MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 125-132 Wykorzystanie nowej techniki multiplex real-time PCR do wykrywania i różnicowania DNA wirusów opryszczki typu 1 i 2 Novel multiplex real-time PCR assay for detection and differentiation of herpes simplex virus type 1 and 2 DNA Paulina Machura 1,2, Emilia Górka 1,3, Beata Młynarczyk-Bonikowska 3, Anna Majewska 2, Magdalena Malejczyk 3, Grażyna Młynarczyk 2, Tomasz Dzieciątkowski 2 1 Oddział Medycyny Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 Zakład Diagnostyki Chorób Przenoszonych Drogą Płciową, Warszawski Uniwersytet Medyczny Celem pracy było optymalizacja nowego wariantu techniki multiplex real- -time PCR, który może być wykorzystany zarówno do wykrywania, jak i różnicowania zakażeń HSV-1/2, zwłaszcza w próbkach pobranych od osób z zakażeniami narządów płciowych. Specyficzność opracowanej metody, w połączeniu z szybkością oznaczenia, daje możliwość rutynowego jej stosowania, zwłaszcza u pacjentów z zaburzeniami odporności lub objawami niespecyficznymi, w przypadku których szybka i trafna diagnoza jest szczególnie istotna. Słowa kluczowe: herpeswirusy, choroby przenoszone drogą płciową, real-time PCR ABSTRACT Introduction: Herpes simplex viruses type 1 and 2 are the cause of world spread multiple infections with different course and severity. The aim of this work was to design and to optimize multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of HSV-1 and HSV-2. The second aim of the project was to check if the designed method is laboratory useful analyzing different clinical specimens. Materials and methods: In this experiment primers and probes were designed to specific viral sequences: for HSV-1 to the gene of viral DNA polymerase; for HSV-2 to the UL5 sequence. For performing qpcr assay TaqMan chemistry was used. Reference strains HSV- 1 McIntyre and HSV-2 MS were used as a positive control. To test laboratory utility of the designed method 58 different clinical specimens were analyzed.
126 P. Machura i inni Nr 2 Results: Developed multiplex real-time PCR gave positive result only in the samples containing genetic material of HSV-1/2. Of the 58 clinical samples tested, 27 proved to be positive for HSV-1 and 17 for HSV-2. The 7 samples showed the presence of both types of DNA herpes simplex virus, and 7 others were found for both HSV-1 and HSV-2 negative. Conclusions: Obtained results show that the designed method is highly specific and can possibly be used to simultaneously detect and differentiate HHV-1/2. Both high specificity and very short time of analysis have great importance in diagnosing immunocompromised patients, which ought to be diagnosed quickly and effectively in order to provide appropriate treatment. Key words: herpesviruses, sexual transmitted infections, real-time PCR WSTĘP Zakażenia wirusem opryszczki typu 1 (HSV-1, HHV-1) oraz typu 2 (HSV-2, HHV-2) należą do chorób wirusowych występujących powszechnie na całym świecie (1,2). Do zakażenia nimi dochodzi zazwyczaj w wyniku bezpośredniego kontaktu, a wrotami zakażenia są uszkodzone mechanicznie błony śluzowe lub skóra. HSV-1 jest zazwyczaj kojarzony z zakażeniami w obrębie jamy ustnej, takimi jak: zmiany pęcherzykowe okolic ust i innych części twarzy, zapalenia mózgu czy uogólnione infekcje u osób z zaburzeniami odporności (1,2,3). HSV-2 wiązany jest natomiast najczęściej z pierwotnym lub wynikającym z reaktywacji latentnego wirusa zakażeniem skóry i błon śluzowych, zlokalizowanym najczęściej na skórze i błonach śluzowych narządów płciowych i/lub okolicy okołoodbytniczej (4). Nieliczne prowadzone dotychczas w Polsce badania nad epidemiologią zakażeń opryszczkowych sugerować mogą także znaczący udział herpeswirusa typu 1 w etiologii chorób przenoszonych drogą płciową (5,6) Złotym standardem diagnostyki zakażeń opryszczkowych przez wiele lat była izolacja i namnażanie wirusa w hodowlach komórkowych, gdzie materiałem stosowanym do zakażania był płyn pęcherzowy lub wymazy bezpośrednie z powierzchni zmian skórnych (7,8). Zaletą takiego materiału klinicznego była możliwość jego wykorzystania zarówno do zakażenia hodowli komórkowych, jak i do izolacji DNA (8). Wyizolowany z próbek materiał genetyczny posłużyć może do oznaczania i różnicowania typów wirusa opryszczki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Tradycyjne warianty techniki PCR służyły głównie do jakościowego badania obecności wirusa i stopniowo wypierane są przez metodę real-time PCR (qpcr), która ze względu na swą wysoką czułość oraz możliwość oznaczeń ilościowych stała się najlepszą w diagnostyce zakażeń herpeswirusami (7). Celem niniejszej pracy było opracowanie oraz optymalizacja metody multiplex real-time PCR z wykorzystaniem sond hydrolizujących typu TaqMan do wykrywania i różnicowania DNA ludzkich wirusów opryszczki typu 1 i 2, określenie jej czułości analitycznej oraz przydatności do oznaczeń w próbkach klinicznych, zwłaszcza pobranych od pacjentów z podejrzeniem zakażenia narządów płciowych.
Nr 2 Multiplex real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusów opryszczki 127 MATERIAŁ I METODY W celu opracowania starterów i sond do metody multiplex real-time PCR wykorzystano sekwencje DNA dostępne w internetowej bazie danych GenBank: wirusowej DNA polimerazy dla HSV-1 (AB 691552.1), zaś dla wirusa opryszczki typu 2 kodującą gen UL5 (NC 001798.1). Zaprojektowane do nich, z użyciem oprogramowania LightCycler Probe Design (Roche Diagnostics ), startery amplifikują fragmenty wirusowych genomów o długościach odpowiednio, 111 i 112 par zasad (Tab.I). Zastosowane specyficzne fluorescencyjne sondy hydrolizujące typu TaqMan zostały wyznakowane odpowiednio: dla HSV-1 barwnikiem reporterowym typu FAM i wygaszaczem BHQ-1, dla HSV-2 barwnikiem reporterowym typu TexasRed 610 i wygaszaczem BHQ-2 (Oligo ). Badania wykonywano na aparacie LightCycler 2.0 z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master Mix (Roche Diagnostics ). Mieszanina reakcyjna o końcowej objętości 15 µl składała się z 3 µl mieszaniny amplifikacyjnej, po 30 µm każdego z czterech starterów, po 2,25 µm każdej z dwóch sond, 1 µl wody oraz 5 µl DNA. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w 95 C, po którym następowało 40 cykli składających się z denaturacji 10 s w 95 C, przyłączania starterów przez 30 s w 62 C oraz wydłużania nici w temperaturze 72 C przez 10 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek do 40 C na 60 sekund (Tab.II). Odczytu fluorescencji dokonywano przy dwóch długościach fali: 530 nm dla wirusa opryszczki typu 1 (charakterystyczny kanał emisji dla fluoroforu FAM) oraz 610 nm dla wirusa opryszczki typu 2 (kanał emisji właściwy dla TexasRed 610). Tabela I Sekwencje starterów i sond użytych w pracy. Sekwencja 5 3 Zawartość par G+C Temperatura topnienia Starter HSV1_F TGA TCG GCG AGT ACT GCA TA 50,0% 60,0 ºC Starter HSV1_R TGA TGT TAA TAC CCG CCA AG 45,0% 59,5 ºC Sonda HSV1_P FAM TTG CCC CAT CTG GAG CTC TCG BHQ1 61,9% 67,2 ºC Starter HSV2_F GTA GTT GGT GAT GCG ACT G 52,6% 59,9 ºC Starter HSV2_R CTC ACG TTT GTG TCG GT 52,9% 60,0 ºC Sonda HSV2_P TexasRed610 TGC TGC GTG AGC CGT CG BHQ2 70,6% 67,3 ºC Tabela II. Parametry PCR w czasie rzeczywistym Proces Liczba cykli Temperatura [ C] Czas trwania Aktywacja hot-start polimerazy DNA 1 95 10 minut Denaturacja 95 10 sekund Hybrydyzacja starterów 40 62 30 sekund Wydłużanie 72 10 sekund Chłodzenie 1 40 60 sekund
128 P. Machura i inni Nr 2 Do oznaczeń czułości i swoistości zaprojektowanej metody użyto całogenomowego DNA wyizolowanego ze standardowego szczepu McIntyre ludzkiego wirusa opryszczki typu 1 (ATCC nr. VR-539) oraz szczepu MS ludzkiego wirusa opryszczki typu 2 (ATCC nr. VR-540). Jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii Vero, zaś za kontrolę specyficzności reakcji posłużył DNA izolowany z: wirusa ospy wietrznej/półpaśca (VZV), wirusa Epsteina-Barr (EBV), wirusa cytomegalii (CMV), ludzkiego herpeswirusa typu 6 (HHV-6), ludzkiego herpeswirusa typu 7 (HHV-7), ludzkiego adenowirusa typu 4 (HAdV-4), poliomawirusa BK (BKV) oraz cdna wirusa Coxackie A i wirusa grypy typu A. Granica oznaczalności metody (LOD) wyznaczona została z zastosowaniem seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wzorcowego DNA HSV-1 oraz HSV-2 w jałowej, redestylowanej wodzie w zakresie od 10 1 do 10 5 kopii/ml. Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w trzykrotnych, niezależnych powtórzeniach. DNA całkowite, wykorzystywane do badań molekularnych, izolowano przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics). Izolację przeprowadzono z objętości 200 μl odpowiednich materiałów, zgodnie z instrukcją wytwórcy, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 35 μl wody. Badany materiał kliniczny stanowiło 58 próbek pochodzących od pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Szpitala Klinicznego im. Dzieciątka Jezus oraz z kolekcji Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Analizowano następujące materiały: surowicę krwi (5 próbek), płyn ze zmian pęcherzykowych (2 próbki), płyn mózgowo-rdzeniowy (5 próbek), wymazy ze zmian bezpośrednich (46 próbek). WYNIKI W opracowanej technice multiplex real-time PCR wynik dodatni, wyrażony jako wykładniczy wzrost fluorescencji w mieszaninie reakcyjnej, osiągnięto tylko w próbkach zawierających materiał genetyczny ludzkich wirusów opryszczki typu 1 i 2. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii Vero, wirusa ospy wietrznej/półpaśca, wirusa Epsteina-Barr, wirusa cytomegalii, ludzkiego herpeswirusa typu 6, ludzkiego herpeswirusa typu 7, ludzkiego adenowirusa typu 4, poliomawirusa BK oraz cdna wirusa Coxackie A i wirusa grypy typu A nie zaobserwowano fluorescencji, co wskazuje na brak Tabela III. Wyniki oznaczeń uzyskanych techniką real-time PCR z użyciem sond hydrolizujących typu TaqMan w kierunku zakażenia HSV-1/2 Materiał badany Liczba próbek ogółem Liczba próbek HSV-1 (+) Liczba próbek HSV-2 (+) Liczba próbek HSV-1/2 (+) Liczba próbek HSV-1/2 (-) Surowica krwi 5 5 0 0 0 Płyn mózgowordzeniowy 5 4 1 0 0 Wymaz ze zmian na skórze i/lub błonach 46 17 15 7 7 śluzowych Płyn ze zmian pęcherzowych 2 1 1 0 0
Nr 2 Multiplex real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusów opryszczki 129 Ryc.1 Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego wirusa opryszczki typu 1. Krzywa oznaczona HSV-1 oznacza amplifikację DNA wirusa opryszczki typu 1. Pozostałe krzywe przedstawiają wirusy wykorzystane do oceny specyficzności reakcji (HSV-2, VZV, HAdV-4, CMV, HHV-6, HHV-7, EBV, BKV, Coxackie A, grypa A). Rolę kontroli ujemnej pełniło DNA wyizolowane z niezakażonej hodowli linii komórkowej Vero. Ryc.2 Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego wirusa opryszczki typu 2. Krzywa oznaczona HSV-2 oznacza amplifikację DNA wirusa opryszczki typu 2. Pozostałe krzywe przedstawiają wirusy wykorzystane do oceny specyficzności reakcji (HSV-1, VZV, HAdV-4, CMV, HHV-6, HHV-7, EBV, BKV, Coxackie A, grypa A). Rolę kontroli ujemnej pełniło DNA wyizolowane z niezakażonej hodowli linii komórkowej Vero.
130 P. Machura i inni Nr 2 w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego i świadczy o wysokiej specyficzności metody (Ryc.1 i 2). Granicę wykrywalności (LOD) opracowanej metody wyznaczono za pomocą algorytmu opisanego przez Burns i Valdiva (9), a wynosiła ona 53 kopii/próbkę w przypadku HSV-1 oraz 69 kopii/próbkę dla HSV-2. Spośród 58 przebadanych próbek klinicznych, 27 okazało się dodatnich w kierunku HSV-1, zaś 17 w kierunku HSV-2. W 7 próbkach wykazano obecność DNA obydwu typów wirusa opryszczki, a 7 pozostałych okazało się zarówno HSV-1, jak i HSV-2 ujemnymi. Wyniki oznaczeń zestawiono w tabeli III. DYSKUSJA Wirusy opryszczki pospolitej typu 1 i 2 powodują szereg chorób powszechnie dotykających ludzi na całym świecie. Choroby te mają zróżnicowany przebieg i nasilenie objawów, mogą także przyjmować postać uogólnioną (1,10). Na szczególną uwagę zasługuje słabo wciąż poznany mechanizm reaktywacji wirusa z zakażenia latentnego, będący dodatkowym problemem diagnostycznym i terapeutycznym. Zjawisko przejścia endogennego wirusa ze stanu latencji do zakażenia produktywnego jest interesujące także z powodu różnorodności czynników, które je mogą wywoływać (11). Prawidłowa diagnostyka zakażeń wywołanych przez HSV-1/2 jest wciąż wyzwaniem w praktyce klinicznej. Wiąże się to z faktem, że rozpoznanie zakażenia wirusowego stawiane jest najczęściej na podstawie istniejących objawów klinicznych, a te mogą mylnie być interpretowane jako symptomy infekcji bakteryjnych lub grzybiczych. Zdarzają się też sytuacje odwrotne, gdzie w zakażeniach o niepotwierdzonej laboratoryjnie etiologii opryszczkowej klinicyści dopatrują się związku z HSV-1/2 (12). Dużym problemem jest poprawne rozpoznawanie opryszczki genitalnej, ponieważ zakażenia te mogą mieć przebieg skąpoobjawowy lub podobny do innych zakażeń narządów płciowych. Także prowadzone dotychczas badania seroepidemiologiczne na terenie Polski wskazują na coraz większy udział typu 1 wirusa w wywoływaniu zmian genitalnych, co dodatkowo utrudnia diagnostykę (6). Wszystkie te czynniki razem sprawiają, że jedynie ok. 20% pacjentów cierpiących na opryszczkę narządów płciowych zostaje prawidłowo zdiagnozowanych. Nieprawidłowe rozpoznanie powoduje z kolei błędne postępowanie terapeutyczne i dalsze rozprzestrzenianie się wirusa w ludzkiej populacji (12,13) Zakażenie mieszane, wykryte w części próbek świadczyć może o współzakażeniu pacjenta dwoma typami wirusa. Siedmiu pacjentów, u których nie wykryto DNA wirusów opryszczki najprawdopodobniej cierpi na schorzenia o etiologii niezwiązanej z HSV-1/2, mimo podobnych objawów (próbki pobierane były od pacjentów mających symptomy opryszczkopodobne). Pozostałe przebadane próbki wpisują się w tendencję ogólną charakterystyczną nie tylko dla obszaru Polski, ale większości krajów europejskich, zgodnie z którą większość zakażeń wirusem opryszczki powodowana jest przez typ 1 wirusa (5,6). Według niektórych autorów, udział HSV-1 w wywoływaniu zmian genitalnych stale rośnie, co najprawdopodobniej wiąże się ze zmianą zachowań seksualnych. Być może zmiana seksualnej obyczajowości odpowiada również za część koinfekcji obydwoma typami wirusa opryszczki (14,15).
Nr 2 Multiplex real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusów opryszczki 131 Przeprowadzone w niniejszej pracy badania, wykonane na grupie 58 próbek potwierdzają przydatność kliniczną zaprojektowanej metody. Ze względu na wszystkie wymienione powyżej cechy qpcr - czułość, szybkość wykonania badania oraz możliwość oznaczeń ilościowych - opisywany w niniejszej pracy test mógłby z powodzeniem ułatwić i przyspieszyć diagnostykę schorzeń o etiologii opryszczkowej, zwłaszcza takich jak: asymptomatyczne zakażenia genitalne, uogólnione infekcje u noworodków czy opryszczkowe zakażenia układu nerwowego, w przypadku których tradycyjnie stosowane w diagnostyce hodowle komórkowe okazują się szczególnie nieskuteczne, dając jedynie 4% wyników pozytywnych (16). Rozpowszechnienie w praktyce laboratoryjnej czułych testów umożliwiających wykrycie wirusowego DNA, czy też w wariancie ilościowym pozwalających na monitorowanie wiremii HSV-1/2, może znacząco ułatwić szybką diagnostykę zakażeń opryszczkowych, a w konsekwencji prawidłowe postępowanie terapeutyczne. PIŚMIENNICTWO 1. Chayavichitsil P, Buckwalter JV, Krakowski AC i inni. Herpes simplex. Pediatr Rev 2009; 30: 119-29. 2. Karabin K, Chudzik E, Dzieciątkowski T. Zakażenia alfaherpeswirusami u pacjentów z upośledzeniem odporności. Post Mikrobiol 2010; 49: 97-104. 3. Miller GG, Dummer JS. Herpes simplex and varicella zoster viruses: forgotten but not gone. Am J Transplant 2007; 7: 741-7. 4. Hofstetter AM, Rosenthal SL, Stanberry LR. Current thinking on genital herpes. Curr Opin Infect Dis 2014; 27: 75-83. 5. Majewska A, Kilijańczyk M, Gajewska M i inni. Identyfikacja wirusów opryszczki pospolitej w materiale pobranym z błony śluzowej narządów płciowych od pacjentek poradni ginekologicznej przy I Katedrze i Klinice Położnictwa i Ginekologii WUM w Warszawie. Ginekol Prakt 2009; 17: 17-20. 6. Smith JS, Rosinska M, Trzcinska A i inni. Type specific seroprevalence of HSV-1 and HSV-2 in four geographical regions of Poland. Sex Transm Infect 2006; 82: 159-63. 7. Anderson NW, Buchan BW, Ledeboer NA. Light microscopy, culture, molecular, and serologic methods for detection of herpes simplex virus. J Clin Microbiol 2014; 52: 2-8. 8. Dzieciątkowski T, Majewska A, Krawczyk E. Postacie kliniczne i diagnostyka herpeswirusowych zakażeń skóry. Przegl Dermatol 2007; 94: 195-9. 9. Burns M, Valdiva H: Modelling the limit of detection in real-time quantitative PCR. Eur Food Res Technol 2008; 226: 1513-24. 10. Whitley RJ, Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet 2001; 357: 1513-8. 11. Lachmann R. Herpes simplex virus latency. Expert Rev Mol Med 2003; 5: 1-14 12. Strand A. Diagnosis of genital herpes: the role and place of HSV testing in clinical practice. Eur Clin Obst Gyn 2007; 2: 181-9. 13. Majewska A, Krawczyk E, Łuczak M. Opryszczka narządów płciowych (genital herpes): obraz kliniczny i możliwe następstwa zakażeń. Zakażenia 2005; 5: 61-6. 14. Walczak L, Dzieciątkowski T, Majewska A. Mieszane zakażenie błon śluzowych narządów płciowych wirusami opryszczki pospolitej typu 1 i 2 - opis przypadku i leczenia. Zakażenia 2008; 5: 54-6. 15. van Wagoner NJ, Hook EW 3 rd. Herpes diagnostic tests and their use. Curr Infect Dis Rep 2012; 14: 175-84. 16. Boivin G. Diagnosis of herpesvirus infections of the central nervous system. Herpes 2004; 11: 48-56.
132 P. Machura i inni Nr 2 Otrzymano: 18 V 2015 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny