RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186961 (13) B1 (21 ) Numer zgłoszenia: 327428 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 10.07.1998 (51) IntCl7 G01N 33/50 G01N 33/96 A61K 39/00 ( 5 4 ) Preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej i sposób otrzymywania preparatu krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.01.2000 BUP 01/00 (73) Uprawniony z patentu: Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa, Katowice, PL Grzywak-Kołodziejczyk Teresa, Katowice, PL Wieczorek Krystyna, Siewierz, PL Tohak Helena, Orzesze, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2004 WUP 04/04 (72) Twórcy wynalazku: Teresa Grzywak-Kołodziejczyk, Katowice, PL Krystyna Wieczorek, Siewierz, PL Helena Tohak, Orzesze, PL PL 186961 B1 (57) 1. Preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej, którymi są erytrocyty o odpowiednich antygenach grupowych, znam ienny tym, że zawiesina krwinek o stężeniu krwi około 4,5% lub około 10% wagowych zależnym od zastosow anej metody badań, które po w ystan daryzowaniu wzbogacono od 2 do 3% objętościowych soku aloesowego typu Aloe vera zawiera dodatek, co najmniej od 0,03 do 0,06% wagowych zasady purynowej, korzystnie adeniny jako stabilizatora zbuforowanej soli fizjologicznej, uzupełnionej przez dodatek antybiotyku z grupy am fenikoli, korzystnie detreom ycynę w ilości korzystnie 0,024% wagowych. 2. Sposób otrzym ywania preparatu krwinek w zorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej, którymi są erytrocyty o odpow iednich antygenach, przez przem yw anie osadu krwinek i um ieszczanie ich w płynie konserwującym, znam ien n y tym, że w prow adzonym sterylnie procesie, przem ywany zbuforow aną so lą fizjologiczną w w ielokrotnej objętości, co najmniej dwukrotnie osad krwinek o odpowiedniej grupie krwi w ilości wymaganej do uzyskania zawiesiny o stężeniu krwi około 4,5 lub około 10% wagowych zależnym od zastosowanej metody badań, zalewa się płynem określonym jako konserwujący w postaci zbuforowanej soli fizjologicznej, stabilizow anej i dodatkowo w yjałow ionej, przy czym do tej soli w prow adza się dodatek, co najmniej od 0,03 do 0,06% wagowych zasady purynowej, korzystnie adeniny, a przed wyjaławianiem dodaje się korzystnie 0,25 g/l antybiotyku z grupy amfenikoli, korzystnie detreomycyny, natomiast do zawiesiny krwinek po wystandaryzowaniu dodaje się soku aloesowego typu Aloe vera w ilości odpow iedniej dla uzyskania stężenia od 2 do 3% objętościowych.
Preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej i sposób otrzymywania preparatu krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej Zastrzeżenia patentowe 1. Preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej, którymi są erytrocyty o odpowiednich antygenach grupowych, znamienny tym, że zawiesina lawinek o stężeniu krwi około 4,5% lub około 10% wagowych zależnym od zastosowanej metody badań, które po wystandaryzowaniu wzbogacono od 2 do 3% objętościowych soku aloesowego typu Aloe vera zawiera dodatek, co najmniej od 0,03 do 0,06% wagowych zasady purynowej, korzystnie adeniny jako stabilizatora zbuforowanej soli fizjologicznej, uzupełnionej przez dodatek antybiotyku z grupy amfenikoli, korzystnie detreomycynę w ilości korzystnie 0,024% wagowych. 2. Sposób otrzymywania preparatu krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej, którymi są erytrocyty o odpowiednich antygenach, przez przemywanie osadu krwinek i umieszczanie ich w płynie konserwującym, znamienny tym, że w prowadzonym sterylnie procesie, przemywany zbuforowaną solą fizjologiczną w wielokrotnej objętości, co najmniej dwukrotnie osad krwinek o odpowiedniej grupie krwi w ilości wymaganej do uzyskania zawiesiny o stężeniu krwi około 4,5 lub około 10% wagowych zależnym od zastosowanej metody badań, zalewa się płynem określonym jako konserwujący w postaci zbuforowanej soli fizjologicznej, stabilizowanej i dodatkowo wyjałowionej, przy czym do tej soli wprowadza się dodatek, co najmniej od 0,03 do 0,06% wagowych zasady purynowej, korzystnie adeniny, a przed wyjaławianiem dodaje się, korzystnie 0,25 g/l antybiotyku z grupy amfenikoli, korzystnie detreomycyny, natomiast do zawiesiny krwinek po wystandaryzowaniu dodaje się soku aloesowego typu Aloe vera w ilości odpowiedniej dla uzyskania stężenia od 2 do 3% objętościowych. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że sok aloesowy otrzymuje się przykładowo z żelu aloesu typu Aloe vera przez przesączenie go w sposób jałowy do wyjałowionej butelki. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces standaryzacji krwinek prowadzi się do uzyskania wymaganego stężenia erytrocytów wynoszącego korzystnie w 10% zawiesinie krwinek od 0,40-0,45 x 1012/l, a dla 4,0% zawiesinie krwinek od 0,11-0,13 x 1012/l. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że objętość przemywającej zbuforowanej soli fizjologicznej stanowi co najmniej 10-krotną objętość osadu krwinek. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że dla zbuforowania soli fizjologicznej stosuje się płyn buforujący o poziomie odczynu ph co najmniej 6,7 dogodnie 6,8, którego korektę prowadzi się dogodnie za pomocą wodorotlenku sodu. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że sól fizjologiczną zbuforowaną stabilizowaną dodatkowo wyjaławia się w temperaturze co najmniej 120 C, pod ciśnieniem co najmniej 0,980665 x 10 1MPa w czasie około 15 min. 8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że osad krwinek wprowadza się do zbuforowanej soli fizjologicznej stabilizowanej o temperaturze najwyżej 37 C korzystnie 18 C i otrzymaną zawiesinę po wystandaryzowaniu zalewa się sokiem aloesowym typu Aloe vera, po czym w trakcie ciągłego mieszania korzystnie za pomocą magnesu wirującego wewnątrz naczynia umieszcza się w ampułce. * * *
186 961 3 Przedmiotem wynalazku jest preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w roztworze soli fizjologicznej i sposób otrzymywania preparatu krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej. Preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej stosuje się do wykrywania naturalnych regularnych i nieregularnych izoaglutynin w osoczu przy określeniu grup krwi układu ABO. Preparat krwinek wykorzystuje się w laboratorium lecznictwa zamkniętego i otwartego wykonujących badania immunohematologiczne, przykładowo: u kobiet w ciąży, u osób przed przetaczaniem krwi, u krwiodawców - w celu wykrycia i identyfikacji przeciwciał czerwonokrwinkowych. Wynikiem reakcji antygenu z przeciwciałem in vitro jest aglutynacja bądź hemoliza. Środowiskiem optymalnym do wywołania reakcji aglutynacji erytrocytów z regularnymi przeciwciałami klasy IgM, takimi jak przykładowo: przeciwciała anty-a i anty-b z układu ABO jest roztwór soli fizjologicznej. Znany jest z polskiego opisu patentowego nr 167 410 sposób przygotowania testu do oznaczania antygenów grup krwi układu ABO. Sposób charakteryzuje się tym, że na wyznaczone na wysuszonej płytce pole anty-a i anty-b dla biorcy i dawcy nanosi się surowice wzorcowe stanowiące mieszaninę dwóch surowic: surowicy poliklonalnej ludzkiej o wysokim mianie i surowicy monoklonalnej mysiej o wysokim mianie. Mieszaninę surowic rozprowadza się równomiernie na całej zaznaczonej kołem powierzchni, a następnie rozprowadzone surowice wzorcowe suszy się w temperaturze 20 C przez około 3 godziny. Tak przygotowaną kartę zamyka się w kopercie z folii aluminiowej polietylowanej i przechowuje się w temperaturze od +2 do +8 C w okresie 6 miesięcy od daty jej wykonania. Natomiast sposób oznaczania antygenów grup krwi układu ABO przedstawiony w polskim opisie patentowym nr 167 962 polega na tym, że po otwarciu koperty z kartą zawierającą naniesiona na zaznaczone pola wysuszone surowice wzorcowe wprowadza się po jednej kropli krwi fizjologicznej na pole anty-a i anty-b dla biorcy i dawcy. Z kolei na pola biorcy nanosi się krew biorcy i miesza się na powierzchni pól przez 15 sekund oraz podobnie na pola dawcy nanosi się krew dawcy i miesza na powierzchni pól przez 15 sekund. Następnie kołysząc lekko kartą po kilku minutach odczytuje się wynik badania. Krwinki wzorcowe uzyskuje się z krwinek czerwonych -erytrocytów o odpowiednich grupach krwi. Dotychczas krwinki wzorcowe przechowywano w płynie konserwującym stanowiącym roztwór z dodatkiem ludzkiej surowicy i z solą dwusodową kwasu wersenowego (EDTA). Każdorazowo przed wykonaniem oznaczeń dla wykrycia alloprzeciwciał regularnych przy określeniu grupy krwi należało wykonać dodatkową obróbkę przechowywanych krwinek. Po osiągnięciu płynu konserwującego krwinki zalewano zbuforowaną solą fizjologiczną, a następnie odwirowywano. Po odwirowaniu płyn z nad osadu odrzucano, a osad krwinek ponownie zalewano zbuforowaną solą fizjologiczną. Operację powtarzano co najmniej dwa razy, po czym sporządzono zawiesinę o stężeniu krwi 4,5 lub 10% wagowych, zależnym od zastosowanej metody badań, w zbuforowanej soli fizjologicznej. Tak przygotowane krwinki wzorcowe można było używać najdłużej przez okres 1 doby, natomiast praktycznie w ciągu kilku godzin od chwili ich sporządzenia. Celem wynalazku jest ułatwienie i ujednolicenie technik serologicznych, a zadaniem technicznym opracowanie receptury i sposobu wytwarzania preparatu krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej o wydłużonym okresie przydatności dzięki ich stabilizacji oraz nadających się bezpośrednio do wykonania oznaczeń, a zatem powodujących skrócenie czasu oznaczania izoaglutynin. Ponadto ulepszenie i uzupełnienie receptury i sposobu wytwarzania wymienionego preparatu krwinek wzorcowych według polskiego opisu patentowego nr 185 559 poprzez ułatwienie utrzymania jałowości oraz wydłużenie czasu ważności preparatu. Preparat krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej charakteryzuje się tym, że zawiesina krwinek o stężeniu krwi około 4,5% lub około 10% wagowych zależnym od zastosowanej metody badań, które po wystandaryzowaniu wzbogacono od 2 do 3% objętościowymi soku aloesowego typu Aloe vera zawiera dodatek co najmniej od 0,03 do 0,06%
4 186 961 wagowych zasady purynowej, korzystnie adeniny jako stabilizatora zbuforowanej soli fizjologicznej pełniącej przez to rolę płynu konserwującego. Płyn określony jako konserwujący zawiera dodatkowo antybiotyk z grupy amfenikoli, korzystnie detreomycynę w ilości korzystnie 0,024% wagowych. Sposób otrzymywania preparatu krwinek wzorcowych zawieszonych w soli fizjologicznej - według wynalazku - polega na tym, że w prowadzonym sterylnie procesie przemywany zbuforowaną solą fizjologiczną w wielokrotnej objętości, co najmniej dwukrotnie osad krwinek o odpowiedniej grupie krwi w ilości wymaganej do uzyskania zawiesiny o stężeniu krwi około 4,5 lub około 10% wagowych, zależnym od zastosowanej metody badań, zalewa się płynem określonym jako konserwujący w postaci zbuforowanej soli fizjologicznej stabilizowanej i dodatkowo wyjałowionej. Do tej soli wprowadza się dodatek od 0,03 do 0,06% wagowych zasady purynowej, korzystnie adeniny oraz przed wyjałowianiem dodaje się korzystnie 0,25 g/l antybiotyku z grupy amfenikoli, korzystnie detreomycyny. Natomiast do zawiesiny krwinek po wystandaryzowaniu dodaje się soku aloesowego typu Aloe vera w ilości odpowiedniej dla uzyskania stężenia od 2 do 3% objętościowych. Sok aloesowy otrzymuje się przykładowo z żelu aloesu typu Aloe vera przez przesączenie go w sposób jałowy do wyjałowionej butelki. Proces standaryzacji krwinek prowadzi się do uzyskania wymaganego stężenia erytrocytów wynoszącego korzystnie w 10% zawiesinie krwinek od 0,40-0,45 x 1012/l, a dla 4% zawiesinie krwinek od 0,11-0,13 x 10 I2/l. Obojętność przemywającej zbuforowanej soli fizjologicznej stanowi, co najmniej 10-krotną objętość osadu krwinek. Dla zbuforowania soli fizjologicznej stosuje się płyn buforujący o poziomie odczynu ph, co najmniej 6,7 korzystnie 6,8, którego korektę prowadzi się, za pomocą wodorotlenku sodu. Sól fizjologiczną zbuforowaną stabilizowaną dodatkowo wyjaławia się w temperaturze, co najmniej 120 C, pod ciśnieniem co najmniej 0,980665 x 10_lMPa w czasie około 15 min. Osad krwinek wprowadza się do zbuforowanej soli fizjologicznej stabilizowanej o temperaturze najwyżej 37 C, korzystnie 18 C. Otrzymaną zawiesinę po wystandaryzowaniu zalewa się sokiem aloesowym typu Aloe vera, po czym w trakcie ciągłego mieszania korzystnie za pomocą magnesu wirującego wewnątrz naczynia umieszcza się w ampułce. Preparat krwinek wzorcowych według wynalazku charakteryzuje znaczne wydłużenie żywotności względem krwinek opisanych we wcześniejszym rozwiązaniu technicznym według polskiego opisu patentowego nr 185 559, aktualnie wynoszące co najmniej 6 tygodni, a nawet 2,5 miesiąca. Spowodowane to jest przyhamowaniem starzenia się krwinek oraz ich regeneracji wskutek zastosowania soku aloesowego. Zastosowanie do procesu wytwarzania preparatu krwinek celowo dobranego dodatkowego antybiotyku polepsza znacznie jałowość procesu - co pozwala opanować ewentualnie powstałą w toku procesu niewielką infekcję. W sposobie wytwarzania preparatu krwinek 8-krotnie zmniejsza się zużycie krwi oraz rezygnuje z drogiego w produkcji osocza. Stosowanie gotowego preparatu krwinek wzorcowych wystandaryzowanych oprócz ujednolicenia techniki badań skraca czas przygotowania ich do prowadzenia badań o 30-40 min. Przykład: Skład krwinek wzorcowych zawieszonych w zbuforowanej soli fizjologicznej stabilizowanej w % wagowych erytrocyty o grupie A 10 9 g NaCl i 0,345 g adeniny rozpuszcza się w temperaturze 36,5 C w 600 ml H20. Osobno przygotowuje się płyn buforowy. 0,960 g NaH2PO4 i 0,895 g Na2HPO4 rozpuszcza się
186 961 5 w 400 ml H20 ustala odczyn ph na poziomie 6,8 korygując go za pomocą NaOH. Oba roztwory miesza się i dodaje do nich 0,269 g detreomycyny. Odczyn ph otrzymanej mieszaniny wzrasta do poziomu 6,83. Pomimo, że cały proces prowadzi się w sposób jałowy otrzymaną zbuforowaną sól fizjologiczną, stabilizowaną dodatkowo się wyjaławia przy ściśle określonych parametrach: temperatura 121 C, ciśnienie 0,980665 x 10 1MPa w okresie około 15 min. Osobno przygotowuje się osad krwinek z krwi pobranej od dawcy i wprowadzonej do znanego płynu konserwującego. Odwirowany osad krwinek zalewa się zbuforowaną solą fizjologiczną, ponownie odwirowuje się i osad zalewa zbuforowaną solą fizjologiczną, stabilizowaną. Otrzymany po odciągnięciu soli - osad krwinek w ilości 48,5 g wprowadza się do ostudzonej do temperatury 30 C wyjałowionej soli fizjologicznej, stabilizowanej. Następnie w zawiesinie przeprowadza się standaryzację krwinek za pomocą automatycznego licznika SYSTEM 9000 Diff. Zliczanie krwinek odbywa się na podstawie wykrywania różnic przewodności pomiędzy krwinkami a wymienioną solą fizjologiczną. Osobno przygotowuje się sok aloesowy z preparatu Aloe vera gel. Wymieniony żel przesącza się w sposób jałowy to znaczy przez gazę jałową do wyjałowionej butelki, w boksie o nawiewie laminarnym. Do zawiesiny krwinek ustalonym stężeniu» 0,41 x 1012/ l wlewa się ~ 22,2 ml tak przygotowanego soku aloesowego i miesza się. Następnie zawiesinę o stężeniu krwi ~ 10% wagowo wlewa się do naczynia wyposażonego w magnes i umieszcza się w urządzeniu do ampułkowania. W trakcie ciągłego mieszania za pomocą wirującego magnesu napełnia się ampułki zawiesiną. Gotowe ampułki przechowuje się w temperaturze ~ 4 C. Po wymieszaniu otworzeniu ampułki - krwinki wzorcowe zawieszone w soli fizjologicznej nadają się bezpośrednio do wykonania oznaczeń.
186 961 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.