RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197043 (21) Numer zgłoszenia: 344222 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 17.02.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 17.02.1999, PCT/US99/03429 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 26.08.1999, WO99/41974 PCT Gazette nr 34/99 (51) Int.Cl. C12N 15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) A01H 1/00 (2006.01) A01H 5/10 (2006.01) C12N 5/04 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) (54) Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego (30) Pierwszeństwo: 19.02.1998,US,09/026,039 (73) Uprawniony z patentu: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA,Oakland,US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 08.10.2001 BUP 21/01 (72) Twórca(y) wynalazku: Diane Jofuku K.,Santa Cruz,US Jack K. Okamuro,Santa Cruz,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.02.2008 WUP 02/08 (74) Pełnomocnik: Chlebicka Lidia, KULIKOWSKA & KULIKOWSKI PL 197043 B1 (57) 1. Sposób modulowania cech nasion roślin, znamienny tym, że dostarcza się pierwszą roślinę zawierającą zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, prowadzi się samozapylenie pierwszej rośliny lub skrzyżowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, dla wytworzenia wielości nasion; i selekcjonuje się nasiona ze zmienioną masą lub ze zmienioną zawartością węglowodanów, białka lub olejów.
2 PL 197 043 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób modulowania cech nasion, w szczególności wpływania na masę i inne własności nasion, nasienie oraz roślina transgeniczna, uzyskane przy pomocy technik inżynierii genetycznej, oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego. Wzór rozwoju kwiatów kontrolowany jest przez merystem roślinny, złożoną tkankę której komórki dają początek różnorodnym systemom organów roślin. Badania genetyczne i ewolucyjne umożliwiły zdefiniowanie ewolucyjnie konserwowanych sieci genowych kontrolujących tożsamość merystemu roślinnego i rozwój organów roślinnych u Arabidopsis, wyżlinu i innych gatunków roślin (patrz np. Coen, Carpenter Plant Cell 5: 1175-1181 (1993) i Okamuro i wsp. Plant Cell 5: 1183-1193 (1993). U Arabidopsis roślinny gen homeotyczny APETALA2 (AP2) kontroluje trzy istotne aspekty ontogenezy rośliny - powstanie merystemu roślinnego (Irish, Sussex Plant Cell 2: 741-753 (1990); Huala, Sussex Plant Cell 4: 901-913 (1992); Bowman i wsp Development 119: 721-743 (1993); Schultz i Haughun Development 119: 745-765 (1993); Shannon, Meeks-Wagner Plant Cell 5" 639-655 (1993), określenie tożsamości organu rośliny (Komaki i wsp Development 104: 195-203 (1988); Bowman i wsp Plant Cell 1: 37-52 (1989); Kunst i wsp. Plant Cell 1: 1195-1208 (1989) oraz regulację czasoprzestrzenną ekspresji roślinnego genu homeotycznego (Bowman i wsp Plant Cell 3: 749-758 (1991); Drews i wsp Cell 65: 91-102 (1991). Wczesną funkcją genu AP2 w czasie rozwoju rośliny jest wywoływanie powstania merystemu roślinnego. AP2 wykonuje tę rolę we współdziałaniu z co najmniej trzema innymi genami związanymi z merystemem APETALA1 (AP1), LEAFY (LFY) i CAULIFLOWER (CAL) (Irish, Sussex (1990); Bowman Flowering Newsletter 14: 7-19 (1992); Huala, Sussex (1992); Bowman i wsp (1993); Schultz, Haughn (1993), Shannon, Meeks-Wagner (1993). Drugą funkcją AP2 jest regulowanie rozwoju organów rośliny. U Arabidopsis merystem roślinny wytwarza cztery koncentryczne kręgi lub obręcze organów roślinnych - listki kielicha, płatki, pręciki i owocolistki. Przy częściowym braku funkcji genu AP2 (mutant ap2), płatki korony przekształcane są homeotycznie w liście, a płatki kielicha w wytwarzające pyłek organy pręcikopodobne (Bowman i wsp Development 112: 1-20 (1991). Odmiennie zachowują się silne mutanty ap2, płatki korony przekształcane są w owocolistki niosące zalążki, rozwój płatków korony jest zahamowany, liczba pręcików jest zredukowana, a funkcje pylników są często defektywne (Bowman i wsp (1991)). Ostatecznie wpływ ap2 na rozwój organów rośliny wynika po części z trzeciej funkcji AP2, którą jest pośrednie lub bezpośrednie regulowanie ekspresji kilkunastu roślinnych genów homeotycznych kontrolujących kwitnienie (Bowman i wsp. Plant Cell 3: 749-758 (1991); Drews i wsp Cell 65: 91-102 (1991); Jack i wsp Cell 68: 683-697 (1992); Handel i wsp Cell 71: 133-143 (1992)). Bez wątpienia Ap2 odgrywa istotną rolę w regulowaniu rozwoju Arabidopsis. Nadal mało wiadomo o tym, w jaki sposób gen ten działa na poziomie komórkowym i molekularnym. Zaproponowano modele przestrzenne i kombinatoryczne w celu wyjaśnienia roli AP2 i innych roślinnych genów homeotycznych w określaniu tożsamości organów rośliny patrz np. Coen, Carpenter dz. cyt.) Zasadniczą przesłanką wspomnianego modelu jest to, iż AP2 i drugi roślinny gen homeotyczny AGAMOUS (AG) są genami wzajemnie antagonistycznymi. Zatem AP2 reguluje w sposób negatywny ekspresję genu AG w płatkach korony i kielicha, i odwrotnie, AG reguluje negatywnie ekspresję genu AP2 w owocolistkach i pręcikach. Analiza z zastosowaniem techniki hybrydyzacji in situ wzoru ekspresji genu AG w roślinach dzikich i w mutantach ap2 wykazała iż AP2 jest w rzeczywistości negatywnym regulatorem ekspresji AG. Jednakże, nie wiadomo nadal w jaki sposób AP2 kontroluje AG. Nie wiadomo również w jaki sposób AG wpływa na aktywność genu AP2. Gen AP2 Arabidopsis wyizolowano stosując mutagenezę insercyjną z T-DNA, tak jak opisał to Jofuku i wsp. The Plant cell 6: 1211-1225 (1994). Gen AP2 koduje domniemany czynnik jądrowy, niepodobny do żadnych znanych grzybowych czy zwierzęcych białek regulacyjnych. Wyniki wskazują iż aktywność genu AP2 i jego funkcja nie są ograniczone do roślin rozwijających się, co sugeruje, iż może on odgrywać znacznie szerszą rolę w regulowaniu rozwoju Arabidopsis, niż to wcześniej przypuszczano. Niezależnie od postępu w definiowaniu czynników genetycznych kontrolujących rozwój rośliny, dokonano niewielkiego postępu w identyfikacji i analizie genów wpływających na agronomicznie istotne cechy rośliny, takie jak wielkość nasion, zawartość białka, zawartość tłuszczu i podobne. Poznanie takich genów umożliwiłoby konstruowanie technikami inżynierii genetycznej roślin o pożądanych cechach. Wynalazek jest odpowiedzią na te postulaty.
PL 197 043 B1 3 Sposób modulowania cech nasion roślin według wynalazku charakteryzuje się tym, że dostarcza się pierwszą roślinę zawierającą zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, prowadzi się samozapylenie pierwszej rośliny lub skrzyżowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, dla wytworzenia wielości nasion; i selekcjonuje się nasiona ze zmienioną masą lub ze zmienioną zawartością węglowodanów, białka lub olejów. W korzystnym wykonaniu ekspresja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC i etap selekcjonowania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zwiększoną masą, posiadającego zwiększoną zawartość białka, zawartość węglowodanów lub zawartość oleju. W innym korzystnym wykonaniu kwas nukleinowy ADC przyłączony jest do promotora roślinnego w orientacji antysensownej. Korzystnie, pierwsza i druga roślina mogą należeć do tego samego gatunku. Promotor roślinny może być promotorem konstytutywnym, korzystnie promotorem 35S z CaMV. Promotor może być promotorem tkankowo specyficznym, korzystnie specyficznym względem zalążka. W innym korzystnym wykonaniu ekspresja kwasu nukleinowego ADC wzmaga ekspresję endogennego genu ADC i etap selekcjonowania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zmniejszoną masą, przy czym pierwsza i druga roślina mogą należeć do tego samego gatunku, a promotor roślinny może być promotorem konstytutywnym, korzystnie promotorem 35S z CaMV. Promotor może być promotorem tkankowo specyficznym, korzystnie specyficznym względem zalążka. Zgodnie ze sposobem według wynalazku kwas nukleinowy ADC może hybrydyzować do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1. Zgodnie ze sposobem według wynalazku kwas nukleinowy ADC hybrydyzować może do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2. Przedmiotem wynalazku jest także nasienie zawierające zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC, posiadający sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, oraz moduluje masę nasienia, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu. Korzystnie, nasienie zawiera kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego w orientacji antysensownej i masa nasienia jest co najmniej około 10% większa od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. Korzystnie, masa nasienia jest co najmniej około 20% większa od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej, bardziej korzystnie co najmniej około 50% większa. Korzystnie, w nasieniu jest proporcjonalnie zwiększona zawartość oleju lub zawartość białka. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku nasienie posiada kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego w orientacji sensownej i masa nasienia jest co najmniej około 10% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. Korzystnie, masa nasienia jest wówczas co najmniej około 20% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej, bardziej korzystnie co najmniej około 50% mniejsza.
4 PL 197 043 B1 W przykładzie wykonania wynalazku nasienie posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C. Korzystnie, kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1. W innym przykładzie wykonania wynalazku nasienie posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C. Korzystnie, kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2. Przedmiotem wynalazku jest ponadto roślina transgeniczna zawierająca kasetkę ekspresyjną obejmującą promotor roślinny przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznego polinukleotydu ADC, przy czym polinukleotyd ADC zawiera sekwencję nukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C i moduluje masę, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu rośliny. Korzystnie, heterologiczny polinukleotydy ADC w kasetce ekspresyjnej rośliny koduje polipeptyd ADC, przy czym heterologiczny polinukleotyd ADC przyłączony jest do promotora w orientacji antysensownej. W korzystnym wykonaniu wynalazku roślina transgeniczna posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku roślina transgeniczna posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2. Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca kasetkę ekspresyjną obejmującą roślinny promotor przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznego polinukleotydu ADC, przy czym polinukleotyd ADC zawiera kwas nukleinowy hybrydyzujący do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, i moduluje masę, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu rośliny. W wyizolowanej cząsteczce kwasu nukleinowego heterologiczny polinukleotyd ADC koduje polipeptyd ADC, przy czym korzystnie heterologiczny polinukleotyd ADC przyłączony jest do promotora w orientacji antysensownej. W korzystnym wykonaniu wynalazku wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1. W drugim korzystnym wykonaniu wynalazku wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50 C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
PL 197 043 B1 5 Wynalazek dostarcza zatem sposobu wpływania na masę nasienia i inne cechy roślin. Sposób obejmuje dostarczenie rośliny posiadającej zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC przyłączony do roślinnego promotora. Roślina jest albo samozapylana albo krzyżowana z drugą rośliną w celu wytworzenia wielości nasion. Nasiona z pożądaną cechą (np. zmienioną masą) są następnie selekcjonowane. W niektórych zastosowaniach transkrypcja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC lub aktywność kodowanego przezeń białka. W tych zastosowaniach etap wybierania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zwiększoną masą lub inną cechą. Nasienie może na przykład posiadać zwiększoną zawartość białka, zwiększoną zawartość węglowodanów lub oleju. W przypadku zwiększonej zawartości oleju, rodzaje kwasów tłuszczowych mogą być zmienione lub mogą pozostać takie same jak w linii rodzicielskiej. W tych zastosowaniach kwas nukleinowy ADC może być podłączony do roślinnego promotora w orientacji sensownej lub antysensownej. Alternatywnie, ekspresja kwasu nukleinowego ADC może wzmagać ekspresję endogennego genu ADC lub aktywność ADC i wtedy etap wybierania obejmuje selekcjonowanie nasion o zmniejszonej masie. Zastosowanie to jest szczególnie użyteczne do wytwarzania beznasiennych odmian roślin przemysłowych. Jeżeli pierwsza roślina krzyżowana jest z rośliną drugą, wymienione dwie rośliny mogą należeć do tego samego lub innych gatunków. Rośliny mogą być dowolnymi roślinami wyższymi, na przykład mogą należeć do rodziny Brassicaceae lub Solanaceae. Do wytwarzania nasion według wynalazku, zarówno roślina męska jak żeńska mogą obejmować kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC. W korzystnym zastosowaniu obie rośliny rodzicielskie zawierają wspomnianą kasetkę ekspresyjną. W obrębie wspomnianej kasetki ekspresyjnej promotor roślinny może być promotorem konstytutywnym, na przykład promotorem CaMV 355. Alternatywnie, promotor może być promotorem tkankowo-specyficznym. Przykłady tkankowo-specyficznej ekspresji użytecznej w wynalazku obejmują ekspresję specyficzną względem owoców, nasion (np. specyficzną względem zalążków, zarodka, endospermu, przegrody lub łupiny). Wynalazek dostarcza również nasion wytworzonych sposobami opisanymi powyżej. Nasienie według wynalazku obejmuje zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC. Jeżeli kasetka ekspresyjna stosowana jest w celu zahamowania ekspresji endogennej ADC, nasienie będzie miało masę co najmniej 20% większą niż średnia masa nasienia rośliny tej samej odmiany, nie posiadającej zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. Jeżeli zrekombinowaną kasetka ekspresyjna została włączona w celu wzmożenia ekspresji ADC, nasiona będą miały masę o co najmniej 20% mniejszą niż średnia masa nasienia rośliny tej samej odmiany, nie posiadającej wspomnianej zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. W podobny sposób można zmieniać inne cechy rośliny, takie jak zawartość białka, węglowodanów i oleju. Definicje Termin sekwencja kwasu nukleinowego" odnosi się do jedno- lub dwuniciowego polimeru deoksyrybonukleinowego lub rybonukleinowego, odczytywanego od końca 5' do 3'. Sekwencja obejmuje chromosomalny DNA, samo-replikujące się plazmidy, infekcyjne DNA lub RNA i DNA lub RNA pełniące funkcje zasadniczo strukturalne. Termin promotor" odnosi się do regionu lub sekwencji umiejscowionej w kierunku 5' lub 3' od miejsca startu transkrypcji i zaangażowanej w rozpoznawanie i wiązanie polimerazy RNA i innych czynników inicjacji transkrypcji. Roślinny promotor" jest promotorem zdolnym do inicjowania transkrypcji w komórkach roślinnych. Termin roślina" obejmuje całe rośliny, organy roślin (np. liście, pędy, kwiaty, korzenie itp), nasiona lub komórki roślinne i ich potomstwo. Klasa roślin mogących być zmienianymi przy zastosowaniu sposobu według wynalazku, jest zasadniczo tak szeroka jak klasa roślin wyższych podatnych na transformowanie, włączając w to okrytonasienne (jedno- i dwuliścienne), jak również nagonasienne. Klasa ta obejmuje rośliny o różnym poziomie ploidii, włączając w to rośliny poliploidalne, diploidalne, haploidalne i hemizygotyczne. Sekwencja polinukleotydowa jest heterologiczna względem" organizmu lub drugiej sekwencji polinukleotydowej jeśli pochodzi z obcego gatunku lub, jeśli pochodzi z tego samego gatunku, jest zmodyfikowana w stosunku do formy wyjściowej. Na przykład promotor przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznej sekwencji kodującej dotyczy sekwencji kodującej z gatunku różnego od tej, z której pochodzi promotor lub, jeśli pochodzi z tego samego gatunku, to sekwencja kodująca jest odmienna od naturalnie występujących wariantów allelicznych. Jak zdefiniowano poniżej
6 PL 197 043 B1 sekwencja ADC będąca heterologiczna w stosunku do sekwencji ADC przyłączonej w sposób umożliwiający działanie do promotora, nie obejmuje mutantów insercyjnych T-DNA (np. ap2-10), jak opisano to przez Jofuku i wsp The Plant Cell 6: 1211-1225 (1994). Polinukleotyd egzogenny" względem określonej rośliny jest polinukleotydem wprowadzanym do rośliny sposobami innymi niż krzyżowanie. Przykłady sposobów, które można w tym celu wykorzystać, podano poniżej i obejmują one transformację z udziałem Agrobacterium, metodę balistyczną, elektroporację i podobne. Rośliny takie, zawierające egzogenny kwas nukleinowy określone są tu jako pokolenie R 1 rośliny transgenicznej. Rośliny transgeniczne powstałe w wyniku krzyżowania lub przez samozapylanie są potomstwem wspomnianej rośliny. Kwas nukleinowy ADC (zawierający domenę AP2)" lub sekwencja polinukleotydowa ADC" według wynalazku jest podsekwencją lub pełną sekwencją polinukleotydową genu kodującego polipeptyd obejmujący domenę AP2 i która obecna w roślinie transgenicznej może być użyta do modulowania cech nasienia w roślinach wytwarzanych przez roślinę. Przykładową sekwencją kwasu nukleinowego według wynalazku jest sekwencja AP2 Arabidopsis według Jofuku i wsp The Plant Cell 6: 1211-1225 (1994). Numer w bazie sekwencji GeneBank U12546. Jak wyjaśniono to dokładnie poniżej, rodzina genów RAP2 (spokrewniona z AP2) została zidentyfikowana w roślinach Arabidopsis. Wspomniana klasa kwasów nukleinowych dzieli się co najmniej na dwie podklasy (AP2 -podobne i EREBP- -podobne), które można rozróżnić w oparciu na przykład o ilość domen AP2 zawartych w obrębie każdego polipeptydu i przez sekwencje w obrębie sekwencji konserwowanych ewolucyjnie. Różnice pomiędzy wspomnianymi podklasami będą przedstawione poniżej dokładnie. Polinukleotydy ADC definiowane są w oparciu o ich zdolność do hybrydyzowania w określonych warunkach z przykładowym kwasem nukleinowym lub produktem PCR utworzonym w oparciu o wspomniane sekwencje. Polinukleotyd ADC np AP2 lub RAP2 liczy typowo około 30-40 nukleotydów to około 3000, zwykle mniej niż około 5000 nukleotydów. Zazwyczaj kwasy nukleinowe liczą od około 100 do około 2000 nukleotydów, często od około 500 do około 1700 nukleotydów. Kwas nukleinowy ADC, jak wyjaśniono to szczegółowo poniżej, stanowi nową klasę roślinnych genów regulatorowych kodujących polipeptydy ADC, rozróżnialne na podstawie obecności jednego lub więcej motywu powtarzalnego o długości 56-68 aminokwasów, oznaczanego dalej jako domena AP1". Sekwencja aminokwasowa przykładowego polipeptydu AP2 przedstawiona została przez Jofuku i wsp dz. cyt. Specjaliści wiedzą, iż w świetle wynalazku można dokonać wielu modyfikacji (np. substytucji, addycji, delecji) w obrębie sekwencji tam przedstawionych, bez zasadniczego wpływania na ich funkcje. Warianty te określane są zbiorczym terminem polipeptyd ADC lub polinukleotyd ADC. W przypadku wspólnej ekspresji transgenów i inhibicji endogennych genów (np. poprzez strategię antysensów lub supresję sensowną) specjaliści wiedzą, iż wprowadzona sekwencja polinukleotydowa niekoniecznie musi być identyczna, lecz może być zasadniczo identyczna" z sekwencją genu z którego się wywodzi. Jak wyjaśniono to poniżej, wspomniane zasadniczo identyczne, warianty określane są zbiorczym terminem kwas nukleinowy ADC. W przypadku, gdy wprowadzana sekwencja polinukleotydowa ulega transkrypcji i translacji z wytworzeniem funkcjonalnego polipeptydu, specjaliści wiedzą, iż ze względu na degenerację kodu genetycznego wiele różnych sekwencji polinukleotydowych kodować może ten sam polipeptyd. Wspomniane warianty określane są zbiorczym terminem kwas nukleinowy ADC", kwas nukleinowy AP2" i kwas nukleinowy RAP2". Ponadto wspomniany termin obejmuje sekwencje o pełnej długości zasadniczo identyczne (co określono w sposób podany poniżej) z sekwencją polinukleotydową ADC i kodują one białka zachowujące funkcje polipeptydu ADC (np. sekwencje otrzymane w wyniku konserwatywnych podstawień aminokwasowych w polipeptydzie AP2). Ponadto, warianty te mogą kodować mutanty dominujące negatywnie, co przedstawiono poniżej. Dwie sekwencje nukleinowe lub polipeptydy są identyczne" jeżeli odpowiednio sekwencja nukleotydów lub reszt aminokwasowych, we wspomnianych dwu sekwencjach jest taka sama po przyrównaniu zachowującym maksymalną odpowiedniość, jak przedstawiono to poniżej. Termin komplementarny względem" stosowany poniżej oznacza, że sekwencje komplementarne są identyczne w całości lub części w stosunku do referencyjnej sekwencji polinukleotydowej. Porównanie sekwencji pomiędzy dwoma lub więcej polinukleotydami lub polipeptydami prowadzone jest typowo przez porównanie sekwencji dwu wspomnianych sekwencji w obrębie okienka porównywania" w celu identyfikacji i porównania podobieństwa lokalnych regionów lub sekwencji. Termin okienko porównywania" stosowany poniżej dotyczy segmentu co najmniej 20 sąsiadujących pozycji, zwykle od około 50 do około 200, częściej od około 100 do około 150, w obrębie którego se-
PL 197 043 B1 7 kwencje można porównywać z sekwencją wzorcową o tej samej liczbie sąsiadujących pozycji, przyjmując optymalne ustawienie porównywalnych sekwencji. Optymalne ustawienie (optimal alignment) sekwencji w celu ich porównywania można przeprowadzić stosując algorytm lokalnej homologii według Smitha i Watermana Adv Appl Math 2: 482 (1981), algorytm zestawienia homologicznego według Needlemana i Wunsha J Mol Biol 48: 443 (1970), metodę poszukiwania podobieństw Pearsona i Lipmana PNAS (USA) 85: 2444 (1988), komputerowe postaci wspomnianych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA, zawarte w handlowym zestawie Wisconsin Genetics Software Package, Genetic Computing Group (GCG), 575 Science Dr, Madison, USA) lub ręcznie. Procent identyczności sekwencji" określany jest przez porównanie dwu optymalnie zestawionych sekwencji w okienku porównywania, gdzie część sekwencji polinukleotydowej w okienku porównywania może obejmować addycje lub delecje (przerwy) w porównaniu do sekwencji wzorcowej (nie zawierającej addycji lub delecji), dla optymalnego zestawienia obu sekwencji. Procentowość wyliczana jest przez porównanie ilości pozycji, w których w obu sekwencjach występują identyczne zasady nukleinowe lub reszty aminokwasowe, dając liczbę pozycji całkowicie odpowiadających sobie, i podzielenie liczby pozycji całkowicie odpowiadających sobie przez liczbę całkowitą pozycji w okienku porównywania i pomnożenie uzyskanego wyniku przez 100, co daje procent identyczności sekwencji. Termin zasadnicza identyczność" sekwencji polinukleotydowych oznacza, że polinukleotyd obejmuje sekwencję która wykazuje co najmniej 60% identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 80% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie 90% identyczności sekwencji, najkorzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji, w porównaniu do sekwencji wzorcowej, z zastosowaniem programów przedstawionych powyżej (korzystnie programu BLAST), z zastosowaniem standardowych parametrów. Specjaliści wiedzą, iż wspomniane wartości można w sposób właściwy ustalić w celu określenia identyczności białek kodowanych przez dwie sekwencje nukleotydowe, biorąc pod uwagę degenerację kodu, podobieństwo aminokwasów, umiejscowienie ramki odczytu itp. Zasadnicza identyczność sekwencji aminokwasowych oznacza normalnie identyczność sekwencji co najmniej o wartości 35%, korzystnie co najmniej 60%, bardziej korzystnie co najmniej 90% i najkorzystniej co najmniej 95%. Zasadniczo podobne" polipeptydy posiadają wspólną sekwencję, jak podano to powyżej, za wyjątkiem tego, że pozycje nie identyczne mogą być zajmowane przez podobne (konserwowane ewolucyjnie) aminokwasy. Konserwowane ewolucyjnie podstawienia aminokwasowe dotyczą zamienności reszt aminokwasowych o podobnych właściwościach ich łańcuchów bocznych. Na przykład grupa aminokwasów z alifatycznym łańcuchem bocznym obejmuje glicynę, alaninę, walinę, leucynę i izoleucynę, grupa aminokwasów posiadających alifatyczno-hydroksylowy łańcuch boczny obejmuje serynę i treoninę, grupa aminokwasów posiadająca aminowy łańcuch boczny obejmuje asparaginę i glutaminę, grupa aminokwasów posiadająca aromatyczny łańcuch boczny obejmuje fenyloalaninę, tyrozynę i tryptofan, grupa aminokwasów posiadająca zasadowy łańcuch boczny obejmuje lizynę, argininę i histydynę, i grupa aminokwasów posiadająca łańcuch zawierający siarkę obejmuje cysteinę i metioninę. Preferowane grupy konserwatywnych podstawień to: walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina- -tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina i asparagina-glutamina. Innym wskaźnikiem zasadniczego podobieństwa sekwencji nukleotydowych jest zdolność dwu sekwencji do wzajemnego hybrydyzowania ze sobą lub z trzecim kwasem nukleinowym w warunkach ścisłych. Warunki ścisłe zależą od sekwencji i są różne w różnych warunkach. Zasadniczo, warunki ścisłe dobrane są tak by temperatura hybrydyzacji była o około 5 C niższa niż temperatura topnienia helisy (T m ) o specyficznej sekwencji, przy określonej sile jonowej i ph. Wspomniana T m to temperatura (w określonej sile jonowej i ph), przy której 50% docelowej sekwencji hybrydyzuje z w pełni komplementarną sondą. Zazwyczaj warunki ścisłe to takie, w których stężenie soli wynosi około 0.02 M przy ph 7 i temperaturze co najmniej 60 C. W wynalazku genomowy DNA lub cdna obejmujące kwas nukleinowy ADC według wynalazku można zidentyfikować stosując standardową technikę hybrydyzacji Southerna w warunkach ścisłych z zastosowaniem ujawnionych w wynalazku sekwencji kwasów nukleinowych. Do celów wynalazku warunki ścisłe takiej hybrydyzacji obejmują co najmniej jedno płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze co najmniej około 50 C, zwykle około 55 C do około 60 C, przez co najmniej 20 minut, lub warunki równoważne. Inne sposoby identyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku zostały opisane w szczegółach w dalszej części opisu.
8 PL 197 043 B1 Wynalazek dostarcza genów ADC, takich jak AP2 i RAP2 Arabidopsis. Wynalazek dostarcza strategii molekularnych kontrolowania wielkości nasienia i całkowitej zawartości białka w nasieniu z zastosowaniem sposobu nadekspresji ADC i strategii antysensownych konstruktów. W szczególności dostarcza roślin transgenicznych obejmujących antysensowne konstrukty powodujące dramatyczne zwiększenie masy nasienia, zawartości białka lub oleju w nasieniu. Alternatywnie, nadekspresja ADC z zastosowaniem konstruktu według wynalazku prowadzi do zmniejszenia wielkości nasienia i całkowitej zawartości białka w nasieniu. Zaprezentowane dane wykazują, iż przy pomocy wynalazku można kontrolować wiele agronomicznie istotnych cech roślin, włączając w to masę nasienia, całkowita zawartość białka i zawartość oleju w gatunkach roślin o znaczeniu komercyjnym. Przedmiot wynalazku w korzystnym przykładzie wykonania przedstawiony został na rysunku, na którym fig. 1A przedstawia zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy prostymi powtórzeniami AP2-R1 sekwencji AP2 (aa 129-195) i AP2-R2 (aa 221-288), fig. 1B to schematyczny diagram przypuszczalnych alifatycznych alfa-helis AP2-R1 (R1) i AP2-R2 (R2), fig. 2 przedstawia antysensowny konstrukt według wynalazku, fig. 3 przedstawia sensowny konstrukt według wynalazku, fig. 4A i 4B przedstawiają sekwencję i strukturę domeny AP2, fig. 4C to schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.7-R1, AP2-R1 i ANT-R1, fig. 4D przedstawia schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.2, RAP2.5, RAP12 i EREBP-3, fig. 4E przedstawia zestawienie sekwencji pomiędzy regionami linkera (pozycje aminokwasowe 25-26) w AP2, ANT i RAP2.7, fig. 5 przedstawia schematyczny diagram pap2, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku, fig. 6 przedstawia schematyczny diagram pbel1, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku, a fig. 7 przedstawia to schematyczny diagram ekspresji genu. Na fig. 1A przedstawiającej zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy prostymi powtórzeniami AP2-R1 sekwencji AP2 (aa 129-195) i AP2-R2 (aa 221-288), linie proste i przerywane pomiędzy dwiema sekwencjami wskazują odpowiednio reszty identyczne i podobne. Strzałki wskazują pozycje mutacji ap2-1, ap2-5 i ap2-10 opisanych przez Jofuku i wsp (1994). Nawias powyżej AP2-R1 i AP2-R2 wskazuje reszty zdolne do tworzenia alifatycznej alfa-helisy przedstawionej figurą 1B. Figura 1B to schematyczny diagram przypuszczalnych alifatycznych alfa-helis AP2-R1 (R1) i AP2-R2 (R2). Koniec N helis R1 i R2 rozpoczyna się odpowiednio pozycjami Phe-160 i Phe-253, i ulega obrotowi w kierunki ruchu wskazówek zegara (100 ) na resztę aminokwasową Phe-177 i Cys-270. Strzałki skierowane w kierunku do lub od centrum osi helisy wskazują ujemne lub dodatnie wartości hydrofobowości definiowanej wg Jonesa i wsp J Lipid Res 33: 87-296 (1992). Figura 2 przedstawia antysensowny konstrukt według wynalazku. ppw14.4 (identyczny z ppw15) przedstawia 13.41 kpz antysensowny konstrukt genu AP2 stosowany do transformacji roślin opisanej w wynalazku. ppw14.4 obejmuje gen AP2 kodujący region w połączeniu transkrypcyjnym z promotorem konstytutywnym 35S z wirusa mozaikowatości kalafiora (P35S), przyłączony w orientacji antysensownej. Wektor plazmidowy Ti to zmodyfikowana wersja wektora pgsj780a (Plant Genetic Systems, Gent, Belgia), do którego wprowadzono pojedyncze miejsce EcoRI w miejsce BamHI z użyciem adaptera Clal-EcoRI-BamHI. Zmodyfikowany wektor pgsj780a zlinearyzowano enzymem EcoRI i wstawiono do niego sekwencję regionu kodującego AP2 w postaci fragmentu EcoRI o długości 1.68 kpz uzyskanego z plazmidu cap2#1 zawierającego cdna AP2 (Jofuku i wsp, 1994) w orientacji antysensownej w stosunku do promotora 35S. KmR to selekcyjny roślinny gen markerowy (NPTII) nadający oporność na kanamycynę stransformowanym komórkom niosącym zintegrowany gen antysensowny 35S-AP2. Prostokąty 1 i 5 oznaczają odpowiednio lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, niezbędne do transferu genu 35S-AP2 zawartego w T-DNA do genomu roślinnego. Regiony 2 i 3 obejmują sekwencje T-DNA. Prostokąt 3 oznacza fragment 3' genu kodującego syntazę oktopinową, uczestniczący w terminacji transkrypcji. Region 6 oznacza bakteryjną sekwencję DNA funkcjonującą jako bakteryjne miejsce startu replikacji zarówno w komórkach E.coli, jak Agrobacterium, co umożliwia namnażanie i utrzymanie plazmidu ppw14.4 w obu bakteriach. Prostokąt 7 przedstawia bakteryjny marker selekcyjny, nadający oporność na streptomycynę i spektynomycynę, co umożliwia selekcję komórek Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid ppw14.4. Figura 3 przedstawia sensowny konstrukt według wynalazku. ppw 12.4 (identyczny z ppw9) przedstawia 13.41 kpz sensowny konstrukt genu AP2 stosowany do transformacji roślin opisanej w wynalazku. ppw12.4 obejmuje gen AP2 kodujący region w połączeniu transkrypcyjnym z promotorem konstytutywnym 35S z wirusa mozaikowatości kalafiora (P35S), przyłączony w orientacji antysensownej. Wektor plazmidowy Ti to zmodyfikowana wersja wektora pgsj780a (Plant Genetic Systems,
PL 197 043 B1 9 Gent, Belgia), do którego wprowadzono pojedyncze miejsce EcoRI w miejsce BamHI z użyciem adaptora Clal-EcoRI-BamHI. Zmodyfikowany wektor pgsj780a zlinearyzowano enzymem EcoRI i wstawiono do niego sekwencję regionu kodującego AP2 w postaci fragmentu EcoRI o długości 1.68 kpz uzyskanego z plazmidu cap2#l zawierającego cdna AP2 (Jofuku i wsp, 1994) w orientacji sensownej w stosunku do promotora 35S. KmR to selekcyjny roślinny gen markerowy (NPTII) nadający oporność na kanamycynę stransformowanym komórkom niosącym zintegrowany gen antysensowny 35S-AP2. Prostokąty 1 i 5 oznaczają odpowiednio lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, niezbędne do transferu genu 35S-AP2 zawartego w T-DNA do genomu roślinnego. Regiony 2 i 3 obejmują sekwencje T-DNA. Prostokąt 3 oznacza fragment 3' genu kodującego syntazę oktopinową, uczestniczący w terminacji transkrypcji. Region 6 oznacza bakteryjną sekwencje DNA funkcjonującą jako bakteryjne miejsce startu replikacji zarówno w komórkach E.coli, jak Agrobacterium, co umożliwia namnażanie i utrzymanie plazmidu ppw12.4 w obu bakteriach. Prostokąt 7 przedstawia bakteryjny marker selekcyjny, nadający oporność na streptomycynę i spektynomycynę, co umożliwia selekcję komórek Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid ppw12.4. Figury 4A i 4B przedstawiają sekwencję i strukturę domeny AP2. Pozycja reszty aminokwasowej w obrębie domeny AP2 przedstawiona jest po prawej stronie. Wprowadzono luki w celu najlepszego dopasowania sekwencji. Pozycja reszt aminokwasowych i luk w obrębie sekwencji przedstawiona jest numerami 1-77. Umiejscowienie konserwowanych ewolucyjnie elementów YRG i RAYD wskazane jest nawiasami. Zacieniowane prostokąty pokazują regiony podobieństwa sekwencyjnego. Dodatnio naładowane reszty aminokwasowe w obrębie elementu YRG zaznaczone są + nad resztami aminokwasowymi. Umiejscowienie 18 aminokwasowego rdzenia przewidziane jest w oparciu o umiejscowienie amfipatycznej alfa-helisy w AP2 (nawias). Reszty w obrębie elementu RAY każdej domen AP2 przewidziane w oparciu o występowania amfipatycznej alfa-helisy zaznaczone są przez podkreślenie. Figura 4a przedstawia członków podklasy AP2-podobnej. Przedstawione jest również zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy powtórzeniami R1 i R2 domeny AP2 w obrębie Ap2, ANT i RAP2.7. Nawiasy powyżej sekwencji oznaczają konserwowane bloki YRG i RAYD opisane powyżej. Pełne kółko i gwiazdka wskazuje odpowiednio pozycje mutacji ap2-1 i ap2-5. Reszty aminokwasowe tworzące zgodnościowy motyw domeny AP2 dla AP2, ANT i RAP2.7 wskazane są poniżej zestawionych sekwencji, a niezmienne reszty zaznaczone są dużymi literami. Figura 4B przedstawia członków podklasy EREBP-podobnej. Zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy domenami AP2 obejmuje ERBP z tytoniu i EREBP-podobną sekwencję Arabidopsis (numer w bazie GeneBank: EREBP-1, EREBP-2, EREBP-3, EREBP-4 odpowiednio D38123, D38126, D38124 i D38125). Figura 4C to schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.7-R1, AP2-R1 i ANT-R1. Reszty aminokwasowe w obrębie motywów RAP2.7-R1, AP2-R1 i ANT-R1 przedstawione są przez podkreślenie w A, które najprawdopodobniej tworzą amfipatyczne alfahelisy są zaznaczone schematycznie z resztami obracającymi się w kierunku ruchu wskazówek zegara (100 na resztę aminokwasową). Strzałki skierowane w kierunku do lub od centrum osi helisy wskazują ujemne lub dodatnie wartości hydrofobowości definiowanej wg Jonesa i wsp J Lipid Res 33: 87-296 (1992). Dodatnio lub ujemnie naładowane reszty aminokwasowe oznaczone są odpowiednio symbolami + lub -. Figura 4D przedstawia schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.2, RAP2.5, RAP12 i EREBP-3. Reszty aminokwasowe w obrębie motywów RAP2.2, RAP2.5, RAP12 i EREBP-3 przedstawione są przez podkreślenie na figurze 4B, które najprawdopodobniej tworzą amfipatyczne alfa-helisy są zaznaczone i opisane jak na figurze 4C. Figura 4E przedstawia zestawienie sekwencji pomiędzy regionami Inkera (pozycje aminokwasowe 25-26) w AP2, ANT i RAP2.7. R1 i R2 oznaczają pozycje powtórzeń R1 i R2 w obrębie AP2, ANT i RAP2.7, w stosunku do sekwencji regionu linkera. Prostokąty oznaczają reszty niezmienne, w obrębie konserwowanych regionów linkera. Reszty aminokwasowe tworzące region zgodnościowy linkera AP2, ANT i RAP2.7 przedstawione są poniżej zestawienia sekwencji, a niezmienne reszty napisane są dużymi literami. Grot strzałki wskazuje pozycję mutacji ant-3 (Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996). Figura 5 przedstawia schematyczny diagram pap2, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku. Figura 6 przedstawia schematyczny diagram pbel1, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku. Figura 7 to schematyczny diagram ekspresji genu. Izolacja kwasów nukleinowych ADC
10 PL 197 043 B1 Ogólnie, nazewnictwo i stosowane procedury laboratoryjne z dziedziny inżynierii genetycznej przedstawione poniżej są dobrze znane specjalistom i są rutynowo stosowane. Standardowe techniki wykorzystywane są do klonowania, izolacji DNA i RNA, amplifikacji i oczyszczania. Ogólnie, reakcje enzymatyczne obejmują ligazę DNA, polimerazę DNA, endonukleazy restrykcyjne i podobne oraz są prowadzone zgodnie z zaleceniami producenta. Wspomniane techniki oraz wiele innych są zasadniczo wykonywane według Sambrooka i wsp, Molecular Cloning - A laboratory manual, CSHL, CSH, New York (1989). Izolacja kwasów nukleinowych może być dokonana na wiele sposobów. Na przykład można wykorzystać sondy oligonukleotydowe o sekwencji ujawnionej tu do identyfikowania poszukiwanego genu w bibliotece cdna lub bibliotece genomowego DNA. W celu utworzenia biblioteki genomowej duże segmenty DNA utworzone w wyniku przypadkowej fragmentacji np. z wykorzystaniem restryktaz i wprowadzone następnie do wektorowego DNA w formie konkatamerycznej można zapakować do użytecznego wektora. W celu przygotowania biblioteki cdna, należy wpierw wyizolować mrna z pożądanego organu, takiego jak kwiaty, i w oparciu o mrna zawierający transkrypt genu ADC tworzy się bibliotekę cdna. Alternatywnie cdna można przygotować z mrna wyizolowanego z innych tkanek, eksprymujących geny ADC lub geny homologiczne. Bibliotekę cdna lub genomową można przeszukiwać następnie z wykorzystaniem sondy opartej na sekwencji sklonowanego genu ADC według wynalazku. Sondy można zastosować do hybrydyzacji z genomowym DNA lub cdna w celu wyizolowania genów homologicznych w tym samym lub innym gatunku rośliny. Alternatywnie, do przeszukiwania biblioteki ekspresyjnej zastosować można przeciwciała skierowane przeciw białku ADC. Alternatywnie, pożądany kwas nukleinowy można amplifikować z próbek kwasów nukleinowych technikami powielania. Na przykład zastosować można technikę PCR do amplifikowania sekwencji genów ADC bezpośrednio z genomowego DNA, z cdna, z bibliotek genomowych lub cdna. PCR i inne techniki amplifikacji in vitro mogą być użyteczne na przykład do klonowania sekwencji kwasu nukleinowego kodującego mające ulegać ekspresji białko, do wytworzenia kwasu nukleinowego stosowanego jako sonda do wykrywania obecności użytecznego mrna w próbce, do sekwencjonowania kwasu nukleinowego i do podobnych celów. Użyteczne startery i sondy do identyfikowania sekwencji ADC z tkanek roślin utworzono w oparciu o sekwencje według Jofuku i wsp dz. cyt. Ogólny przegląd techniki PCR znajduje się np. w PCR Protocols: A guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D, Sninsky J, White T wyd. Academic Press, San Diego (1990). Jak wskazano powyżej, kwasy nukleinowe według wynalazku charakteryzują się obecnością sekwencji kodującej domenę AP2. Zatem kwasy nukleinowe można zidentyfikować w oparciu o ich zdolność do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami kodującymi domenę AP2 według wynalazku. Startery amplifikujące specyficznie domeny AP2 wskazanych genów są szczególnie użyteczne do identyfikowania poszczególnych polinukleotydów ADC. Startery (primery) użyteczne w tym celu, opracowane w oparciu o sekwencje genu RAP2 przedstawiono poniżej.
PL 197 043 B1 11 Startery do reakcji PCR stosowane były w standardowych warunkach PCR (opisanych np. przez Innisa i wsp dz. cyt.), z wykorzystaniem kwasów nukleinowych podanych powyżej (opisanych numerami GeneBank) jako matrycą. Utworzone produkty PCR można zastosować do identyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku (np. z biblioteki cdna), ze względu na ich zdolność do hybrydyzowania ze wspomnianymi produktami. Szczególnie korzystne warunki hybrydyzacyjne to: bufor hybrydyzacyjny składający się z 0,25 M buforu fosforanowego ph 7,2, 1 mm EDTA, 1% BSA, 7% SDS. Płukania po hybrydyzacji: pierwsze płukanie 2,0xSSC+ 0,1% SDS lub 0,39 M Na + i kolejne płukania z 0,2xSSC + 0,1% SDS lub 0,042 M Na+. Temperatury hybrydyzacji wynoszą od około 45 C do około 78 C, zazwyczaj od około 50 C do około 70 C. Płukania prowadzono w 18 C. Szczególnie korzystne warunki hybrydyzacji to: Temperatura hybrydyzacji ( C) Czas hybrydyzacji (godziny) Bufor płukania A ( C) Bufor płukania B ( C) 78 48 18 18 70 48 18 18 65 48 18 18 60 72 18 18 55 96 18 18 45 200 18 bez płukania
12 PL 197 043 B1 Jeżeli jest to pożądane można zastosować startery amplifikujące regiony bardziej specyficzne dla konkretnych genów ADC. Utworzone produkty PCR można zastosować w podanych warunkach hybrydyzacyjnych do identyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku. Polinukleotydy można również syntezować dobrze znanymi technikami opisanymi w literaturze. Patrz np. Carruthers i wsp CSH Symp Quant Biol 47: 411-418 (1982), Adams i wsp J Am Chem Sci 105: 661 (1983). Dwuniciowe fragmenty DNA można otrzymać albo przez syntezę komplemen-
PL 197 043 B1 13 tarnego łańcucha i łączenie obu nici w odpowiednich warunkach lub przez dodanie nici komplementarnej przez polimerazę DNA z odpowiednimi sekwencjami starterów. Alternatywnie, startery specyficznie hybrydyzujące z wysoce konserwatywnymi regionami domen AP2 można zastosować do amplifikacji sekwencji z szerokiego zakresu gatunków roślin takich jak Arabidopsis, kanola, soja, tytoń i wyżlin. Przykłady takich starterów obejmują: Starter RISZU 1: 5'-GGAYTGTGGGAAACAAGTTTA-3' Starter RISZU 2: 5'-TGCAAAGTRACACCTCTATACTT-3' Y = pirymidyna (T lub C) R = puryna (A lub G) Standardowa technika hybrydyzacji kwasów nukleinowych i zastosowanie warunków hybrydyzacji ujawnionych w wynalazku pozwala identyfikować cdna pełnej długości lub klony genomowe. Ponadto, następujące startery DNA, RISZU 3 i RISZU 4 można zastosować w odwróconej reakcji PCR aby specyficznie zamplifikować flankujące rejony genu AP2. Starter RISZU 3: 5'GCATGWGCAGTGTCAAATCCA-3' Starter RISZU 4: 5'-GAGGAAGTTCYAAGTATAGA-3' W = A lub T V = G, A lub C Wymienione startery można zastosować w standardowej reakcji PCR w celu amplifikacji sekwencji genu ADC z kanoli (Sek Id Nr 1) i soi (Sek Id Nr 2). Kontrola aktywności ADC lub ekspresji genu Specjaliści wiedzą, iż na wiele sposobów można modulować aktywność ADC lub ekspresje genu. Aktywność ADC można modulować w komórkach rośliny na poziomie genu, transkrypcji, na poziomie potranskrypcyjnym, translacji lub po translacji, co przedstawia schematycznie fig. 7. Techniki modulowania aktywności ADC na każdym z wymienionych poziomów są ogólnie dobrze znane specjalistom i zostaną przedyskutowane skrótowo poniżej. Sposoby wprowadzania mutacji genowych do genów roślinnych są dobrze znane. Na przykład nasiona lub inny materiał roślinny można traktować chemicznymi substancjami mutagennymi, zgodnie ze standardowymi procedurami. Takimi substancjami chemicznymi mogą być, w sposób nieograniczający: siarczek dietylowy, etylenoimina, etylometylosulfonian, N-nitrozo-N-etylomocznik. Alternatywnie, zastosować można promieniowanie radioaktywne ze źródeł takich jak na przykład promienie X lub promienie gamma. Pożądane mutacje powodujące np. zwiększoną masę nasion, zawartość oleju i inne cechy są następnie selekcjonowane. Alternatywnie zastosować można rekombinacje homologiczną, w celu indukowania docelowego niszczenia genu poprzez specyficzne deletowanie lub zmianę genu ADC in vivo (patrz ogólnie: Grewal, Klar Genetics 146: 1221-1238, 1997; Xu i wsp Genes Devel 10: 2411-2422, 1996. Rekombinacje homologiczną zademonstrowano u roślin (Puchta i wsp Experiertia 50: 277-284, 1994; Swoboda i wsp EMBO J 13: 484-489, 1994 i Offringa i wsp PNAS (USA) 90: 7346-7350, 1993. W celu zastosowania rekombinacji homologicznej do genów według wynalazku, przygotowano in vitro mutacje w wybranych częściach genu ADC (włączając w to sekwencje 3' i 5' końców oraz introny), takie jak te ujawnione w wynalazku, a następnie wprowadzono je do pożądanych roślin standardowymi technikami. Ponieważ wydajność rekombinacji homologicznej zależy od stosowanego wektora, zwykle stosowane są wektory dwucistronowe, takie jak opisane przez Mountforda i wsp PNAS (USA) 91: 4303-4307, 1994; i Vaulounta i wsp Transgenic Res 4: 247-255, 1995 w celu zwiększenia wydajności procesu. Zmutowany gen oddziaływuje z docelowym, dzikim genem w taki sposób że dochodzi do rekombinacji homologicznej i zastąpienia genu typu dzikiego w roślinach transgenicznych, co prowadzi do zahamowania aktywności ADC. Alternatywnie można zastosować oligonukleotydy zwartych reszt RNA lub DNA tworzące dupleks z podwójną strukturą szpilki do włosów na końcach. Sekwencja DNA/RNA zaprojektowana jest tak, by a przylegała do sekwencji docelowej w ADC i zawierała pożądane podstawienie nukleotydowe. Wprowadzenie chimerowego oligonukleotydu z pozachromosomalnym plazmidem T prowadzi do wydajnej i specyficznej konwersji genu ADC, kierowanej przez chimerowe cząsteczki w niewielkiej liczbie komórek roślinnych, metoda ta została opisana w Cole-Strauss et al Science 273: 1386-1389, 1996 i Yoon i wsp PNAS (USA) 93: 2071-2076, 1996. Ekspresje genu można inaktywować z zastosowaniem technik rekombinacji DNA poprzez transformowanie komórek roślinnych konstruktami obejmującymi transpozony lub sekwencje T-DNA. Mu-
14 PL 197 043 B1 tanty ADC przygotowane tymi metodami zostały zidentyfikowane zgodnie ze standardowymi technikami. Na przykład mutacje można wykryć techniką PCR lub przez badanie obecności lub nieobecności ADC mrna np. techniką Northerna. Mutanty można również selekcjonować poprzez badanie masy nasienia, zawartości oleju lub podobnych cech. Wyizolowane sekwencje kwasu nukleinowego przygotowane jak podano to powyżej można zastosować w wielu technikach służących do kontrolowania ekspresji endogennej ADC na różnych poziomach. Do kontroli transkrypcji, akumulacji mrna, translacji itp. można stosować podsekwencje sekwencji według wynalazku. Wiele metod można zastosować do hamowania ekspresji genu w roślinach. Na przykład zastosować można korzystnie strategię antysensu. W tym celu należy segment kwasu nukleinowego z pożądanego genu sklonować i przyłączyć w sposób umożliwiający działanie do promotora takiego by transkrybowany był antysensowny RNA. Konstruktem takim są następnie transformowane rośliny i wytwarzany jest antysensowny RNA. W komórkach roślinnych najprawdopodobniej supresja antysensowna działa na poziomie regulacji genu, włączając w to supresję translacji (patrz: Bourque Plant Sci (Limerick) 105: 125-149, 1995; Pantopoulos Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology vol. 48, Cohn WE, Moldave K wyd. Acad Press, str 181-238; Heiser i wsp Plant Sci (Shannon) 127: 61069, 1997), oraz przez zapobieganie gromadzeniu mrna kodującego pożądane białko. (patrz np: Baulcombe Plant Mol Biol 32: 79-88, 1996; Prins, Goldbach Arch Virol 141: 2259-2276, 1996; Metzlaff i wsp Cell 88: 845-854, 1997; Sheehy i wsp PNAS (USA) 85: 8805-8809, 1988; Hiatt i wsp USA Patent Nr 4,801,340). Segment kwasu nukleinowego przeznaczony do wprowadzenia ogólnie będzie zasadniczo identyczny do co najmniej części endogennego genu ADC lub genów, które mają być hamowane. Sekwencja ta jednakże nie musi być całkowicie identyczna, by zahamować ekspresję. Wektory według wynalazku można zaprojektować w taki sposób, iż efekt hamowania stosować się będzie do innych genów w obrębie rodziny genów wykazujących homologię lub zasadniczą homologię z genem docelowym. W przypadku supresji antysensownej wprowadzana sekwencja niekoniecznie musi być sekwencją pełnej długości w stosunku albo do pierwotnego transkryptu albo do dojrzałego mrna. Ogólnie, wyższa homologia sekwencji może kompensować jej krótkość. Ponadto, wprowadzana sekwencja nie musi zachowywać tego samego układu eksonów i intronów, a także może być wystarczająca homologia segmentów nie kodujących. Normalnie stosować można sekwencję o długości około 30 lub 40 nukleotydów, choć sekwencja o długości co najmniej około 100 nukleotydów jest korzystna, bardziej korzystna jest sekwencja o długości około 200 nukleotydów, a szczególnie korzystna jest sekwencja od około 500 do około 1700 nukleotydów. Wiele regionów genu może stanowić miejsce działania dla różnych supresorów ekspresji genu ADC. Obejmować one mogą regiony kodujące (np. regiony flankujące domeny PA2), introny, sekwencje złącz ekson/intron, 3' lub 5' UTR i podobne. W niektórych zastosowaniach konstrukt można zaprojektować tak, by wyeliminować możliwość przyłączania białek regulatorowych do sekwencji genu ADC niezbędnych do ekspresji komórkowo- lub tkankowo-specyficznej. Wspomniane sekwencje regulatorowe mogą być położone albo w regionie 3', albo 5' lub w obrębie sekwencji kodujących genu, i mogą być albo elementem regulacji pozytywnej albo negatywnej. Sekwencje te można zidentyfikować stosując standardowe techniki analizy delecyjnej, dobrze znane specjalistom. Po zidentyfikowaniu sekwencji do rośliny można wprowadzić antysensowny konstrukt kontrolujący transkrypcję genu AP2 w konkretnej tkance, na przykład w rozwijających się zalążkach i/lub nasionach. W celu uniemożliwienia ekspresji genu ADC można zastosować również oligonukleotydy tworzące potrójną helisę. Potrójna helisa DNA może hamować transkrypcję i replikację, tworzyć mutacje specyficzne względem miejsca, przecinać DNA i indukować rekombinacje homologiczną (patrz np. Havre, Glazer J Virol 67: 7324-7331, 1993; Scanlon i wsp FASEB J 9: 1288-1296, 1995; Giovannangli i wsp Biochemistry 35: 10539-10548, 1996; Chan, Glazer J Mol Med (Berlin) 75: 267-282, 1997. Oligonukleotydy tworzące potrójną helisę można skierować przeciw tym samym sekwencjom, co oligonukleotydy antysensowne. Katalityczne cząsteczki RNA lub rybozymy można również zastosować do hamowania ekspresji genów ADC. Jest możliwe zaprojektowanie rybozymów specyficznie parujących z dowolną sekwencją docelową RNA, i przecinających rdzeń fosfocukrowy w konkretnym miejscu, co prowadzi do funkcjonalnej inaktywacji docelowego RNA. Rybozym nie ulega zmianie ani zużyciu we wspomnianej reakcji i może uczestniczyć w przecinaniu kolejnych cząsteczek RNA, tak jak czyni to prawdziwy enzym.