Program ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii Ćwiczenie 1 i 2: Metody izolacji, oczyszczania DNA kolokwium wstępne: sprawdzenie podstawowych wiadomości z zakresu genetyki, i biologii molekularnej izolacja DNA plazmidów o różnej masie cząsteczkowej i różnej ilości kopii metodami lizy alkalicznej izolacja DNA plazmidowego metodą Holmesa-Quigley a (metoda termiczna) teoria: budowa kwasów nukleinowych, plazmidy, metody izolacji i oczyszczania DNA Ćwiczenie 3 i 4: Metody rozdziału DNA w żelach agarozowych Izolacja całkowitego DNA bakterii elektroforeza kwasów nukleinowych charakterystyka właściwości preparatów DNA: określanie stężenia, ciężaru cząsteczkowego i form konformacyjnych, porównanie obrazu elektroforetycznego plazmidowego i całkowitego DNA teoria: elektroforeza DNA w stałym i zmiennym polu elektrycznym, enzymy (inne niż restryktazy) stosowane w inżynierii genetycznej Ćwiczenie 5 i 6: Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do konstrukcji mapy fizycznej DNA przygotowanie reakcji trawienia DNA pojedynczymi enzymami restrykcyjnymi i kombinacjami enzymów podwójnych omówienie zasad przygotowania reakcji oznaczanie wielkości fragmentów restrykcyjnych w oparciu o markery wielkości DNA konstrukcja mapy restrykcyjnej wstawki plazmidu teoria: enzymy restrykcyjne i mapowanie restrykcyjne zaliczenie pisemne materiału Ćwiczeń 1-4 Ćwiczenie 7 i 8: Reakcja łańcuchowa polimerazy przygotowanie mieszaniny reakcyjnej rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji analiza uzyskanych wyników-ocena wydajności i specyficzności amplifikacji teoria: projektowanie starterów, czynniki wpływające na specyficzność i wydajność amplifikacji, odmiany i zastosowania reakcji PCR Ćwiczenie 9 i 10: Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych przygotowanie DNA wektora plazmidowego i wstawki elektroforetyczna kontrola jakości trawienia ligacja DNA teoria: wektory DNA zaliczenie pisemne materiału Ćwiczeń 5-8. Ćwiczenie 11 i 12: Transformacja bakterii E. coli DH5 zrekombinowanym DNA. przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja teoria: metody wprowadzania i selekcji zrekombinowanego DNA w biorcach, Ćwiczenie 14. Analiza wyników klonowania trawienie enzymami restrykcyjnymi i rozdział elektroforetyczny zrekombinowanego DNA transformantów teoria: hybrydyzacja kwasów nukleinowych rodzaje, zastosowanie, metody znakowania sond molekularnych. Techniki sekwencjonowania DNA, przygotowanie matryc, reakcji sekwencjonowania Ćwiczenie 15 Zaliczenie materiału ćwiczeń. 9-14.
Przykładowa literatura i zasoby internetowe: 1.Brown, T.A. Genomy. PWN 2.Piotr Węgleński Genetyka molekularna PWN 2008 3.Markiewicz Z. Biologia molekularna bakterii. PWN 2006 www.dnaftb.org www.dnai.org
Ćwiczenie 1-2 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA Plazmidy stanowią pozachromosomalny materiał genetyczny bakterii. Warunkują one szereg cech fenotypowych jak oporność na leki, syntezę substancji o charakterze antybiotyków (bakteriocyn), toksyn i innych związków. Plazmidy występują w formie kolistych cząsteczek DNA i różnią się między sobą pod względem wielkości oraz liczby kopii w komórce. W inżynierii genetycznej plazmidy wykorzystujemy często jako wektory do przenoszenia DNA pomiędzy komórkami tych samych lub różnych organizmów. Celem ćwiczenia jest izolacja z komórek E. coli plazmidów, które różnią się wielkością oraz liczbą kopii dwoma różnymi metodami. DNA plazmidowe puc19 i puc98 będzie wykorzystywane na kolejnych zajęciach/ Plazmidy: puc19, puc98, pk19mobgii, pbbrmcs-1 (Km R ), pmp220 1. Izolacja plazmidowego DNA za pomocą zestawu MINIPREP EXPRESS MATRIX (BIO 101) 5 ml hodowli E. coli zawierającej odpowiedni plazmid inkubować z wytrząsaniem przez noc w temp. 37ºC w płynnym podłożu LB uzupełnionym odpowiednim antybiotykiem w próbówce Eppednorfa odwirować 1,5 ml nocnej hodowli 1 min. przy 14 tys. RPM (UWAGA!!! żeby zwiększyć wydajność izolacji niskokopijnych plazmidów, można odwirować w tej samej próbówce dodatkową 1,5 ml porcję hodowli bakteryjnej) usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej osad bakteryjny dokładnie zawiesić w 150 l buforu TCG, nie pozostawiające zbitych grudek osadu bakterii dodać 300 l alkalicznego SDS (UWAGA! bufor przygotować na świeżo przed użyciem z 2N NaOH i 10% SDS) i delikatnie wymieszać przez odwracanie dodać 230 l buforu octanowego i delikatnie wymieszać przez odwracanie (powinien być widoczny biały osad) wirować 5 min. supernatant przenieść ostrożnie do nowej próbówki Epp. tak by nie pobrać białego osadu dodać 400 l EXPRESS MATRIX (UWAGA! zawiesinę dokładnie wymieszać przed dodaniem) i zmieszać przez odwracanie ok. 5 razy (DNA plazmidowe wiąże się do złoża silikonowego) wirować 30 sek., usunąć supernatant za pomocą pompki wodnej dodać 500 l 70% etanolu i wymieszać, tak aby cały osad doprowadzić do jednorodnej zawiesiny wirować 30 sek., dokładnie usunąć etanol odsączając za pomocą pompki wodnej osad podsuszyć w SpeedVacu (ok. 5 min) dodać 30 l wody i bardzo dokładnie wymieszać za pomocą końcówki do pipet (UWAGA! dokładne zawieszenie kompleksu złoże-dna zapewnia maksymalną wydajność elucji plazmidowego DNA) wirować 2 min. supernatant zawierający plazmidowe DNA przenieść do nowej próbówki Epp i zamrozić w temp. -20 Materiały bufor TC ph 8.0 Tris-HCl (ph 8.0) EDTA 10 mm 1 mm
bufor TCG glukoza Tris-HCl (ph 8.0) EDTA bufor octanowy octan potasu (5M) kwas octowy lodowaty H 2 O dest. 50 mm 25 mm 10 mm 60 ml 11.5 ml 28.5 ml alkaliczny SDS SDS 1% NaOH 0.2 M Przygotowany z 10% SDS i 2M NaOH bezpośrednio przed użyciem, 2. Izolacja plazmidowego DNA metodą Holmsa, Quigley a 5 ml hodowli E. coli zawierającej odpowiedni plazmid inkubować z wytrząsaniem przez noc w temp. 37ºC w płynnym podłożu LB uzupełnionym odpowiednim antybiotykiem w próbówce Eppednorfa odwirować 1,5 ml nocnej hodowli 1 min. przy 14 tys. RPM (UWAGA!!! żeby zwiększyć wydajność izolacji niskokopijnych plazmidów, można odwirować w tej samej próbówce dodatkową 1,5 ml porcję hodowli bakteryjnej) usunąć supernatant odsączając go za pomocą pompki wodnej osad bakteryjny bardzo dokładnie zawiesić w 350 l buforu STET, nie pozostawiające zbitych grudek bakterii (UWAGA bufor STET bardzo się pieni, należy pipetować go bardzo delikatnie) dodać 25 l lizozymu o stęż. 10 mg/ml, zamieszać końcówką pipety mieszankę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 40 sekund i natychmiast odwirować 10 min. supernatant przenieść ostrożnie do nowej próbówki Epp. tak by nie pobrać osadu z próbówki dodać 0,6 objętości izopropanolu, bardzo dokładnie wywieszać przez odwracanie wirować 15 min, supernatant delikatnie odsączyć za pomocą pompki próżniowej, a osad wypłukać 0,5 ml 70% etanolu, odwirować 5 min, supernatant delikatnie odsączyć za pomocą pompki próżniowej osad podsuszyć w SpeedVacu (ok. 5 min), a następnie rozpuścić w 20 l buforu TC + RNaza 20 g/ml) zamrozić w temp. -20 Bufor STET NaCl 0.1 M Tris HCl ph 8.0 10 mm EDTA ph 8.0 1 mm Triton X-100 5 % bufor TC+RNaza Bufor TC + RNaza 20 g/ml
Ćwiczenie 3 i 4 Metody rozdziału DNA w żelach agarozowych Celem ćwiczenia jest izolacja genomowego (całkowitego DNA) bakterii oraz rozdział elektroforetyczny próbek genomowego DNA oraz plazmidowego DNA wyizolowanego na poprzednich zajęciach i porównanie obrazu elektroforetycznego. W przypadku rozdziału plazmidowego DNA należy zaobserwować zależność drogi migracji od wielkości cząsteczki plazmidu, obecność form konformacyjnych, ilości i jakości DNA, zależnie od zastosowanej metody izolacji plazmidu A) Izolacja genowego DNA za pomocą zestawu Genomic DNA Prep Plus Zasada działania zestawu do izolacji genomowego DNA opiera się (podobnie jak w przypadku plazmidu) na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w buforach o wysokiej sile jonowej. Komórki bakterii poddawane są lizie w uniwersalnym buforze lizującym (LT), zawierającym sole i detergenty niejonowe. Dodatkowo w procesie lizy uczestniczy silna proteaza (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komórek i degradacji wszystkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, zaś zanieczyszczenia zostają wypłukane z kolumny buforem A1 zawierającym 96% etanol. Oczyszczone DNA wymywane jest z kolumny niskojonowymi buforami np. buforem TC lub wodą. Stopień oczyszczenia DNA pozwala na jego wykorzystanie w analizie restrykcyjnej i PCR. Protokół izolacji genomowego DNA W próbówce Eppendorfa odwirować 1.5-5 ml (zależnie od gęstości) hodowli bakteryjnej (5 min./ 14 tys. RPM) Osad zawiesić w 100 l buforu TE Dodać 200 l uniwersalnego buforu lizującego LT Dodać 20 l roztworu Proteinazy K Całość wymieszać i inkubować 20 min w temp. 37ºC Przenieść próbówkę do 75ºC i inkubować przez 5 min. Próbówkę intensywnie wytrząsać np. na worteksie przez 20 sek. Wirować przez 5 min (15 tys. RPM) Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do czyszczenia genomowego DNA Kolumnę umieścić nowej próbówce, a następnie wirować 1 min. (15 tys. RPM) Wyjąc minikolumnę wraz z próbówką i dodać do kolumny 500 l r-ru płuczącego A1 Wirować 1 min przy 15 tys. RPM Kolumnę umieścić nowej próbówce i dodać do kolumny 400 l r-ru płuczącego A1 Wirować 1 min przy 15 tys. RPM Osuszoną kolumnę umieścić w nowej próbówce i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 30 l wody dejonizowanej. Inkubować próbówkę przez 5 min. w temp. pokojowej Kolumnę umieścić nowej próbówce i wirować 1 min przy 15 tys. RPM Minikolumnę usunąć a oczyszczone DNA znajdujące się w eluacie zamrozić w -20ºC. Sprawdzić ilość wyizolowanego DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym.
B) Elektroforeza agarozowa DNA Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych jest techniką używaną do rozdziału, oznaczania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Rozdział polega na migracji rozdzielanych substancji pod wpływem przyłożonego prądu elektrycznego. W obojętnym ph DNA ma ładunek ujemny i wędruje do anody. Stosowane techniki różnią się od siebie zdolnością rozdzielczą i zakresem rozdziału. Przygotowanie żelu agarozowego przygotować 100 ml 0,7% żelu agarozowego w buforze elektroforetycznym 1X stęż. TBE. Rozpuścić agarozę we wrzącej łaźni wodnej i gotować jeszcze przez co najmniej 10 min. ostudzić żel do temp. ok. 60ºC i wylać żel do rynienki tak aby ustawiony nad nią grzebień został zanurzony w żelu i spowodował powstanie studzienek po zastygnięciu żelu (minimum 30 min) wyjąć grzebień i napełnić aparat buforem 1X stęż. TBE do wysokości 5 mm nad powierzchnię żelu Przygotowanie próbek DNA Do sprawdzenia ilości wyizolowanego DNA używany jest zwykle niewielka ilość (kilka l) uzyskanego w trakcie izolacji roztworu DNA. Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat przy nakładaniu do próbki dodajemy kilka l buforu TC lub wody. Do tak przygotowanej próbki dodajemy 6x stężonego buforu obciążającego (do końcowego stężenia 1X). Bufor obciążający służy do zagęszczenia próbki DNA tak by umożliwić jej nałożenie do studzienki w żelu. Bufor obciążający zawiera jeden lub dwa barwniki do elektroforezy tj. ksylen cyjanol (0,25%) i błękit bromofenolowy (0,25%) oraz 40% sacharozę lub 30% glicerol. Barwniki elektroforetyczne mirują w żelu razem z cząsteczkami DNA. Błękit bromofenolowy migruje ok. 2,2 razy szybciej niż ksylen cyjanol. Szybkość migracji błękitu bromofenolowego odpowiada szybkości migracji liniowej cząsteczki dsdna (dwuniciowe DNA) o wielkości 300pz, podczas gdy ksylen cyjanol migruje z szybkością równą fragmentom dsdna o wielkości 4000pz. UWAGA!!! próbki DNA do elektroforezy przygotowujemy w nowych próbówkach Epp, pozostałą część przechowujemy do dalszych oznaczeń. Całość przygotowanej próbki nakładamy na żel. włączyć zasilanie ze stabilizatora prądu do aparatu do elektroforezy, dla uzyskanie optymalnego rozdziału napięcie powinno wynosić ok. 5V/cm odległości pomiędzy elektrodami aparatu do elektroforezy (w naszym przypadku ok. 120V) prowadzić elektroforezę aż do momentu kiedy barwnik osiągnie 3/4 długości żelu wyłączyć zasilanie, wyjąć żel wraz z rynienką i umieścić w wanience zawierającej wodny roztwór bromku etydyny (0,5 mg/ml) barwić żel co najmniej 10-15 min. podświetlić żel lampą UV i obserwować powstałe prążki DNA. Zaobserwować odmienną ruchliwość elektroforetyczną różnych form DNA plazmidowego i genomowego. UWAGA!!! Bromek etydyny jest silnym mutagenem - stosować rękawiczki i unikać bezpośredniego kontaktu roztworu bromku etydyny ze skórą
Materiały bufor TBE-1 x stężony (Tris-boranowy) Tris base 10,8 g kwas borowy 5,5 g 0.5M EDTA ph 8.0 4 ml H 2 O dest. do 1000 ml bufor obciążający błękit bromofenolowy 0,25% sacharoza 40%
Ćwiczenie 5 i 6 Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do konstrukcji mapy fizycznej DNA Celem ćwiczenia jest konstrukcja mapy fizycznej wstawki plazmidu puc98 przy użyciu enzymów restrykcyjnych. W trakcie ćwiczeń studenci przygotowują reakcje trawienia DNA pojedynczymi enzymami restrykcyjnymi i kombinacjami enzymów podwójnych, a następnie oznaczają wielkości fragmentów restrykcyjnych w oparciu o ruchliwość elektroforetyczną w żelu agarozowym i porównanie drogi migracji fragmentów DNA z markerami wielkości. Na tej podstawie konstruowana jest mapa restrykcyjna wstawki plazmidu puc98. Przygotowanie reakcji trawienia plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi UWAGA!!! Enzymy restrykcyjne należy trzymać w lodzie!!!! Ważna jest kolejność dodawania składników mieszaniny: H 2 O, DNA, bufor, enzym!!! A) trawienia pojedynczymi enzymami UWAGA!!! końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 15µl puc98 EcoRI puc98 HindIII puc98 PstI ok. 500 ng DNA puc98 1,5 µl bufor EcoRI 1,5 µl enzym EcoRI ok. 500 ng DNA puc98 1,5 µl bufor HindIII 1,5 µl enzym HindIII ok. 500 ng DNA puc98 1,5 µl bufor PstI 1,5 µl enzym PstI H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej 15 µl H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej 15 µl H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej 15 µl B) Trawienie podwójnymi kombinacjami enzymów restrykcyjnych UWAGA!!! końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20µl puc98 EcoRI/HindIII puc98 EcoRI/PstI puc98 HindIII/PstI ok. 500 ng DNA puc98 1 µl bufor EcoRI 1 µl bufor HindIII 1 µl enzym EcoRI 1 µl enzym HindIII ok. 500 ng DNA puc98 1 µl bufor EcoRI 1 µl bufor PstI 1 µl enzym EcoRI 1 µl enzym PstI ok. 500 ng DNA puc98 1 µl bufor PstI 1 µl bufor HindIII 1 µl enzym PstI 1 µl enzym HindIII H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej 20 µl H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej 20 µl H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej 20 µl
Przygotowane mieszaniny reakcyjne wymieszać, krótko zwirować i inkubować w temp. 37ºC. W międzyczasie przygotować 1% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1x stężonym buforem TBE. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do studzienek w żelu. UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (trawione enzymami EcoRI i HindIII DNA bakteriofaga λ lub marker typu drabinka). Prowadzić rozdział elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4 długości żelu. Po tym czasie żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle UV i poddać obraz analizie w celu ustalenia wielkości fragmentów restrykcyjnych.
Ćwiczenie 7 i 8 Technika PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując materiał genomowego DNA RtTA1 wyizolowany na drugich zajęciach. Wydajność i skuteczność amplifikacji sprawdza się elektroforetyczne (elektroforeza w 1% żelu agarozowym). Powielone fragmenty DNA zostaną poddane rekombinacji do wektora plazmidowego na kolejnych zajęciach. W celu ułatwienia rekombinacji startery do reakcji PCR wyposażono w sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej objętość końcowa 50 l składnik (stęż. wyjściowe) stęż. końcowe objętość ( l) uwagi!!! woda xxx najpierw woda DNA 500 ng xxx 10X stęż. bufor reakcyjny 1 X 5 25 mm MgCl2 2,5 mm 5 2 mm dntp 100-200 M 3 5 M starter Fw 0,2-0,4 m 2 5 M starter Fw 0,2-0,4 m 2 Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość 50 l Profil termiczny reakcji temperatura ( C) czas (s) wstępna denaturacja 96 300 denaturacja 94 10 anealing starterów 57 10 elongacja 72 60 30 cykli W międzyczasie przygotować 1,5% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1x stężonym buforem TBE. Po zakończeniu reakcji amplifikacji mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, pobrać do nowej próbówki Epp 10 µl mieszaniny do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do studzienek w żelu. UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (marker typu drabinka). Prowadzić rozdział elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4 długości żelu. Po tym czasie żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle UV i poddać obraz analizie w celu ustalenia wydajności i specyficzności amplifikacji fragmentu DNA.
Ćwiczenia 9-10 Klonowanie genów w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA powielonego techniką PCR na poprzednich zajęciach do wektora plazmidowego. Etapy postępowania: Przygotowanie DNA wektora (puc19 trawiony równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi) Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR (trawienie równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi) przygotowanie reakcji ligacji DNA transformacja komórek kompetentnych E. coli DH5α) analiza zrekombinowanych klonów (izolacja plazmidowego DNA, analiza restrykcyjna i elektroforeza w 1% żelu agarozowym lub PCR kolonijny). 1) Przygotowanie plazmidu puc19 do klonowania trawienie wektora dwoma enzymami restrykcyjnymi Poddajemy trawieniu ok. 500 ng puc19 równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi w celu linearyzacji wektora oraz utworzenia lepkich końców. Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną: DNA puc19 Ok. 500 ng X l Bufor Enzymu I 1 X stężony 1 l Bufor Enzymu II 1 X stężony 1 l Enzym I 10 U 1 l Enzym II 10 U 1 l H 2 O dejonizowana, jałowa do końcowej objętości 20µl Przeprowadzamy trawienie w temp. 37 C przez min. 1 godz. Efektywność trawienia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu agarozowym 2) Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR (trawienie dwoma enzymami restrykcyjnymi) Poddajemy trawieniu dwoma enzymami restrykcyjnymi ok. 500 ng fragmentu DNA amplifikowanego PCR, oczyszczonego po amplifikacji, w celu uwolnienia lepkich końców. Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną: fragment PCR-DNA Ok. 500 ng X l Bufor Enzymu I 1 X stężony 1 l Bufor Enzymu II 1 X stężony 1 l Enzym I 10 U 1 l Enzym II 10 U 1 l H2O dejonizowana, jałowa do końcowej objętości 20µl
Przeprowadzamy trawienie w temp. 37 C przez min. 1 godz. Efektywność cięcia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu agarozowym. 3) Łączenie cząsteczek DNA wektora z wyizolowanym z żelu DNA fragmentu PCR - reakcja ligacji Przy klonowaniu fragmentów DNA obowiązuje zasada molowego nadmiaru ilości klonowanego fragmentu w stosunku do wektora. Mieszanina reakcyjna powinna mieć jak najmniejszą objętość, co poprawia skuteczność ligacji. Do reakcji ligacji używamy: puc19/strawiony dwoma enzymami restrykcyjnymi: 125 ng DNA fragment PCR/strawionego dwoma enzymami restrykcyjnymi: - ok. 250 ng DNA 4 µl mieszaniny reakcyjnej 12 µl mieszaniny reakcyjnej bufor ligazy (końcowe stężenie 1X) 2 µl ligaza faga T4 (1U/ l) 2 µl UWAGA!!! Mieszaninę reakcyjną przygotowujemy w próbówkach Epp. 0,5 ml Tak przygotowana mieszanina jest właściwą reakcją ligacji. Oprócz niej przygotowuje się zwykle reakcję kontrolną, w której zamiast klonowanego fragmentu dodaje się dejonizowaną sterylną H 2 O. Reakcję ligacji przeprowadza się w temp. 12 C przez ok. 16 godz.
Ćwiczenie 11-12 Wprowadzanie cząsteczek DNA do komórek bakteryjnych transformacja. Celem ćwiczenia jest wprowadzenie zrekombinowanego DNA uzyskanego na poprzednich zajęciach do bakterii E. coli i wyselekcjonowanie na płytkach ze stałym podłożem transformantów, które pobrały zrekombinowane cząsteczki plazmidu. Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy. Proces transformacji został opisany u wielu rodzajów bakterii: najwyższą częstość uzyskuje się w obrębie tego samego gatunku (tak jest np. w przypadku bakterii z rodzaju Haemophilus), znacznie niższą między gatunkami. Wysoką aktywność transformującą wykazuje dsdna w formie liniowej. Wydajność transformacji zależy między innymi od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Zwiększenie stężenia DNA powyżej dawki nasycającej nie powoduje wzrostu liczby transformantów. U wielu bakterii (Haemophilus, Streptococcus, Bacillus) pobieranie DNA z otoczenia jest rezultatem ich naturalnego stanu kompetencji. Natomiast w przypadku szczepów Escherichia coli stan kompetencji bakterii uzyskuje się na drodze indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami wapnia). Metoda wykorzystująca 0,1 M roztwór chlorku wapnia jest powszechnie stosowanym sposobem otrzymania tzw. komórek kompetentnych. W tym stanie bakterii E. coli są zdolne do pobierania z otoczenia cząsteczek kolistego DNA np. plazmidu. Przygotowanie komórek kompetentnych: 1. Szczep Escherichia coli DH5α lub XL1-Blue odmłodzić przez dodanie 0,4 ml nocnej hodowli bakterii do 40 ml jałowej pożywki LB. 2. Bakterie hodować w temperaturze 37 C do uzyskania OD 600 = 0,4. 3. Następnie hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w łaźni lodowej na 5 min. Bakterie osadzić rzez wirowanie w jałowej próbówce (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min). 4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml zimnego, jałowego roztworu 0,05 M CaCl 2. Całość inkubować w łaźni lodowej przez 30 minut. 5. Bakterie osadzić przez ponowne wirowanie (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min. ). 6. Osad bakteryjny zawiesić w 1 ml zimnego, jałowego roztworu CaCl 2 (0,05M). 7. Bakterie są gotowe do użycia. W celu zwiększenia wydajności transformacji inkubację w lodzie można przedłużyć do 12 godzin. Transformacja komórek bakteryjnych zrekomninowanym DNA 1. Do jałowej próbówki z 0,1 ml zawiesiny komórek kompetentnych dodać pipetą automatyczną całość mieszaniny ligacyjnej przygotowanej na poprzednich zajęciach. Równolegle wykonać próby kontrolne: 0,1 ml komórek kompetentnych kontrola komórek kontrola mutacji spontanicznych 0,1 ml komórek kompetentnych + kontrola ligacji (całość kontrolnej mieszaniny ligacyjnej tj. wektor trawiony enzymami, poddawany ligacji bez wstawki) 0,1 ml komórek kompetentnych + 2 µl plazmidu puc19 nietrawionego kontrola kompetencji 0,1 ml komórek kompetentnych + 5µl mieszaniny puc19/bam/hind kontrola wydajności trawienia wektora
2. Po delikatnym wymieszaniu próbówkę inkubować w łaźni lodowej przez 30 40 minut. 3. Po tym czasie przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC i inkubować przez 2 minuty. 4. Dodać do próbówek 1 ml ogrzanej do 37ºC płynnej pożywki LB (bez antybiotyku). W celu uzyskania ekspresji genów wprowadzonych do komórki, bakterie inkubować przez 45-60 minut wytrząsarce w temperaturze 37ºC. 5. Po tym czasie przenieść na płytki z podłożem LB zawierającym antybiotyk (podłoże selekcyjne). W tym celu hodowle krótko odwirować (1 min, 13 tys RPM), usunąć supernatant a osad zawiesić w 50-100 l płynnej pożywki LB. Właściwą ligację wysiać na podłoże z antybiotykiem z dodatkiem X-gal i IPTG. Pozostałe kontrole wysiać na podłoża uzupełnione tylko antybiotykiem. Bakterie dokładnie rozprowadzić głaszczką na powierzchni podłoża agarowego. Płytki inkubować przez 12-24 godzin w temperaturze 37ºC. 6. Po inkubacji w temperaturze 37ºC, policzyć kolonie, które wyrosły na wszystkich płytkach. Obliczyć wydajność tranformacji. Analiza zrekombinowanych klonów. 1. Izolacja DNA plazmidowego i analiza restrykcyjna z użyciem enzymów flankujących polilinker wektora puc19. 2. PCR z kolonii lub na matrycy wyizolowanego DNA plazmidów z zastosowaniem starterów komplementarnych do flankowania fragmentu DNA lub starterów uniwersalnych wektora.
Ćwiczenie 13-14 Analiza wyników klonowania - PCR kolonijny Celem ćwiczenia jest potwierdzenie obecności zrekombinowanego plazmidu zawierającego fragment DNA bakterii RtTA1 w transformantach E. coli uzyskanych na poprzednich zajęciach. Jednym ze sposobów szybkiego przeszukiwania zrekombinowanych klonów jest tzw. PCR kolonijny, w którym jako źródło materiału genetycznego do amplifikacji wykorzystujemy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki selekcyjnej za pomocą sterylnej ezy lub końcówki pipety. Taki materiał biologiczny poddajemy działaniu wysokiej temp. bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej zawierającej wszystkie składniki niezbędne do powielenie fragmentu DNA zrekombinowanego w wektorze plazmidowym. W trakcie inkubacji w temp. 96ºC bakterie ulegają lizie uwalniając materiał genetyczny, które stanowi matrycę do amplifikacji DNA w reakcji PCR. Wykonanie: Przygotować mieszaninę reakcyjną wg schematu podanego w tabeli. (Należy pamiętać, że przygotowanie mieszaniny reakcyjnej rozpoczynamy od dodania H 2 O, a enzym jest ostatnim składnikiem) MgCl 2 20 µl Bufor dla polimerazy Taq 20 µl dntp 8 µl Starter puc Fw 4 µl Starter puc Rw 4 µl Polimeraza Taq 8 µl H 2 O 136 µl Mieszaninę rozpiptetować po 20 l do małych (0,2 ml) próbówek Eppendorfa i dodać sterylnie przy pomocy ezy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośredni z płytki. Przeprowadzić reakcję PCR wg pokazanego poniżej profilu termicznego reakcji Profil termiczny reakcji temperatura ( C) czas (s) wstępna denaturacja 96 240 denaturacja 94 15 anealing starterów 57 15 25 cykli elongacja 72 30-60* * w zależności od długości fragmentu DNA sklonowanego w wektorze plazmidowym Skuteczność amplifikacji sprawdzamy przez elektroforezę 15 µl mieszaniny reakcyjnej w 1,5% żelu agarozowym w obecności markera typu drabinki.