,0 tygodni, natomiast maksymalny odstęp, umożliwiający interpretację wyników badań, oceniono na 4 tygodnie. Badania dynamiki IgM u dzieci sugerują możliwość uzyskania niejednoznacznych lub fałszywie ujemnych wyników w badaniu pary surowic pobranych w odstępie powyżej 4 tygodni od momentu zachorowania. Natomiast u dorosłych najwyższy przyrost/spadek IgM wykazano gdy odstęp pomiędzy pobraniem kolejnych próbek krwi wynosił ok. 3-4 tygodni, ale odstęp nie powinien przekraczać 6 tygodni. Analiza próbek pobranych w dłuższym odstępie mogła być obarczona błędem i powodować fałszywą interpretację przypadku. Wnioski: 1. Pierwsza próbka surowicy powinna zostać pobrana do badań możliwie jak najwcześniej; 2. Dynamika IgM w zakażeniach L. pneumophila różni się w zależności od wieku chorego - u dzieci krócej obserwuje się wysoki/podwyższony poziom IgM dla L. 13 z 32

14 pneumophila niż u dorosłych. Zjawisko to może wpływać na interpretację uzyskiwanych wyników badań serologicznych. 3. Odstęp pomiędzy pobraniem pierwszej i drugiej próbki surowicy do badań w kierunku legionelozy powinien być dostosowany do wieku pacjenta: u małych dzieci (<5r.ż.) odstęp nie powinien przekraczać 4 tygodni, najlepiej nie dłużej niż 2 tygodnie. U dorosłych możliwe jest pobranie kolejnej próbki do badań w większym odstępie niż u dzieci, najlepiej 3-5 tygodni. Problem 3. Analiza swoistości przeciwciał IgM wykrywanych testem ELISA W celu wykazania swoistości przeciwciał IgM dla L. pneumophila badania przeprowadzono w 2 etapach. W pierwszym etapie sprawdzano jak często możliwe jest uzyskanie wyników dodatnich w tej samej próbce surowicy przy zastosowaniu testów komercyjnych ELISA IgM dla L. pneumophila oraz innych patogenów wywołujących zakażenia dróg oddechowych. W drugim etapie badań - zaadaptowano i zmodyfikowano test pre-absorbcji surowicy do wykazania lub wykluczenia obecności w próbce swoistych przeciwciał Uzyskanie kilku wyników dodatnich w badaniu tej samej próbki surowicy przy zastosowaniu komercyjnych testów ELISA IgM: dla L. pneumophila oraz innych patogenów wywołujących zakażenia dróg oddechowych: Wykrycie w tej samej próbce surowicy przeciwciał IgM na wysokim poziomie (dodatnim lub granicznym wg. wskazań producenta testów) dla 2 lub więcej patogenów może wskazywać na współistniejące zakażenie, zakażenia występujące jedno po drugim lub nieswoiste reakcje. Badania te prowadzono w grupie 156-ciorga dzieci w wieku od 1 miesiąca do 17 lat - ze względu na częste w tym wieku zakażenia dróg oddechowych wymagające hospitalizacji. W próbkach surowic poszukiwano, z zastosowaniem testów komercyjnych ELISA, przeciwciał IgM dla L. pneumophila sg1 oraz wirusów: paragrypy typu 1-4, RSV, grypy A i B, adenowirusów oraz dla bakterii: Bordetella pertussis i Mycoplasma pneumoniae. Ogółem wynik dodatni IgM dla co najmniej jednego patogenu stwierdzono u 43 dzieci. Oceniono w analizie wieloczynnikowej rozkład uzyskanych wyników IgM, także w zależności od wieku badanych pacjentów. Znamiennie inny rozkład poziomu IgM u dzieci do lat 5 uzyskano w teście dla L. pneumophila sg1, B. pertussis oraz wirusów paragrypy typu 1-4. Ogółem w całej badanej grupie dzieci wykazano silną zależność między wiekiem pacjenta a odpowiedzią IgM dla B. pertussis (Po=0,0099) oraz dla L. pneumophila sg1 (Po=0,0375). Analizowano także uzyskane wyniki IgM w zależności od głównych objawów prezentowanych w trakcie zakażenia. U 23% dzieci z zapaleniem płuc stwierdzono wynik dodatni jedynie w teście wykrywającym zakażenie L.pneumophila sg1. Był to najczęściej wykrywany czynnik zapaleń płuc w tych badaniach. Współwystępowanie dodatnich wyników IgM dla więcej niż jednego patogenu stwierdzono u 16-ciorga dzieci, ale zjawisko to nie było związane z wiekiem chorych. Stwierdzono jednak, że u dzieci >9 r.ż. często współwystępowały wyniki dodatnie testów ELISA IgM dla L. pneumophila sg1 i B. pertussis, a u dzieci w wieku 4-9 r.ż. - dla L. pneumophila sg1 i M. pneumoniae Potwierdzenie swoistości dla L. pneumophila wykrywanych przeciwciał IgM: Ze względu na doniesienia nt. nieswoistych wyników różnych testów serologicznych szczególnie w zakażeniach B. pertussis, zdecydowano się sprawdzić wpływ takich reakcji na wynik testu ELISA IgM dla L. pneumophila sgs1-7. Dla potrzeb tego badania zmodyfikowano i zaadaptowano test pre-absorbcji surowicy z zastosowaniem antygenów uzyskanych ze szczepu wzorcowego L. pneumophila sg1 oraz szczepu B. pertussis. Wyselekcjonowano 22 próbki surowicy, które zostały podzielone na 4 części. W jednej - prowadzono proces pre-absorbcji antygenem L. pneumophila sg1, w drugiej antygenem B. pertussis, w trzeciej obydwoma antygenami. Natomiast czwarta część surowicy, 14 z 32

15 nieabsorbowana, wykorzystywana była jako odniesienie do określenia redukcji IgM w wyniku pre-absorbcji. Badania testem ELISA próbek pre-absorbowanych i nieabsorbowanych wykonywane były jednocześnie. Jeśli w próbce surowicy znajdowały się swoiste przeciwciała IgM dla L. pneumophila sg1 to w procesie pre-absorbcji z antygenem L. pneumophila sg1 powinny zostać one związane, a wynik w teście ELISA wykrywającym IgM dla L. pneumophila sgs 1-7 powinien być znacznie niższy niż w próbce tej samej surowicy ale nie pre-absorbowanej. Natomiast pre-absorbcja innym antygenem, w tym przypadku B. pertussis (tzw. antygenem heterogennym), nie powinna w znaczący sposób wpłynąć na wynik w stosunku do badania próbki bez etapu pre-absorbcji. Preabsorbcja mieszaniną obu antygenów, jeśli w próbce występowały przeciwciała swoiste dla któregoś z użytych antygenów, powinna spowodować niższą redukcję IgM niż w badaniu z jedynie homogennym antygenem, ale wyższą niż w badaniu z antygenem heterogennym. Walidację testu przeprowadzono wykorzystując otrzymane, w ramach współpracy ze Statum Serum Institute (Dania), zakodowane próbki surowic pobrane od pacjentów z potwierdzonym zakażeniem L. pneumophila wywołanym różnymi typami tych bakterii. Badania te prowadzono z wykorzystaniem antygenów referencyjnych szczepów L. pneumophila sg1, sg3, sg12 oraz B. pertussis i potwierdzono swoistość tej metody. Badania z zastosowaniem testu pre-absorbcji (z antygenem L. pneumophila sg1 i B. pertussis oraz obydwoma antygenami jednocześnie) wykonano w próbkach surowicy pobranych od 19 dzieci, u których co najmniej 1 test IgM ELISA był dodatni (spośród testów w kierunku L. pneumophila sgs1-7, B. pertussis, M. pneumoniae) oraz 3 dorosłych z potwierdzonym legionelozowym zapaleniem płuc (LD). Następnie wyliczono stosunek wartości uzyskanych w badaniu próbki pre-absorbowanej oraz nieabsorbowanej (Index) i poddano analizie jedno- i wieloczynnikowej. W wyniku analizy statystycznej określono graniczne wartości stosunku indeksów Lp1/Bp dla potwierdzenia obecności w próbce swoistych IgM dla L. pneumophila (stosunek Indeksu Lp/Indeks Bp 2) oraz B. pertussis (stosunek Indeksu Lp1/Indeks Bp 0,5). Jeśli redukcja IgM w teście dla L. pneumophila sg1 (indeks Lp1) była co najmniej dwukrotnie wyższa od poziomu redukcji IgM w teście dla B. pertussis (indeks Bp) to potwierdzało to obecność swoistych dla L. pneumophila sg1 przeciwciał w tej próbce. Wykazano występowanie różnic w zależności od wieku pacjentów w zakresie redukcji wykrywanych IgM dla obu patogenów: w grupie dzieci do lat 4 oraz dzieci starszych. Cechą charakterystyczną u dzieci <4r.ż. była znacznie wyższa redukcja poziomów IgM, w badaniach z obydwoma testami ELISA, po pre-absorbcji obydwoma antygenami razem (Lp1+Bp) niż po pre-absorbcji pojedynczym antygenem. Wskazuje to na istotny udział reakcji nieswoistych w otrzymywanym wyniku badania surowicy nieabsorbowanej. Wśród dzieci starszych takie zjawisko było obserwowane wyłącznie przy użyciu testów ELISA wykrywających IgM dla antygenów komórkowych B. pertussis. Ze względu na wyraźny związek między wiekiem chorych a występowaniem reakcji nieswoistych w badaniu poziomu IgM komercyjnymi testami ELISA z zastosowaniem antygenów komórkowych (także powierzchniowych), zwrócono uwagę na obowiązkowe szczepienia dzieci. Jednym z wyjaśnień tego zjawiska może być bowiem odpowiedź poszczepienna po obowiązkowym szczepieniu przeciw krztuścowi, prowadzonym u dzieci poniżej 2 r.ż. Dane w piśmiennictwie wskazują, że z powodu odpowiedzi po szczepieniu p/krztuścowi szczepionką zawierającą antygeny komórkowe, w okresie ok. 1 roku możliwe jest uzyskanie niewiarygodnych wyników w testach serologicznych wykrywających antygeny powierzchniowe bakterii krztuśca lub innych. Ogółem obecność przeciwciał IgM swoistych dla L. pneumophila sg1 potwierdzono metodą pre-absorbcji surowicy u 8-ga dzieci w wieku 4 lat oraz u 3 osób dorosłych. Analiza zastosowanych różnych metod diagnostycznych wykazała, że u tych pacjentów 15 z 32