Acta Sci. Pol., Biotechnologia 5(1-2) 2006, 49-59 WPŁYW RODZAJU PROTEAZY NA PROCES HYDROLIZY BIAŁEK NASION WYBRANYCH ROŚLIN STRĄCZKOWYCH* 1 Michał Świeca, Barbara Baraniak Akademia Rolnicza w Lublinie Streszczenie. Mąki otrzymane z czterech gatunków roślin strączkowych zostały poddane procesowi hydrolizy. W badaniach zastosowano pięć proteaz, róŝniących się optymalnymi warunkami działania i specyficznością substratową. Na podstawie wartości stopnia hydrolizy (DH) wyznaczono optymalny stosunek enzymu do substratu (E/S) w mieszaninie reakcyjnej i czas hydrolizy. Podatność białek na działanie enzymów była warunkowana gatunkiem rośliny i rodzajem uŝytego enzymu, tylko w przypadku bromelainy i proteazy bakteryjnej widoczny był wpływ stosunku E/S i czasu hydrolizy. Białka mąk wszystkich badanych gatunków roślin najintensywniej były hydrolizowane przy uŝyciu pepsyny i trypsyny. Białka grochu odmiany Grapis w przeciwieństwie do odmiany Piast były bardziej podatne na trawienie proteazą bakteryjną i pepsyną. Proteaza bakteryjna była znacznie bardziej aktywna wobec białek zawartych w mąkach otrzymanych z wyki i soczewicy niŝ z obu odmian grochu. Słowa kluczowe: limitowana proteoliza, stopień hydrolizy, strączkowe WSTĘP Od szeregu lat udział w diecie owoców i warzyw jest stale wzrastający, z uwagi na szereg bioaktywnych składników, które dostarczają organizmowi. Nasiona roślin strączkowych są dodatkowo cennym źródłem białka. Obecnie wiele roślin badanych jest pod kątem ich wykorzystania jako pełnowartościowych dodatków do Ŝywności w postaci preparatów białkowych w celu poprawienia jej jakości lub obniŝenia kosztów wytwarzania [Baraniak 1996, Duranti i in. 1997]. * Praca wykonana w ramach tematu PBZ/KBN/031/P06/99 finansowanego przez KBN w latach 2001-2004. Adres do korespondencji Corresponding author: Michał Świeca, Katedra Biochemii i Chemii śywności, Akademia Rolnicza, ul. Skromna 8, 20-950 Lublin, e-mail: mswieca1@poczta.onet.pl
50 M. Świeca, B. Baraniak Strączkowe stanowią duŝą rodzinę roślin, w której wiele gatunków jest uprawianych na skalę przemysłową: fasola (Phaseolus vulgaris), soczewica (Lentil culinaris), groch (Pisum sativum), soja (Glycine max ) i łubin (Lupinus sp.). Suche nasiona tych roślin są waŝnym źródłem białka roślinnego. Białka zapasowe w nasionach strączkowych naleŝą do klasy globulin. Są one generalnie klasyfikowane, wg stałej sedymentacji, na frakcję 11/12 S (legumin like-globulins) i 7/8 S (vicilin-like globulin). Podział ten jest bardzo konserwatywny w obrębie tej klasy roślin [Duranti i in. 1997]. Preparaty białkowe mogą być modyfikowane z zastosowaniem metod fizycznych, chemicznych i\lub na drodze trawienia enzymatycznego. W ostatnich latach gwałtownie wzrosło wykorzystanie enzymów w przemyśle spoŝywczym. Wykazano, Ŝe preparaty białkowe otrzymane w wyniku modyfikacji mąk mogą być znakomitym uzupełnieniem diety. Stosowane są w celu wzbogacania gotowych produktów w białko lub jako Ŝywność specjalnego przeznaczenia (Ŝywność diabetyczna, preparaty antyalergiczne itp.) [Duranti i in. 1997]. Wielkością, która charakteryzuje degradację białka, jest stopień hydrolizy (DH) określający procent wszystkich wiązań w białku, które uległy rozerwaniu podczas proteolizy. Wartość DH zazwyczaj jest określana na podstawie ilości wolnego azotu, uwolnionych aminokwasów lub wolnych grup aminowych powstałych podczas hydrolizy białka. W praktyce stosowane są głównie trzy metody: ph stat, OPA (dialdehyd o-ftalowy) i TNBS (2,4,6-trinitrobenzenu) [Spellman 2003]. Generalnie limitowana hydroliza stosowana jest w celu polepszenia właściwości funkcjonalnych preparatów białkowych, bowiem juŝ 3% stopień hydrolizy znacznie wpływa na poprawę rozpuszczalności, tworzenia piany i zdolności emulgacyjnych preparatów białkowych [Surówka i in. 2004]. Preparaty białkowe otrzymane w wyniku hydrolizy enzymatycznej charakteryzują się lepszymi właściwościami funkcjonalnymi i odŝywczymi, a proces ten pozwala równieŝ na usunięcie niepoŝądanych smaków, zapachów czy substancji anty- odŝywczych z wyjściowych substratów [Lahl i Braun 1994]. Hydroliza enzymatyczna od dawna jest wykorzystywana do modyfikacji właściwości tradycyjnej Ŝywności w procesie dojrzewania serów i wędlin czy w produkcji wyrobów poprzez fermentację, np. sosy sojowe itp. Nasiona roślin strączkowych są dobrym źródłem białka (zawartość ok. 30% suchej masy), skrobi i jonów metali dwuwartościowych [Kozłowska i Troszyńska 1995, Periago 1998]. Z drugiej strony zawartość takich składników, jak kwas fitynowy, polifenole, inhibitory proteaz, jak równieŝ charakterystyczny zapach i kolor limitują ich uŝycie w piekarnictwie [Nielsen i in. 1980; Repetsky 1982]. Przeprowadzone badania jednoznacznie pokazały, Ŝe proces limitowanej hydrolizy poprawia właściwości organoleptyczne i odŝywcze (redukcja zawartości kwasu fitynowego, polifenoli, inhibitorów trypsyny) [Clemente 2000, Flarczyk 1997, Li i in. 1989]. Skład i właściwości produktu otrzymanego w tym procesie zaleŝą od wyjściowego surowca, rodzaju zastosowanych enzymów proteolitycznych oraz warunków prowadzenia reakcji (temperatura, ph, czas prowadzenia reakcji). Oprócz zmian we właściwościach funkcjonalnych preparatów białkowych proces ten powoduje powstawanie peptydów o specyficznych właściwościach biologicznych antyoksydacyjnych, opioidalnych czy antybakteryjnych [Gill i in. 1996, Dziuba i in. 1995]. Celem pracy było określenie wpływu czasu hydrolizy i rodzaju enzymu na stopień hydrolizy białek obecnych w mąkach nasion wybranych roślin strączkowych. Acta Sci. Pol.
Wpływ rodzaju proteazy... 51 MATERIAŁ I METODY BADAŃ Surowcem do badań były suche nasiona czterech roślin strączkowych: Pisum sativum (groch odm. Grapis), Pisum sativum (groch odm. Piast), Lens culinaris (soczewica odm. Anita) i Vica sativa (wyka odm. Kwarta) pozyskane z Przedsiębiorstwa Nasiennictwa, Ogrodnictwa i Szkółkarstwa w OŜarowie Mazowieckim. Proces hydrolizy Nasiona zostały rozdrobnione za pomocą młynka mechanicznego. Białka zawarte w badanych mąkach poddano hydrolizie enzymatycznej pięcioma proteazami: trypsyną (bufor 0,2 M Tris-HCl ph 7,5; 1,13 BaEE U\mg Sigma), chymotrypsyną (bufor 0,2 M Tris-HCl ph 7,5; 52 U\mg sigma), pepsyną (0,1 M HCl ph 2,5; 515 U\mg Sigma), proteazą bakteryjną z Bacillus polymyxa (bufor 0,2 M Tris-HCl ph 7,5; 0,52U\mg u Sigma) oraz bromelainą (bufor Mc Ilvaine`a ph 4,5; 1530U\mg Sigma) w optymalnych warunkach ich działania. Przeprowadzono równieŝ badania wpływu stęŝenia enzymu do substratu, prowadząc hydrolizę w układach: 1:10, 1:100 i 1:1000. Do 10 gram mąki roztworzonych w 100 ml odpowiedniego buforu dodawano 10 ml roztworu enzymu (50 mg w 50 ml bufory Tris-HCl ph 7,5; wariant 1:10). Stosując odpowiednio rozcieńczone roztwory badanych enzymów wyznaczając wpływ stosunku E:S na proces hydrolizy. Proces prowadzono w temperaturze 37 C. Stopień hydrolizy (DH) określany był po czasie 5, 10, 30, 50, 70, 90 i 110 minut. Enzymy były inaktywowane dwustopniowo poprzez dodatek 1 ml 1% TCA (kwas trichlorooctowy) i denaturację termiczną (15 min; 90 C). Otrzymaną zawiesinę wirowano przy 4000 g przez 20 min i neutralizowano za pomocą 0,2M NaOH do ph 7,5. Oznaczenie stopnia hydrolizy (DH) W przesączach oznaczono białko metodą Lowry`ego wobec albuminy wołowej jako wzorca [Lowry i in. 1951]. Zawartość wolnych aminokwasów i peptydów została określona spektrofotometrycznie w reakcji z TNBS wobec leucyny i leucyno-glicyny jako wzorców [Habeeb 1966]. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Zgodnie z oczekiwaniami oraz rezultatami otrzymanymi przez innych badaczy wzrost stosunku stęŝenia E/S oraz czasu hydrolizy prowadził do obniŝenia poziomu białka w hydrolizowanych mąkach oraz wzrostu poziomu uwolnionych peptydów i wolnych aminokwasów [Surówka i in. 2004, Periago i in. 1997]. Podatność białek na działanie enzymów warunkowana była gatunkiem rośliny, z której otrzymano mąki i rodzajem enzymu uŝytego w procesie hydrolizy. Jak wynika z przebiegu krzywych procesu hydrolizy, najintensywniej proces ten zachodził w pierwszych 30 minutach reakcji (rys. 1-5 a,b). Tylko w przypadku enzymów najmniej efektywnych (bromeleina i proteaza bakteryjna) widoczny był wpływ stęŝenia enzymu i czasu hydrolizy (rys. 3-4a, b). Podobne rezultaty otrzymali Netto i Galeazzi [1998] prowadząc trawienie pankreatyną białkowych izolatów z soi (SPI) oraz Kimm i in. [1990] przy zastosowaniu w analogicznym procesie trypsyny. Wyniki te moŝna tłumaczyć przytaczając teorię postulowaną przez Constantnidesa i Adu-Amankwa [1980], którzy sugerują, iŝ obserwowany spadek tempa hydrolizy moŝe wiązać się ze Biotechnologia 5(1-2) 2006
Wpływ rodzaju proteazy... 57 nokwasów widać jednak, Ŝe stopień hydrolizy wyznaczony w oparciu o te parametry jest zbliŝony. Białko mąki otrzymanej z grochu odmiany Piast było najbardziej podatne na trawienie enzymatyczne. Stopnie hydrolizy wyznaczone w oparciu o ilość peptydów oznaczonych z TNBS wynoszą 31,1% dla pepsyny i 25,55% dla trypsyny (rys. 1b, 2b). Wartości wyliczone na podstawie poziomu białka potwierdzają otrzymane wyniki tylko w przypadku zastosowania pepsyny (rys. 1a, 2a). Modyfikacja trypsyną dała rezultaty (9,8%) zbliŝone do otrzymanych dla mąk pozyskanych z grochu odmiany Grapis (10,2%) i wyki (9,4%). Najmniej podatna na hydrolizę była mąka otrzymą z soczewicy odm. Anita, gdzie DH dla preparatów trypsynowanych wynosił 6,3% (białko) i 17,5% (peptydy) (rys. 1b). Hydrolizą białek zawartych w mące otrzymanej z grochu zajmowali się równieŝ Periago i in. [1998]. W swoich badaniach przy zastosowaniu proteazy z Aspergillus saitoi uzyskali ok. 11% DH podczas 90-minutowego trawienia w temperaturze 40 C w układzie E:S- 1:10. Badania dotyczące hydrolizy białek otrzymanych z grochu przy uŝyciu trypsyny prowadzili Niezabitowska i in. [2002], porównując wpływ metody otrzymywania koncentratów białkowych na ich późniejszą podatność na działanie enzymów proteolitycznych. Cytowani autorzy wykazali, Ŝe sposób pozyskania preparatów białkowych, w przypadku roślin strączkowych, ma kluczowe znaczenie i znacząco wpływa na proces hydrolizy enzymatycznej. W niniejszych badaniach zbliŝone wartości stopnia hydrolizy, niezaleŝnie od sposobu oznaczania, otrzymano w obrębie tego samego gatunku rośliny w przypadku uŝycia pepsyny. Tylko białka mąk pozyskane z grochów odmian Grapis i Piast wykazywały nieznacznie wyŝszy stopień hydrolizy przy wykorzystaniu metody bazującej na ilości uwolnionych peptydów (rys. 1-5 B). Modyfikacja enzymatyczna przy wykorzystaniu trypsyny powodowała uwalnianie największej ilości peptydów z białek zawartych w badanych mąkach, o czym świadczą wysokie wartości DH wyznaczone w rekcji z TNBS. Uzyskane rezultaty sugerują stosowanie tego enzymu w procesie otrzymywania peptydów, o potencjalnie poŝądanych aktywnościach biologicznych. W mące otrzymanej z grochu odmiany Piast stopień hydrolizy obliczony na podstawie ilości uwolnionych peptydów był o ok. 150% wyŝszy niŝ w oparciu o poziom białka. RównieŜ pozostałe preparaty wykazywały podobną zaleŝność, przy czym wartość ta wynosiła ok. 100%. PODSUMOWANIE Reasumując, moŝna stwierdzić, Ŝe białka zawarte w mąkach badanych roślin strączkowych stanowią dobry materiał do hydrolizy przy uŝyciu testowanych enzymów proteolitycznych. Optymalizacja procesów trawienia wykazała, iŝ kluczowym problemem jest dobór odpowiedniego enzymu oraz prowadzenie procesu w odpowiednich warunkach. Zmiany stosunku E/S tylko w przypadku bromelainy i proteazy bakteryjnej róŝnicowały ilość uwolnionych peptydów, połączoną z obniŝeniem poziomu białka. Pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna najintensywniej rozkładały białka w badanych mąkach w czasie pierwszych 30 minut trwania procesu i stęŝenie enzymu w tych przypadkach nie odgrywało istotnej roli. Najefektywniejsza w działaniu wobec białek wszystkich badanych roślin okazała się pepsyna i trypsyna. Proteaza bakteryjna wykazywała większą Biotechnologia 5(1-2) 2006
58 M. Świeca, B. Baraniak aktywność wobec białek wyki i soczewicy niŝ obu odmian grochu. Wyraźnie zarysowała się tendencja uwolnienia duŝej ilości peptydów pod wpływem działania trypsyny. PIŚMIENNICTWO Adler-Nissen J., 1986. Chapter title In. Enzymatic Hydrolisis Of Food Proteins. Novo Industri S/A Elsevier London. Baraniak B., 1996. Sojowe preparaty białkowe. Ogólnopolska Konf. Naukowa Strączkowe rośliny białkowe II. Soja. Lublin 28 listopada 1996. Clemente A., 2000. Enzymatic protein hydrolyzates in human nutrition. Trends Food Sci. Tech.11, 254-262. Constantinides A., Adu-Amankwa B., 1980. Enzymatic modification of vegetable protein: mechanisms, kinetics, and production of soluble and partially soluble protein in a batch reactor. Biotech. and Bioeng. XXIII, 1543-1580. Duranti M., Gius C., 1997. Legume seeds: protein content and nutritional value, field Crops Research 53, 31-45. Dziuba J., Minkiewicz P., Puszka K., Dąbrowski S., 1995. Plant seed storage protein as potential precursors of bioactive peptides. Pol. J. Food Nutr. Sci. 4/45 (3), 31-42. Flarczyk E., 1997. Zalety technologiczne i Ŝywieniowe hydrolizatów białkowych. Cz. 2: Przem. SpoŜ. 51, 43-45. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X., Vulfson E., 1996. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production. Enzyme Microb. Technol. 18, 162-183. Habeeb A.F.S.A. 1966. Determination of free amino groups in protein by trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 14, 328-336. Kimm S.Y., Park P.S., Rhee K.C., 1990. Functional properties of proteolitic enzyme modified soy protein isolates. J. Agric. Food Chem. 38, 651-656. Kozłowska H., Troszyńska A., 1995. Substancje zapasowe nasion roślin strączkowych. Postępy Nauk Rol. 6, 75-82. Lahl J.W., Braun S.D., 1994. Enzymatic production of protein hydrolisates for food use. Food Technol. 48 (10), 68-71. Li Z., Alli I., Kermasha S., 1989. Tryptic hydrolisis (in vivo) of crystalline and non-crystalline proteins from Phaseolus bean. J. Agric Food Chem. 37, 634-647. Lowry O., Rosebrough N., Farr A., Randal R.J. 1951. Protein measurement with Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-268. Netto F.M., Galeazzi M.A.M., 1998. Production and characterization of enzymatic hydrolysate from Soy Protein Isolate. Lebensm.-Wiss. u.- Technol., 31, 624-631. Nielsen M.A., Summer A.K., Whalley L.L., 1980. Fortification of pasta with pea flour and airclassified pea protein concentrate. Cereal Chemistry. 57, 203-206. Niezabitowska M., Baraniak B., Harkot A., 2002. Trypsynowa hydroliza izolatów białkowych z grochu otrzymanych róŝnymi metodami. XXXIII Sesja Naukowa Komitetu Technologii i Chemii śywności PAN. Lublin 10-11 września 2002. Periago M.J., Vidal M.L., Ros G., Rincón F., Martinez C., López G., Rodrigo J., Martinez I., 1998. Influence of enzymatic treatment on the nutritional and functional prosperities of pea flour. Food Chem. 63(1), 71-78. Repetsky J.A., Klein B.P., 1982. Partial replacement of wheat flour with yellow pea flour in with bread. J. Food Sci. 47, 326-327. Acta Sci. Pol.
Wpływ rodzaju proteazy... 59 Spellman D., McEvoy E., O`Cuinn G., FitzGerald R.J., 2003. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of TNBS, OPA and ph stat methods for quantification of degree of hydrolysis. Int. Dairy J. 13, 447-453. Surówka K., śmudziński D., Fik M., Macura R., Łasocha W., 2004. New protein preparation from soy flour obtained by limited enzymic hydrolysis of extrudates. Innovat. Food Sci. Emerg. Technol. 5, 225-234. EFFECT OF PROTEASES TYPE ON PROTEOLYSIS PROCESS OF SELECTED LEGUME SEEDS PROTEIN Abstract: Flours obtained from four species of legumes plants were undergone hydrolysis process. In study five proteases were used, different in optimal conditions of work and substrate specificity. In foothold about degree of hydrolysis function of optimal ratio enzyme: substrate in reaction mix and time of hydrolysis were set. The vulnerability of protein on enzyme impact was conditioned by plant species and kind of enzyme, only in bromelaine and bacterial protease case influence of E/S ratio and time of hydrolysis was visible. Flours all investigated plants the most effective were hydrolyzed by pepsin and trypsin. Proteins Grapis pea in contrary to Piast were more vulnerable on digestion with bacterial protease and pepsin. Bacterial protease was significantly more active against flours obtained from vetch and lentil than two strain of pea. Key words: limited hydrolysis, degree of hydrolysis, legume Zaakceptowano do druku Accepted for print: 20.11.2006 Biotechnologia 5(1-2) 2006