PL/EP 1644481 T3 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1644481 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 02.07.2004 04738974.7 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 23.06.2010 Europejski Biuletyn Patentowy 2010/25 EP 1644481 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 1/04 (2006.01) C12N 1/38 (2006.01) A23C 19/032 (2006.01) A23C 19/068 (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: Zastosowanie związków włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych jako czynników krioochronnych (30) Pierwszeństwo: 02.07.2003 EP 20030077079 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 12.04.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/15 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.12.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 2010/12 (73) Uprawniony z patentu: Chr. Hansen A/S, Horsholm, DK (72) Twórca(y) wynalazku: Börge Windel KRINGELUM, Ballerup, DK Niels Martin SORENSEN,, Copenhagen, DK Peter SORENSEN,, Ishöj, DK (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP. Z O. O. SKR. POCZT. 168 00-950 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis Odnośnik do pokrewnych zgłoszeń [0001] To zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z europejskiego zgłoszenia patentowego numer EP 03077079.6 złożonego 2 lipca 2003 roku. Dziedzina wynalazku: [0002] Wynalazek dotyczy dziedziny zamrożonych i liofilizowanych kultur mikrobiologicznych i związków włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych jako czynniki krioochronne. Bardziej konkretnie wynalazek dotyczy kultur otrzymywanych przy zastosowaniu takich czynników, które oprócz aktywności krioochronnej nadają kulturze zwiększoną aktywność metaboliczną, gdy szczepi się nią pożywkę, która ma być fermentowana lub przetwarzana. Takie zamrożone lub liofilizowane kultury są przydatne w wytwarzaniu licznych produktów spożywczych i karmy. Tło wynalazku: [0003] Mikroorganizmy są włączone w wytwarzanie produktów żywnościowych i karmy, w tym, w większość produktów mleczarskich. Kultury bakteryjne, szczególnie kultury bakterii ogólnie sklasyfikowanych jako bakterie kwasu mlekowego, są niezbędne w wytwarzaniu wszystkich fermentowanych produktów mlecznych, sera i masła. Jednak kultury pewnych nie bakteryjnych mikroorganizmów, np. pewne drożdże i grzyby, są stosowane do obróbki produktów spożywczych i karmy. Kultury tych mikroorganizmów są często określane jako kultury starterowe i nadają konkretne właściwości różnym produktom mleczarskim przez pełnienie wielu funkcji. Kultury starterowe są szeroko stosowane w różnych przemysłach, takich jak przemysł mleczarski, jak również w przemyśle wytwarzania wina, w przemyśle wytwarzania soku, w przemyśle obróbki mięsa. [0004] Kultury mikroorganizmów znajdują również ważne zastosowania w bioochronie artykułów spożywczych (Andersen i wsp., 1997). [0005] Handlowe mleczarskie kultury starterowe są na ogół złożone z bakterii fermentujących laktozę i kwas cytrynowy. Bakterie kwasu mlekowego oznaczają grupę Gram dodatnich, nieruchliwych, mikroaerofilnych lub anaerobowych bakterii, które fermentują cukier z wytworzeniem kwasów, w tym kwasu mlekowego. Przemysłowo niektóre najbardziej przydatne bakterie kwasu mlekowego obejmują gatunki Lactococcus, gatunki Streptococcus, gatunki Enterococcus, gatunki Lactobacillus, gatunki Leuconostoc i gatunki Pediococcus. [0006] Powszechnie stosowane szczepy mleczarskich kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego są na ogół podzielone na organizmy mezofilne mające optymalne temperatury wzrostu przy około 30 C i organizmy termofilne mające optymalne temperatury wzrostu w zakresie od około 35 do około 45 o C. Przykłady organizmów należących do grupy mezofilnej obejmują Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis i Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Gatunki bakterii termofilnych kwasu mlekowego obejmują jako przykłady Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i Lactobacillus acidophilus. [0007] Mleczarskie kultury starterowe są również klasyfikowane zgodnie z ich specyficznym składem gatunkowym i korzystnym zastosowaniem przemysłowym. Czysta kultura starterowa obejmuje tylko pojedynczy gatunek, podczas gdy mieszana kultura obejmuje dwa lub więcej różnych gatunków. Kultury starterowe są często katalogowane zgodnie z temperaturą, przy której wykazują optymalny wzrost lub maksymalną aktywność enzymatyczną. Mezofilne kultury starterowe typowo mają temperaturę optymalną około 30 o C, podczas 1
gdy kultury termofilne mają temperaturę optymalną około 35-45 o C (Nielsen i Ullum, 1999). Przykłady handlowych mieszanych kultur mezofilnych obejmują: O-kulturę obejmującą Lactococcus lactis subsp. lactis i Lactococcus lactis subsp. cremoris, D-kulturę obejmującą Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis, L-kulturę obejmującą Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris i gatunek Leuconostoc, LD-kulturę obejmującą Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis i gatunek Leuconostoc. [0008] O-kultura jest stosowana do wytwarzania sera bez dziur (Cheddar, Cheshire, Feta), D-kultura jest stosowana do wytwarzania masła. L-kultura jest stosowana do wytwarzania sera z małymi dziurami (np. serka wiejskiego) i produktów ze zsiadłego mleka z niskim wytwarzaniem CO 2. LD-kultura jest stosowana do wytwarzania sera z normalnym rozmiarem dziur, produktów ze zsiadłego mleka (legumina) i kwaśnego masła. Z handlowego punktu widzenia LD-kultury są obecnie jedną z najbardziej stosowanych kultur mieszanych. [0009] Przykłady handlowych, termofilnych kultur mieszanych obejmują kulturę jogurtową obejmującą Streptococcus thermophilus i Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, i termofilną kulturę serową obejmującą Streptococcus thermophilus i Lactobacillus helveticus. [0010] Kultura jogurtowa jest stosowana do wytwarzania jogurtu i specjalnych serów włoskich, termofilna kultura serowa jest stosowana do wytwarzania sera Emmentaler i specjalnych serów włoskich. [0011] Ponadto, gatunki Propionibacterium są często stosowane jako mleczarskie kultury starterowe, konkretnie w wytwarzaniu sera. Również organizmy należące do rodzaju Brevibacterium i rodzaju Bifidobacterium są powszechnie stosowane jako spożywcze kultury starterowe. [0012] Inną grupą mikrobiologicznych kultur starterowych jest kultura grzybowa, w tym kultury drożdży i kultury grzybów filamentowych, które są stosowane do wytwarzania pewnych typów sera i napoju. Przykłady obejmują Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir i Saccharomyces cerevisiae. [0013] Kultury starterowe są również szeroko stosowane w przemyśle obróbki mięsa np. do wytwarzania różnych rodzajów kiełbas i salami. [0014] Handlowe kultury starterowe są powszechnie rozprowadzane jako kultury zamrożone. W niskiej temperaturze zamrożonych kultur większość aktywności metabolicznej w komórce spada i komórki mogą być utrzymywane w tym zawieszonym, ale żywotnym, stanie przez przedłużony okres. [0015] Stężone, zamrożone kultury są bardzo interesujące dla handlu, ponieważ takimi kulturami można zaszczepić bezpośrednio kontener produkcyjny. Przez zastosowanie stężonych, zamrożonych kultur końcowy użytkownik unika, w innym przypadku koniecznego czasochłonnego pośredniego etapu fermentacji, podczas którego kultura starterowa namnaża się i końcowy użytkownik znacząco zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Stężone kultury mogą być określane jako DVS kultury do bezpośredniego zaszczepiania direct vat set. [0016] Jako alternatywa dla stężonych, zamrożonych kultur, mogą być wytwarzane stężone liofilizowane kultury DVS. Te kultury mają dodatkową zaletę, że mogą być dostarczane bez oziębienia. 2
[0017] Na ogół możliwy szkodliwy wpływ zamrażania i rozmrażania na żywotność żywych komórek przypisano odwodnieniu komórki i tworzeniu kryształów lodu w cytozolu podczas zamrażania. [0018] Stwierdzono, że kilka czynników krioochronnych wpływa na stężenie cytozolu w kontrolowany i minimalnie szkodliwy sposób tak, że krystalizacja lodu w cytozolu jest wykluczona lub zminimalizowana w czasie zamrażania. [0019] Artykuł F.J. Chavarri i wsp. (Biotechnology letters, vol 10, 1, 11-16 (1988), Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains ) opisuje, że żywotność w czasie przechowywania zamrożonej kultury Streptococcus lactis może być poprawiona przez dodanie 5 % laktozy lub 5 % sacharozy. Laktoza lub sacharoza działają jako czynniki krioochronne. Wcześniejszą nazwą Lactococcus lactis subsp. lactis była Streptococcus lactis. [0020] Podobnie, w artykule R. Caroba i wsp. (Eur Food Res Technol (2000) 211, 433-437, Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subs. lactis CECT 5180 ) opisuje, że żywotność w czasie przechowywania zamrożonej czystej kultury Lactococcus lactis subs. lactis można poprawić przez dodanie różnych czynników krioochronnych, takich jak cukry (laktoza, sacharoza i trehaloza), kwas glutaminowy i żelatyna. [0021] Żywotność kultur liofilizowanych można również poprawić przez zastosowanie czynników krioochronnych. Na przykład, w EP259739 opisano pewną ilość różnych czynników krioochronnych do liofilizowanych kultur. [0022] W celu dostarczenia krioochrony stosowano różne czynniki, takie jak węglowodany, białka i pewne środki powierzchniowo czynne. [0023] Na ogół w celu otrzymania działania krioochronnego wymagane są stosunkowo duże ilości czynników krioochronnych. Podczas gdy w niektórych układach ten problem jest nieistotny, to dla przemysłu obróbki mięsa, gdzie nawet małe niepożądane odchylenie w smaku fermentowanego lub obrabianego produktu, które jest spowodowane czynnikiem krioochronnym może być szkodliwe, stanowi znaczący problem. Nie mamy informacji o dostępnych w handlu skoncentrowanych zamrożonych kulturach, które zawierają znaczące ilości czynników krioochronnych. [0024] Do poprawiania stabilności kultur w niskiej temperaturze stosowano czynniki inne niż węglowodany, białka i środki powierzchniowo czynne. [0025] W WO 00/39281 opisano zastosowanie IMP i związków włączonych w biosyntezę syntezy DNA do stabilizowania aktywności metabolicznej w ciekłych kulturach starterowych, a nie stabilności zamrożonych liofilizowanych kultur. [0026] W WO 00/19817 opisano kompozycję krioochronną, w której do krioochrony jest stosowana kombinacja związków a nie pojedynczy związek. Kombinacja obejmuje blokera kanału wapniowego, odżywczą macierz komórkową, wodę i adenozynę. Jednak zastosowanie aktywnych farmaceutycznie związków, takich jak blokery kanałów wapniowych, nie jest dopuszczalne do stosowania w przemyśle spożywczym. [0027] W JP 05 308956 opisano pożywkę hodowlaną dla kultury bakterii azotynowych, która zawiera wysokocząsteczkowy polisacharyd, w którym jednostka składa się z jednej cząsteczki alfa-l-ramnozy, 1 cząsteczki kwasu D-glukuronowego i 2 cząsteczek D-glukozy liniowo spolimeryzowanych i np. ATP. Bakterie azotanowe hodowane w tej pożywce można zamrażać i przechowywać. Nie ma wskazań, że składniki pożywki mogą działać jako czynnik krioochronny, gdy są dodane do skoncentrowanych kultur przed zamrożeniem. 3
[0028] Pozostaje potrzeba skutecznych czynników krioochronnych, które można dodać do skoncentrowanych kultur stosowanych w przemyśle spożywczym. Streszczenie wynalazku [0029] Uważano, że dla ważnych w handlu skoncentrowanych zamrożonych kultur bakterii kwasu mlekowego nie istnieją znaczące problemy ze stabilnością podczas przechowywania. Chociaż dobrze wiadomo, że większość żyjących bakterii doznaje szkody z powodu zamrażania, a następnie rozmrażania, to kwestia żywotności dla ważnych w handlu skoncentrowanych zamrożonych kultur bakterii kwasu mlekowego generalnie nie była uważana za znaczącą. Konsekwentnie, dostępne w handlu zamrożone kultury nie mają znaczących ilości czynników krioochronnych. Tak może być, ponieważ wydaje się, że niektóre handlowe kultury starterowe są bardzo odporne na szkodliwe działanie zamrażania i rozmrażania. [0030] Na przykład, przeprowadzono pewną ilość badań stabilności z dostępnymi w handlu skoncentrowanymi kulturami bakterii kwasu mlekowego, które były zamrożone przez 2-3 miesięcy. Zamrożone 2-3 miesięczne kultury nie wykazywały znaczącej degradacji aktywności kultury przez okres jednego roku w temperaturze poniżej -45 o C. Konsekwentnie, uważano, że ważne dla handlu kultury nie miały znaczących problemów ze stabilnością w trakcie przechowywania. [0031] Obecni twórcy zaobserwowali, na przykład, że zamrożone LD-kultury mają znaczącą utratę aktywności w pierwszych 1-3 tygodniach przechowywania w zamrożeniu (jak zilustrowano w przykładzie 1). Po pierwszych kilku tygodniach dalsza utrata aktywności była stosunkowo nieznaczna i zgodna z wcześniej znanymi wynikami opisanymi powyżej. [0032] Twórcy zidentyfikowali nierozpoznane problemy stabilizacyjne dotyczące zamrażania i początkowej fazy przechowywania dla niektórych typów ważnych dla handlu skoncentrowanych zamrożonych kultur bakterii kwasu mlekowego, np. dostępnych w handlu zamrożonych LD-kultur. Szczególnie, gdy kultury są przechowywane w temperaturze dostarczonej przez nowoczesne zamrażarki przemysłowe, typowo około -50 o C. [0033] Twórcy zidentyfikowali nową klasę czynników krioochronnych, które są nakierowane zarówno na problem stabilności jak i nadają kulturze zwiększoną aktywność metaboliczną. [0034] Jedno wykonanie wynalazku dotyczy skoncentrowanej zamrożonej liofilizowanej kultury, jak określona w zastrzeżeniu 1, w którym kultura obejmuje jeden lub więcej czynników kioochronnych wybranych z grupy składającej się z jednego lub więcej związku(ów) włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych lub jednej lub więcej pochodnych dowolnych takich związków, przy czym jeden lub więcej z czynników krioochronnych jest/są wybrane z grupy składającej się z zasad purynowych, zasad pirymidynowych, nukleozydów i nukleotydów. [0035] Czynnik krioochronny jest korzystnie dodany do żywotnych bakterii, przed zamrażaniem lub liofilizowaniem. [0036] Niniejszy wynalazek również dostarcza sposobu, jak określony w zastrzeżeniach 17 lub 18, do wytwarzania zamrożonej kultury lub kultury liofilizowanej, jak określona w zastrzeżeniu 1, obejmującego następujące etapy: dodawanie jednego lub więcej czynników krioochronnych, jak określone w zastrzeżeniu 1; zamrażanie materiału z ilością czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników według zastrzeżenia 1, aby uzyskać zamrożony materiał i pakowanie zamrożonego (lub liofilizowanego) materiału w odpowiedni sposób. W przypadku wytwarzania liofilizowanej kultury sposób obejmuje etap, gdzie sublimacja wody z zamrożonego materiału pojawia się przed etapem pakowania. 4
[0037] Według niniejszego wynalazku dostarcza się również sposobu wytwarzania produktu żywnościowego i karmy, który obejmuje zastosowanie kultury według wynalazku. Korzystnie, produkt żywnościowy jest wybrany z produktu opartego na mleku, produktu mięsnego, produktu warzywnego i napoju. [0038] Dalszą zaletą opisanej tu nowej klasy czynników krioochronnych jest to, że zachowują żywotność jak również aktywność metaboliczną komórek rekonstytuowanych i nie wpływają na smak fermentowanego lub przetwarzanego produktu w żaden niekorzystny sposób. Definicje [0039] Przed omówieniem szczegółowych wykonań wynalazku dostarczone są definicje specyficznych terminów dotyczących różnych aspektów i wykonań wynalazku. [0040] Jak tu stosowano termin bakteria kwasu mlekowego (LAB) oznacza gram-dodatnią, mikroaerofilną lub anaerobową bakterię, która fermentuje cukry z wytworzeniem kwasów, w tym, kwasu mlekowego ( jako głównie wytwarzanego kwasu), kwasu octowego i kwasu propionowego. Najbardziej przydatne przemysłowo bakterie kwasu mlekowego znajduje się wśród gatunków Lactococcus (spp.), Streptococcus spp., Lactobacillus spp. Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. i Propionibacterium spp. Ponadto bakterie należące do grupy ściśle anaerobowych bakterii, bifidobakterie tj. Bifidobacterium spp, które są często są stosowane jako spożywcze kultury starterowe same lub w kombinacji z bakteriami kwasu mlekowego, są na ogół włączone do grupy bakterii kwasu mlekowego. [0041] Termin skoncentrowana kultura dotyczy kompozycji, która ma zawartość żywotnych komórek (jednostek tworzących kolonie CFU), która wynosi co najmniej 10 8 CFU na ml, bardziej korzystnie co najmniej 10 9 CFU na ml, bardziej korzystnie co najmniej 10 10 CFU na ml, bardziej korzystnie co najmniej 10 11 CFU na ml, lub bardziej korzystnie co najmniej 10 12 CFU na ml. Jak widać w przykładach skoncentrowana kultura może być otrzymana, na przykład, przez wirowanie. [0042] Termin pakowanie powinien być rozumiany szeroko. Oznacza on, że zamrożona lub liofilizowana kultura jest zapakowana w taki sposób, że może być dostarczona użytkownikowi. Może być zapakowana w butlę Tetrapack (czteropak), torbię, etc. [0043] Termin czynnik krioochronny oznacza substancję,która jest zdolna do poprawy odporności na działania szkodliwe wywołane przez zamrażanie i początkową fazę przechowywania zamrożonej lub liofilizowanej kultury. W niniejszym kontekście może to być pojedynczy konkretny czynnik krioochronny lub mogą to być dwa lub więcej czynniki. Odpowiednio, procent wag./wag. czynnika (ów) krioochronnego (ych) w materiale kultury powinien być rozumiany jako suma ilości czynnika(ów) krioochronnego(ych). Korzystnym sposobem określenia czy substancja jest czynnikiem krioochronnym, który jest zdolny do poprawy odporności zamrożonej kultury na działania szkodliwe wywołane przez zamrażanie i początkową fazę przechowywania, jest rozdzielenie kultury, jak tu opisano, na dwie próbki, dodanie określonej ilości czynnika krioochronnego do jednej z nich, zamrożenie obu i zmierzenie aktywności zakwaszającej kultur w odpowiednich pożywkach (np. w mleku) tego samego dnia co zamrażanie lub okresowo (np. aż do jednego roku), gdy przechowywane są w zamrożeniu. Jeżeli kultura z czynnikiem krioochronnym poprawiła aktywność zaobserwowaną przez okres przechowywania (taką jak poprawiona aktywność zakwaszania mleka), substancja jest czynnikiem krioochronnym. Odpowiednie oznaczenie aktywności zakwaszającej mleko jest tu podane w przykładach roboczych. [0044] Poniżej są opisane wykonania niniejszego wynalazku, tylko tytułem przykładów. Szczegółowe ujawnienie wynalazku: 5
[0045] Jak omówiono poprzednio skoncentrowane zamrożone lub liofilizowane kultury są uważane za stabilne. Jednak w przeciwieństwie do dotychczasowego powszechnego przekonania w dziedzinie, twórcy nieoczekiwanie zaobserwowali nierozpoznane dotychczas problemy ze stabilnością dotyczące zamrażania i początkowej fazy przechowywania dla niektórych typów ważnych dla handlu skoncentrowanych zamrożonych kultur bakterii kwasu mlekowego, takich jak, na przykład, powszechnie dostępne zamrożone LDkultury, patrz Przykład 1 poniżej. Uważa się, że takie problemy ze stabilnością będą powszechnie stwierdzane, gdy będzie się badać odpowiednio handlowe zamrożone lub liofilizowane kultury. [0046] W celu przezwyciężenia tego problemu przetestowano szereg możliwych czynników, aby zobaczyć, czy mogą one przezwyciężyć problem. Wśród testowanych czynników były czynnik (ki) wybrane z grupy składającej się z jednego lub więcej związków włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych, które poprzednio były przedstawione przez twórców w celu poprawy stabilności niezamrożonych ciekłych kultur starterowych. [0047] W WO 00/39281 opisano zastosowanie IMP i związków włączonych w biosyntezę syntezy DNA do stabilizowania aktywności metabolicznej ciekłych kultur starterowych, ale przeciwnie do kultur, które pozostają ciekłe w trakcie chłodzenia, kultury, które zamrażają się, są poddane wielu potencjalnym uszkodzeniom, które dotyczą bezpośrednio procesu zamrażania. [0048] W temperaturze zamrażania mikroorganizmy ulegają śmierci i uszkodzeniu, ponieważ kultura zaczyna się zamrażać i tworzy się lód zarówno zewnątrz jak i wewnątrzkomórkowo. Tworzenie się lodu mechanicznie uszkadza komórki, a ponadto wytwarza wysokie wewnątrzkomórkowe ciśnienie osmotyczne, które odwadnia komórki. Zmiany w sile jonowej i ph fazy wodnej jako wynik zamrażania będą również przerywały struktury i funkcję licznych składników komórkowych i makrocząsteczek, których stabilność zależy od tych czynników (Adams, 2000). [0049] Różnica między kwestią stabilności kultur ciekłych versus kultur zamrożonych może być dalej zilustrowana eksperymentem, o którym donosi Mazur (1961). W tym doświadczeniu komórki drożdży zanurzono w łaźni w -15 o C. Wynik był taki, że gdy układ pozostawał ciekły przeżywało 97% komórek, ale tylko 27% komórek przeżyło, gdy to zewnętrzne podłoże zamarzło przy -15 o C (Mazur 1961). [0050] Zatem dawki, które muszą być dostarczane przez skuteczny czynnik krioochronny bardzo różnią się w zależności od tego, czy czynnik krioochronny jest zaprojektowany, aby chronić ciekłą czy zamrożoną kulturę i konsekwentnie, dodatki, które są skutecznymi czynnikami krioochronnymi dla kultur ciekłych, mogą nie być skuteczne dla kultur zamrożonych. Jednym z takich dodatków jest mrówczan Na. Jak doniesiono w WO 00/39281 3 % mrówczan Na jest skuteczny w zwiększeniu stabilności podczas przechowywania koncentratów ciekłych kultur starterowych bakterii kwasu mlekowego. Jednak, jak zilustrowano w przykładzie 15 poniżej, 3 % mrówczan Na zmniejsza stabilność podczas przechowywania zamrożonej kultury starterowej bakterii kwasu mlekowego. [0051] Zatem, było całkowicie nieoczekiwane, gdy doświadczenia wykazały, że IMP i pewien związek (ki) włączony w biosyntezę kwasów nukleinowych poprawiły stabilność zarówno zamrożonych, jak i liofilizowanych skoncentrowanych kultur. [0052] Jak jest to pokazane w przykładzie 2 poniżej, dodatek jednego z takich związków inozyno-5- monofosforanu (IMP) znacząco poprawia odporność na działania uszkadzające wywołane zamrażaniem i początkową fazą przechowywania. Dodatek IMP również znacząco poprawia stabilność kultury liofilizowanej, jak zilustrowano w przykładzie 9 poniżej. Z przykładu 10 poniżej jest oczywiste, że nie tylko IMP ale szeroki 6
zakres czynników wybranych z grupy składającej się ze związku(ów) włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych jest skutecznych, jako czynniki krioochronne. [0053] Jak zilustrowano w przykładzie 10, jako czynniki krioochronne mogą być stosowane zarówno nukleotydy i nukleozydy. Zatem, zgodnie z wynalazkiem związkiem krioochronnym, który jest przydatny do poprawy odporności na działania uszkadzające wywołane zamrażaniem i początkową fazą przechowywania kultury starterowej, jest związek wybrany z grupy składającej się z zasad purynowych, zasad pirymidynowych, nukleozydów i nukleotydów. Przykładem takich związków jest inozyno-5 -monofosforan (IMP), adenozyno-5 -monofosforan (AMP), guanozyno-5 -monofosforan (GMP), uranozyno-5 -monofosforan (UMP), cytydyno-5 -monofosforan (CMP), adenina, guanina, uracyl, cytozyna, guanozyna, urydyna, cytydyna, hipoksantyna, ksantyna, hipoksantyna, orotydyna, tymidyna, inozyna i pochodne jakiegokolwiek z tych związków lub ich mieszaniny. [0054] Jak opisano wcześniej w WO 00/19817 dostarczono kombinacji blokera kanału wapniowego, odżywczej macierzy komórkowej, wody i adenozyny jako kompozycji krioochronnej, jednak możliwa aktywność krioochronna pojedynczych składników, takich jak np. adenozyna, nie była omawiana. Jednak adenozyna może nie być skuteczna jako czynnik krioochronny, jak zilustrowano w przykładzie 12 i 15, w których wydaje się, że adenozyna zmniejsza stabilność kultury bakteryjnej. Ponadto Demetriou (WO 00/19817) zastosował ilości 2,7 do 3,6 mm adenozyny. Dodatkowo, nasze eksperymenty wykazują, że inozyna jest bardzo skuteczna jako czynnik krioochronny, a zarówno adenozyna jak i inozyna są czystymi nukleotydami. Tę obserwację można rozszerzyć na monofosforany. Nasze eksperymenty pokazują, że jako czynnik krioochronny jest skuteczny IMP, ale nie AMP. Jest to nawet bardziej zaskakujące, ponieważ w organizmie kwas inozynowy (IMP) jest syntetyzowany z kwasu adenylowego (AMP) przez hydrolityczną dezaminację (White, 1973). Zatem w korzystnym wykonaniu wynalazku jeden lub więcej czynników krioochronnych jest wybranych z grupy nukleotydów pirymidynowych i inozyny. [0055] W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku jeden lub więcej czynników krioochronnych jest wybranych z grupy monofosforanów nukleozydów. W korzystnym wykonaniu co najmniej jednym lub jedynym czynnikiem krioochronnym jest IMP. [0056] Węglowodany lub czynniki krioochronne typu białkopodobnego na ogół nie są opisane, że zwiększają metaboliczną aktywność rozmrażanych lub rekonstytuowanych kultur. Czynniki krioochronne według wynalazku, jak określone powyżej, mogą oprócz ich aktywności krioochronnej również nadawać kulturze zwiększoną aktywność metaboliczną (efekt wzbudzenia), gdy szczepi się nią pożywkę, która ma być fermentowana, obrabiana lub przetwarzana. [0057] Zatem, jednym wykonaniem wynalazku jest zamrożona lub liofilizowana kultura, jak określona w zastrzeżeniu 1, w której czynnikiem krioochronnym jest czynnik lub mieszanina czynników, które w dodatku do swoich właściwości krioochronnych mają działanie pobudzające. [0058] Wyrażenie działanie pobudzające jest stosowane do opisania sytuacji, w której czynnik krioochronny nadaje zwiększoną aktywność metaboliczną (działanie pobudzające) rozmrożonej lub rekonstytuowanej kulturze, gdy zakaża się nią pożywkę, która ma być fermentowana lub przetwarzana. Żywotność i aktywność metaboliczna nie są pojęciami synonimowymi. Zamrożone lub liofilizowane kultury handlowe mogą utrzymywać swoją żywotność, chociaż mogą stracić znaczną część swojej metabolicznej aktywności np. kultury mogą stracić swoją aktywność wytwarzania kwasu (zakwaszanie), gdy są przechowywane nawet przez krótszy czas. Zatem żywotność i działanie pobudzające muszą być oceniane w różnych próbach. Podczas gdy 7
żywotność ocenia się w próbach żywotności, takich jak określanie jednostek tworzących kolonie, działanie pobudzające ocenia się przez ilościowe określenie związanej z tym aktywności metabolicznej rozmrożonej lub rekonstytuowanej kultury w stosunku do żywotności kultury. Próba aktywności zakwaszania, opisana poniżej, jest jednym z przykładów próby określania ilościowego związanej z tym aktywności metabolicznej rozmrożonej lub rekonstytuowanej kultury. Działanie pobudzające jest dalej zilustrowane w Przykładzie 3. [0059] Chociaż aktywność wytwarzania kwasu jest tu zilustrowana, wynalazek ma obejmować stabilizację dowolnego typu aktywności metabolicznej kultury. Zatem termin aktywność metaboliczna dotyczy aktywności kultury w usuwaniu tlenu, jej aktywności wytwarzania kwasu tj. wytwarzania kwasu mlekowego, kwasu octowego, kwasu mrówkowego i/lub kwasu propionowego, lub jej aktywności wytwarzania metabolitów, takiej jak wytwarzanie związków aromatycznych, takich jak acetaldehyd ( α-acetomleczan, acetonina, diacetyl i glikol 2,3-butylenowy (butanodiol) [0060] Według wynalazku zamrożona kultura zawiera lub obejmuje od około 0,1% do około 20% czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników mierzonych jako % wag./wag. zamrożonego materiału. Korzystnie jednak dodaje się czynnik krioochronny lub mieszaninę czynników krioochronnych w ilości, która jest w zakresie od 0,2% do 15%, bardziej korzystnie w zakresie 0,2% do 10%, bardziej korzystnie w zakresie 0,5% do 7%, a bardziej korzystnie w zakresie 1% do 6% wagowych, w tym w zakresie 2% do 5% czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników krioochronnych mierzonej jako % wag./wag. zamrożonego materiału. W korzystnym wykonaniu kultura zawiera około 3% czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników krioochronnych mierzonej jako % wag./wag. zamrożonego materiału. Korzystna ilość około 3% czynnika kriochronnego lub mieszaniny czynników krioochronnych odpowiada stężeniom w zakresie 100 mm. Należy uznać, że dla każdego aspektu wykonania wynalazku zakresy mogą wzrastać w opisanych zakresach. [0061] Termin materiał kultury oznacza odpowiednie substancje kultury, w tym, zarówno żywotne bakterie jaki i czynnik krioochronny. Możliwe opakowanie nie jest objęte. Konsekwentnie, ciężar materiału kultury nie zawiera ciężaru możliwego opakowania. [0062] W przypadku, gdy kultura jest kulturą liofilizowaną czynnik krioochronny lub mieszanina czynników krioochronnych jest obecna w ilości 0,8% do 55% wagowych lub w zakresie 1,3% do 40% wagowych lub w zakresie 3% do 30 % wagowych, lub w zakresie 6% do 25% wagowych, w tym, w zakresie 10% do 24% wagowych. W korzystnym wykonaniu kultura liofilizowana zawiera około 16% czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników krioochronnych mierzonych jako % wag./wag. liofilizowanego materiału. [0063] Ponadto, zamrożona lub liofilizowana kultura może zawierać dalsze typowe dodatki, w tym, substancje odżywcze, takie jak wyciągi drożdżowe, cukry, przeciwutleniacze, gazy obojętne i witaminy etc. Jako dalsze dodatki do kultury według wynalazku mogą być również stosowane surfaktanty, w tym związki Tween. [0064] Dalsze przykłady takich konwencjonalnych dodatków, które dodatkowo mogą być dodane do kultury według wynalazku, mogą być wybrane z białek, hydrolizatów białkowych i aminokwasów. Korzystne odpowiednie ich przykłady obejmują pewne wybrane z grupy składającej się z kwasu glutaminowego, lizyny, glutaminianu Na, kazeinianu Na, wyciągu słodowego, odtłuszczonego mleka w proszku, serwatki w proszku, wyciągu drożdżowego, glutenu, kolagenu, żelatyny, elastyny, keratyny i albumin lub ich mieszanin. [0065] Bardziej korzystnie, konwencjonalnym dodatkiem jest węglowodan. Odpowiednie ich przykłady obejmują wybrane z grupy składającej się z pentoz (np. rybozy, ksylozy), heksoz (np. fruktozy, mannozy, sorbozy), disacharydów (np. sacharozy, trechalozy, melibiozy, laktulozy), oligosacharydów (np. rafinozy), oligo- 8
fruktoz (np. Actilight, Fribroloses), polisacharydów (np. maltodekstryn, gumy ksantanowej, pektyny, alginianu, celulozy mikrokrystalicznej, dekstranu, PEG) i alkoholi cukrowych (sorbitolu, mannitolu i inozytolu). [0066] Niniejszy wynalazek dotyczy dowolnych skoncentrowanych zamrożonych lub liofilizowanych kultur, jak określone w zastrzeżeniu 1 i w szczególności jest skierowany na kultury mikroorganizmów, które są włączone w wytwarzanie produktów żywnościowych i karmy, w tym, produktów mleczarskich. Wykonania wynalazku obejmują kultury bakteryjne, jak określone w zastrzeżeniu 1, w szczególności kultury bakterii, które są ogólnie sklasyfikowane jako bakterie kwasu mlekowego i które są istotne dla wytwarzania wszystkich fermentowanych produktów mlecznych, sera i masła. Kultury takich bakterii są często określane tu jako kultury starterowe i nadają konkretne właściwości różnym produktom mleczarskim przez pełnienie wielu funkcji. Jednak również kultury, które obejmują kultury grzybowe, które nie tworzą części niniejszego wynalazku, w tym, kultury drożdży i kultury grzybów filamentowych, które są szczególnie stosowane do wytwarzania pewnych typów sera i napoju, są określane w stanie techniki jako kultury starterowe. Również kultury, które są stosowane w obróbce innych typów produktów żywnościowych i karmy są określane tu jako kultury starterowe. Kultury stosowane w wytwarzaniu kiszonki są również często określane jako kultury starterowe. [0067] Według wynalazku może być stosowany dowolny organizm z kultury starterowej, jak określony w zastrzeżeniu 1, który jest stosowany w przemyśle żywnościowym lub przemyśle paszowym, w tym, w przemyśle mleczarskim Zatem, kultura starterowa może obejmować jeden lub więcej organizmów wybranych z grupy składającej się z Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp. Streptococcus spp., Lactobacillus spp., w tym, Lactobacillus acidophylus, Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., Oenococcus spp., Lactococcus spp. i obejmują szeroko stosowany Lactococcus lactis, w tym, Lactococcus lactis subsp. lactis i lactococcus lactis subsp. cremoris, które są powszechnie stosowane do wytwarzania serów z zamknięta teksturą np. Cheddar, Feta i serek wiejski. [0068] Należy rozumieć, że organizm z kultury starterowej może być wybrany z genetycznie modyfikowanego szczepu z jednego lub więcej powyższych szczepów bakteryjnych kwasu mlekowego lub innych szczepów kultur starterowych, jak określone w zastrzeżeniu 1. Jak tu stosowano, wyrażenie genetycznie modyfikowana bakteria jest stosowane w konwencjonalnym znaczeniu tego terminu tj. dotyczy ono szczepów otrzymywanych przez poddanie szczepu bakteryjnego dowolnemu konwencjonalnie stosowanemu traktowaniu mutagenizacyjnemu, w tym, traktowanie mutagenem chemicznym, takim jak etanometanosulfonian (EMS) lub N-metylo-N -nitro-n-nitroguanidyna (NTG), światłem UV lub mutantami występującymi spontanicznie, w tym klasyczną mutagenezą. Ponadto jest możliwe dostarczenie genetycznie zmodyfikowanej bakterii przez mutagenezę losową z późniejszym wyborem spontanicznie występujących mutantów tj. bez zastosowania technologii rekombinacji DNA. Dalej bierze się pod uwagę, że mutanty bakterii kwasu mlekowego i inne potencjalnie użyteczne organizmy kultur starterowych mogą być dostarczone przez taką technologię, w tym, techniki mutagenezy ukierunkowanej i PCR i inne modyfikacje in vitro i in vivo konkretnych sekwencji DNA, gdy takie sekwencje zostały zidentyfikowane i wyizolowane. Zatem dalej rozważa się, że przydatne organizmy kultur starterowych można otrzymać przez stosowanie technologii rekombinacji DNA. W szczególności możliwe jest otrzymanie przydatnych organizmów kultur starterowych przez rekombinację sekwencji DNA, które były naturalne dla konkretnego organizmu tj. samoklonowanie jest atrakcyjne z punktu widzenia przepisów żywnościowych. 9
[0069] Jak zwykle w przemyśle mleczarskim kultura starterowa może zawierać mieszaninę szczepów, w tym mieszaninę szczepów różnych gatunków bakteryjnych kwasu mlekowego, takich jak np. mieszanina Streptococcus themophilus i Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. [0070] Powszechnie stosowane szczepy kultur starterowych dzielą się ogólnie na organizmy mezofilne, które w obecnym kontekście są organizmami mającymi optymalne temperatury wzrostu w zakresie około 30 C i organizmy termofilne, które w obecnym kontekście są organizmami mającymi optymalne temperatury wzrostu w zakresie około 40 do około 45 o C. [0071] Wybór szczepów dla kultury starterowej według wynalazku będzie zależeć od konkretnego typu wytwarzanego fermentowanego produktu żywnościowego i karmy. Na przykład, do wytwarzanie sera i masła powszechnie stosowane są mezofilne kultury gatunków Lactococcus, gatunków Leuconostoc i gatunków Lactobacillus. Zatem, w jednym wykonaniu kultura według wynalazku zawiera jeden lub więcej organizmów mezofilnych mających temperatury optymalnego wzrostu około 30 o C. Typowe organizmy należące do tych organizmów mezofilnych obejmują Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pedococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subs. lactis biovar diacetylactis. Lactobacillus casei i Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. [0072] W jeszcze innym wykonaniu wynalazku kultura według wynalazku zawiera jeden lub więcej organizmów termofilnych mających temperatury optymalnego wzrostu około 40 o C do około 45 o C. Organizmy termofilne są często stosowane do wytwarzania jogurtu i innych produktów z fermentowanego mleka, ale również pewne sery są wytwarzane przez zastosowanie kultur termofilnych np. ser emmentaler i specjalne sery włoskie. Typowe organizmy należące do takich organizmów termofilnych obejmują organizmy wybrane z grupy obejmującej Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i Lactobacillus acidophilus. [0073] W szczególności kultury bakterii kwasu mlekowego (kultury LAB) znalazły szerokie zastosowanie handlowe. Zatem, korzystnym wykonaniem wynalazku jest kultura LAB, która obejmuje jeden lub więcej organizmów wybranych z grupy składającej się z Lactococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp. i Bifidobacterium spp. [0074] Handlowe kultury starterowe są często skatalogowane zgodnie z ich zastosowaniami. O-kultura jest stosowana do wytwarzania sera bez dziur (Cheddar, Cheshire, Feta) i typowo zawiera jeden lub więcej organizmów wybranych z grupy obejmującej Lactococcus lactis subsp. lactis i Lactococcus lactis subsp. cremoris. D-kultura jest stosowana do wytwarzania masła i typowo zawiera jeden lub więcej gatunków Lactococcus tj. Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris i Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis. L-kultura może dogodnie być stosowana do wytwarzania sera tylko z małymi dziurami (serek wiejski) i produktów ze zsiadłego mleka z niską produkcją CO 2. Typowymi organizmami w L- kulturze są Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris i Leuconostoc spp. A na koniec LD-kultura jest stosowana do wytwarzania sera o normalnych rozmiarach dziur, produktów ze zsiadłego mleka (legumina) i kwaśnego masła. Handlowo LD-kultura jest obecnie jedną z najczęściej stosowanych mieszanych kultur. LD-kultura typowo zawiera jeden lub więcej organizmów wybranych z grupy obejmującej Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis i Leuconostoc spp. [0075] Jak w przypadku innych typów mieszanych kultur starterowych konkretna ilość poszczególnego gatunku bakterii w LD-kulturze może zmieniać się zgodnie z konkretnym, wymaganym zastosowaniem. Specja- 10
lista jest tego świadomy i zdolny do określenia składu korzystnej kultury mieszanej zgodnie z wymaganymi potrzebami. [0076] Na przykład, jeżeli wymagany jest zapach, optymalnym składem bakterii wytwarzających zapach korzystnie jest Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis i Leuconostoc spp. [0077] Korzystna LD-kultura zawiera Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis 60 95 %, korzystnie 70 90 % subsp. cremoris Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, 5 40 %, korzystnie 0,1 do 30 % Leuconostoc spp [0078] W zakresach powyżej, korzystna jest zawartość od 0,25 do 6 % Leuconostoc spp. i od 7 do 30 % Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis. [0079] Oczywiście całkowity procent sumy czterech różnych gatunków LAB nie może przekroczyć 100 %. Jednak może być mniejszy niż 100 %, jeśli w LD-kulturze są obecne inne bakterie niż 4 wspomniane. Przykład 2 dostarcza tu przykładu stabilizowanej LD-kultury. [0080] Konkretnym korzystnym wykonaniem niniejszego wynalazku jest kultura zawierająca Lactobacillus acidophilus. [0081] W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania zamrożonej kultury obejmującego następujące etapy: 1) dodawanie czynnika krioochronnego, jak określony w zastrzeżeniu 1 do skoncentrowanej kultury żywotnych organizmów, jak określone w zastrzeżeniu 1, 2) zamrożenie materiału jak określony w zastrzeżeniu 17, w celu uzyskania zamrożonego materiału i 3) pakowanie zmrożonego materiału w odpowiedni sposób. [0082] Należy rozumieć, że etapy zamrażania i pakowania można przeprowadzić wieloma sposobami. [0083] Etap zamrażania powinien być zoptymalizowany, aby zapewnić przeżycie komórek. Pewne komórki (np. większość LAB) mogą być zamrożone bezpośrednio, to jest, doprowadzone do bezpośredniego kontaktu z czynnikiem już w temperaturze krioochronnej. Bezpośrednie sposoby obejmują zanurzanie, spryskiwanie, wstrzykiwanie, wlewanie komórek bezpośrednio do płynu o temperaturze kriogenicznej, takiego jak ciekły azot, ciekły CO 2 lub ciekły hel. W niniejszym kontekście temperatury kriogeniczne dotyczą temperatur poniżej -50 o C, korzystnie, temperatur poniżej -150 o C (123 o K). Komórki można kontaktować bezpośrednio z ochłodzonym ciałem stałym, takim jak ciekły azot, blok stalowy zamrożony ciekłym azotem. Kriogeniczny płyn można również wylewać bezpośrednio na pojemnik z komórkami. Bezpośredni sposób obejmuje również kontaktowanie komórek z gazami, w tym, z powietrzem w temperaturze kriogenicznej. Kriogeniczny strumień gazu - azotu lub helu można wydmuchnąć bezpośrednio nad lub w postaci bąbelków do zawiesiny komórkowej. Pośredni sposób obejmuje umieszczanie komórek w pojemniku i kontaktowanie pojemnika z ciałem stałym, cieczą lub gazem w temperaturze kriogenicznej. Pojemnik do pośredniego sposobu zamrażania nie musi być nieprzepuszczalny dla powietrza lub cieczy. Na przykład, odpowiednie są torba plastikowa lub Tetra-Pak. [0084] W jednym korzystnym wykonaniu kulturę zatęża się np. przez wirowanie lub ultrawirowanie, dodaje się do kultury czynnik (i) krioochronny (e), i następnie kulturę wkrapla się po kropelce do ciekłego N 2 tworząc zamrożoną granulkę kultury. Zamrożona granulka kultury jest następnie zbierana i pakowana w celu dostarczenia użytkownikowi. Zamrożona granulka kultury może być zapakowana do butli, tetra-pack, torby lub 11
dowolnego pojemnika, który jest odpowiedni dla tego celu. Zamrożoną i zapakowaną granulkę kultury typowo trzyma się i rozprowadza w temperaturach, które zapewniają, że pozostanie zamrożona aż do stosowania do inokulacji pożywki, która ma być fermentowana lub obrabiana. [0085] W jeszcze dalszym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania liofilizowanej kultury według zastrzeżenia 1, obejmującego następujące etapy: 1) dodawanie czynnika krioochronnego wybranego z czynnika określonego w zastrzeżeniu 1 do skoncentrowanej kultury żywotnych organizmów,jak określone w zastrzeżeniu 1, 2) zamrożenie materiału do uzyskania zamrożonego materiału, 3) sublimacja wody z zamrożonego materiału, jak określono w zastrzeżeniu 18 i 4) zapakowanie liofilizowanego materiału w odpowiedni sposób. Dodanie czynnika(ów) krioochronnego(ych), ewentualny etap zatężania, zamrażanie (lub liofilizacja) i etapy pakowania można przeprowadzić, jak opisano. [0086] Podczas gdy zamrożone kultury potrzebują dostarczenia i przechowywania w niskich temperaturach, suszone w stanie zamrożenia lub liofilizowane kultury można dostarczać i przechowywać bez oziębiania przez długi czas, pod warunkiem, że są trzymane w suchych warunkach. Jednak nawet w przypadku kultur suszonych w stanie zamrożenia zalecane jest przechowywanie w temperaturze poniżej 0 o C. [0087] Typowo, zarówno kultury zamrożone jak i liofilizowane według wynalazku są dostarczone jako handlowe kultury starterowe DVS lub Redi-Set. Jedną zaletą kultur starterowych DVS jest to, że mogą być dodane w postaci zamrożonych lub liofilizowanych komórek bezpośrednio do fermentora lub pojemnika zawierającego pożywkę. To daje prawie natychmiastową regenerację żywotnych komórek. Wiele z handlowo rozprowadzanych kultur starterowych jest kulturami bakterii kwasu mlekowego, zatem, korzystnym wykonaniem niniejszego wynalazku jest zamrożona lub liofilizowana kultura bakterii kwasu mlekowego (LAB), otrzymana jak opisano. [0088] W dalszym aspekcie wynalazek odnosi się do sposobu wytwarzania produktu żywnościowego lub karmy, a sposób obejmuje stosowanie zamrożonej lub liofilizowanej kultury według wynalazku. [0089] W konkretnym wykonaniu produktem żywnościowym jest produkt oparty na mleku, taki jak ser, jogurt, masło lub ciekły produkt z fermentowanego mleka, taki jak np., maślanka, Ymer, masło i pitny jogurt. W innym wykonaniu wynalazku produktem żywnościowym jest ser, w tym, ser miękki, obejmujący ale nie wyłącznie, Camenber, Brie, Argentine Port Salut, Crezenza i Gorgonzola; sery typu Emmenthal, w tym, ale nie wyłącznie, Emmenthal i Gruyère; typy serów wiejskich, w tym, ale nie wyłącznie, ser Cottage (twarożek ziarnisty): ser typu Feta, w tym, ale nie wyłącznie, Feta i ser biały: typy sera kontynentalnego, w tym, ale nie wyłącznie, Gouda, Edam, Maasdam, Samsoe, Saint Paulin, Raclette, Manchego i Prato; typy sera pasta Filata,w tym, ale nie wyłącznie Mozzarella, Pizza, Provolone i Kaskawał; typy sera Cheddar, w tym, ale nie wyłącznie, Cheddar, Territorials, American Cheddar, Monterey Jack i Colby; i sery typu Grana, w tym, ale nie wyłącznie, Grana, Parmesan i Sbrinz. [0090] Ponadto produkt żywnościowy może być wybrany z produktu mięsnego, produktu warzywnego i napoju, takiego jak wino i piwo. [0091] Innym znaczącym zastosowaniem sposobu według niniejszego wynalazku jest zastosowanie ciekłych kultur starterowych jako tak zwanych probiotyków. Przez termin probiotyk w niniejszym kontekście rozumiana jest kultura mikroorganizmu, która po spożyciu w postaci żywotnych komórek przez ludzi lub zwierzęta poprawia stan zdrowotny np. przez usunięcie szkodliwych mikroorganizmów w przewodzie żołądkowojelitowym, przez pobudzenie układu odpornościowego, lub przez wkład w trawienie substancji odżywczych. Typowym przykładem takiego probiotycznie aktywnego produktu jest sweet acidophilus milk. 12
[0092] W dalszych wykonaniach sposób według wynalazku jest stosowany w wytwarzaniu karmy zwierzęcej, takiej jak kiszonka, np. trawa, materiał zbożowy, groch lucerna lub liście buraka cukrowego, gdzie kulturami bakteryjnymi szczepi się uprawy pastewne, aby zakisić paszę w celu zabezpieczenia ich, lub w zwierzęcych produktach odpadowych bogatych w białko, takich jak odpadki po uboju lub odpadki rybne, również w celu zabezpieczenia tych odpadków dla celów skarmiania zwierząt. [0093] Wynalazek jest dalej zilustrowany w następujących nieograniczających przykładach i figurach. [0094] Fig1. Pokazuje stabilność handlowej zamrożonej skoncentrowanej kultury (F-DVS, Fl-Da N, Chr, Hansen A/S pozycja nr 501691) w czasie fazy początkowej przechowywania w -50 o C. Aktywność kultury określa się w próbie aktywności zakwaszania stosując ilość materiału inokulacyjnego, która wynosi 0,01% wag./obj. ph zmierzono po 6 godz. inkubacji w 30 o C w mleku. Uwaga: wyższe ph wskazuje niższą aktywność zakwaszania (np. mniejsza aktywność metaboliczna) kultury. [0095] Fig.2 Pokazuje stabilność przechowywania wyrażoną jako aktywność zakwaszania zamrożonej skoncentrowanej kultury F-DVS CH-N14 (Chr, Hansen A/S pozycja nr 200118) z i bez dodanych 3% wag./wag. IMP. Uwaga: rzędna pokazuje ph mierzone po 6 godz. inkubacji w 30 o C, ilość materiału inokulującego 0,01% wag./obj.. Wyższe ph wskazuje mniejszą aktywność zakwaszania (tj. mniejszą aktywność metaboliczną ) kultury. Puste kwadraty wskazują kultury z dodanym IMP, podczas gdy romby wskazują kultury bez IMP. [0096] Fig. 3. Pokazuje aktywność zakwaszania kultury F-DVS CH-N 14 (Chr, Hansen A/S pozycja nr 200118) z lub bez dodanego IMP. Fermentację przeprowadzono z kulturami po 2 miesiącach przechowywania w -50 o C. Fermentację testowano w nisko-pasteryzowanym pełnym mleku postępując według profilu temperaturowego Danbo z Tabeli 2. Ilości dodanej kultury są podane w % wag./obj.. Uwaga: rzędna pokazuje ph mierzone po 6 godz. inkubacji w 30 o C. Wyższe ph wskazuje mniejszą aktywność zakwaszania (tj. mniejszą aktywność metaboliczną ) kultury. [0097] Na Fig. 4 zilustrowano utratę aktywności w czasie zamrażania kultury F-DVS CH-N 19 (Chr, Hansen A/S pozycja nr 501593). Kulturę przetestowano na aktywność tego samego dnia, w którym została wytworzona (w dniu 0). Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe. Uwaga: rzędna pokazuje ph mierzone po 6 godz. inkubacji w 30 o C, ilość materiału inokulującego 0,01% wag./obj.. Wyższe ph wskazuje mniejszą aktywność zakwaszania (tj. mniejszą aktywność metaboliczną ) kultury. [0098] Na Fig. 5 zilustrowano utratę aktywności zakwaszania kultury F-DVS F1DaN (Chr, Hansen A/S pozycja nr 501691) jako funkcję ilości dodanego IMP. Koncentraty przechowywano jako ciecz w 8 o C przez 1 godz. przed zamrożeniem. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe. Uwaga: rzędna pokazuje ph mierzone po 6 godz. inkubacji w 30 o C, ilość materiału inokulującego 0,01% wag./obj.. Wyższe ph wskazuje mniejszą aktywność zakwaszania (tj. mniejszą aktywność metaboliczną ) kultury. [0099] Na Fig. 6 pokazano stabilność przechowywania wyrażoną jako aktywność zakwaszania liofilizowanej zatężonej kultury DVS FI-DaN z lub bez dodanego 3% wag./obj. IMP. Kulturę testowano na aktywność po 7 dniach przechowywania w -50 o C. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe. Uwaga: rzędna pokazuje ph mierzone po 6 godz. inkubacji w 30 o C, ilość materiału inokulującego 0,01% wag./obj. Wyższe ph wskazuje mniejszą aktywność zakwaszania (tj. mniejszą aktywność metaboliczną ) kultury. [0100] Na Fig. 7 pokazano stabilność przechowywania wyrażoną jako aktywność zakwaszania zamrożonej zatężonej kultury (F-DVS FI-Da N, Chr, Hansen A/S pozycja nr 501691) w czasie początkowej fazy przechowywania z lub bez dodatku 3% wag./wag. IMP, GMP, inozyny lub bez żadnego dodatku. Uwaga: rzędna 13
pokazuje ph mierzone po 6 godz. inkubacji w 30 o C, ilość materiału inokulującego 0,01% wag./obj. Wyższe ph wskazuje mniejszą aktywność zakwaszania (tj. mniejszą aktywność metaboliczną ) kultury. Otwarty romb wskazuje dodanie 3% wag./wag. IMP, szary kwadrat wskazuje dodanie 3% wag./wag. GMP, pełny trójkąt wskazuje dodanie 3% wag./wag. inozyny, a kółko wskazuje, że nie dodano substancji krioochronnej. Przykłady Materiały i metody Kultury [0101] Stosowano następujące dostępne w handlu kultury: FI DaN, CH N14 i CH N 19. Wszystkie trzy kultury są dostępnymi w handlu zamrożonymi LD-kulturami w postaci zamrożonych kultur do bezpośredniego zaszczepiania (F-DVS ) od Chr. Hansen A/S Dania jako F-DVS FI-Da N (Chr, Hansen A/S pozycja nr 501691), F-DVS CH N14 (Chr, Hansen A/S pozycja nr 200118), F-DVS CH N19 (Chr, Hansen A/S pozycja nr 501593) Pożywka fermentacyjna i warunki fermentacji Skład pożywki dla LD-kultur [0102] LD-kultury hodowano w pożywce o następującym składzie: hydrolizat kazeiny (Oxoid, Basingstoke, UK kod produktu L41), 30 g/l, Primatone RL (Quest, Naarden, Holandia, kod produktu 5X59051), 30 g/l ; pepton sojowy (Oxoid Basingstok, Uk, kod produktu L44), 30 g/l ; ekstrakt drożdżowy (Oxoid, Basingstoke, UK, kod produktu L21), 15g/l; MgSO4, 1,5 g/l; askorbinian sodu, 3g/l; i laktoza 50g/l. [0103] Pożywkę sterylizowano przez traktowanie UHT (143 o C przez 8 sek.) Końcowa pożywka miała ph 6,5. Warunki fermentacji dla LD-kultur : [0104] Fermentację przeprowadzono w 100 l fermentorze w 30 o C stosując 1% (wag./wag.) kultury wymienionej powyżej jako inokulum. Fermentację anaerobową przeprowadzono z azotem nad roztworem, a ciśnienie nad roztworem wynosiło 0,2 bara. Kultury pozostawiono do zakwaszania do ph 6,0. Następnie ph utrzymano na 6,0 przez dodawanie w kontrolowany sposób 13,4 N NH 4 OH. [0105] Gdy nie wykryto dalszego spożycia zasady, odpowiednie kultury oziębiono do około 10 o C. Traktowanie LD-kultur po fementacji: [0106] Po oziębieniu bakterie w bulionach farmentacyjnych zatężono 10-20- krotnie przez odwirowanie dodanych substancji dodatkowych, a następnie zamrażano w postaci paletek w ciekłym azocie przy ciśnieniu jednej atmosfery, jeśli nie wskazano inaczej. Aktywność zakwaszająca peletek mierzono w różnych czasach po zamrożeniu, reszta peletek była przechowywana w -50 o C aż do dalszej analizy, o ile nie wskazano inaczej. Dodatki [0107] Dodatki otrzymano jak wskazano: inozyno-5 -monofosforan (IMP) (Alsiano A/S Brikeroed DK,) adenozyno-5 -monofosforan (AMP) (Sigma A2252), uranozyno-5 -monofosforan (UMP) (Sigma U6375), cytydyno-5 -monofosforan (CMP) (sigma C1006), mrówczan Na (Kirsch Pharma, Salzgitter, DE), adenozyna (Alsiano, A/S, Brikeroed, DK), guanozyna (Alsiano A/S, Brikeroed, DK) i inozyna (Alsiano Brikeroed, DK). Próba aktywności zakwaszającej i analiza CFU: 14
[0108] 200 ml sterylizowanego UHT rekonstytuowanego odtłuszczonego mleka (RSM) zawierającego 9,5 % (wag/wag) substancji stałej i ogrzewanego w 99 o przez 30 min (mleko-lab) zaszczepiono zamrożoną kulturą na poziomie 0,01 % (wag/wag). RSM inkubowano w 30 o przez 6 godzin, aby umożliwić zakwaszenie materiału substratowego. Aktywność zakwaszania zmierzono, jak opisano w Przykładzie 6: Procedura Analityczna QAm-052 aktywność zakwaszania UHT Chr. Hansen A/S Dania. Symulowane wytwarzanie sera po profilu temperatury DANBO: [0109] Zakwaszanie przeprowadza się według profilu temperaturowego odzwierciedlającego przebieg, temperatura- czas, na który będzie typowo natrafiała kultura, gdy będzie stosowana w mleczarstwie do wytwarzania danego produktu mleczarskiego, w tym przypadku sera DANBO. [0110] ph mierzy się w ustalonych czasach, jak wskazano w Tabeli 2. Tabela 2. Profil Danbo Czas, minuty Temperatura, o C Odchylenie 02:40 31,0 o C ±0,2 o C 00:15 Próg 31,0 o C do 38,0 o C ±0,5 o C 00:35 38,0 o C ±0,2 o C 04:24 Próg 38,0 o C do 16,0 o C ±0,5 o C Do 16:00 16,0 o C ±0,2 o C [0111] Aktywność zakwaszania zmierzono, jak opisano w Przykładzie 7: Procedura Analityczna QAm-043 aktywność zakwaszania- Programowany profil temperaturowy Chr. Hansen A/S Dania. [0112] Analizę CFU przeprowadzono i obliczono jak opisano w Przykładzie 8: Procedura Analityczna QAm- 071 aktywność zakwaszania- Obliczanie mikroorganizmów Chr. Hansen A/S Dania. Przykład 1 Badanie stabilności zamrożonej kultury-ld FI-DaN [0113] W tym przykładzie stabilność mierzoną przez aktywność zakwaszania wytwarzanej w handlu LDkultury F-DVS FI-DaN (Chr. Hansen A/S numer 501691) śledzono przez okres sześciu miesięcy. Kulturę wytworzono i przechowywano w -50 o C,jak opisano w dziale Materiały i Metody. [0114] W przeciwieństwie do tego co powszechne, pierwszy pomiar aktywności w tym przykładzie przeprowadzono natychmiast po zamrożeniu w postaci peletek w ciekłym azocie z późniejszymi pomiarami po 1, 2, 12, 20 i 188 dniach przechowywania w -50 o C. [0115] Wyniki tego doświadczenia są przedstawione na Figurze 1. [0116] W czasie pierwszych dni przechowywania aktywność zakwaszania drastycznie zmniejszyła się. Tylko po jednym tygodniu przechowywania aktywność zakwaszania zmniejszyła się o 0,26 jednostki ph. To zmniejszenie jest równoważne 50 % zmniejszeniu aktywności zakwaszania tylko po jednym tygodniu przechowywania. Po dwóch tygodniach przechowywania dalsza utrata aktywności zakwaszania kultury stała się mniej wyraźna, a aktywność zakwaszania kultury zmniejszyła się tylko marginalnie podczas pozostałego okresu. 15
[0117] Nieoczekiwany wynik tego doświadczenia uświadomił twórcom, że są znaczące i do tej pory nierozpoznane problemy ze stabilnością, które dotyczą zamrażania i początkowej fazy przechowywania niektórych typów istotnych dla handlu skoncentrowanych, zamrożonych kultur bakterii kwasu mlekowego, takich jak na przykład dostępnych w handlu zamrożonych LD-kultur. Przykład 2 Badanie stabilności zamrożonej kultury-ld CH N14 z zastosowaniem IMP jako czynnika krioochronnego. [0118] W przykładzie tym opisano badanie stabilności zamrożonych kultur do bezpośredniego zaszczepiania (F-DVS ) CH N14 formułowanych z IMP jako czynnikiem krioochronnym. W tych eksperymentach stężenie IMP utrzymywano na poziomie 3 % wag./wag. na gram zatężonej biomasy. IMP dodano do koncentratu jako 30 % wag./wag. sterylny roztwór. [0119] Po fermentacji zebrano biomasę i zatężono przez odwirowanie z bulionu fermentacyjnego F-DVS CH N 14. Koncentrat komórkowy podzielono na dwie porcje, po 300 g każda i dodano IMP do jednej z porcji. Dodatki i koncentraty mieszano przez 30 min., zamrożono w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w -50 o C. Zamrożone kultury miały zawartość żywotnych bakterii co najmniej 10 10 jednostek tworzących kolonię (CFU) na gram zamrożonego materiału. Aktywność kultury w mleku (mleko-lab) zmierzono po 3 dniach przechowywania w -50 o C i aktywność śledzono okresowo aż do 65 dni. [0120] Profile stabilności dla F-DVS CH N14 podane jako aktywność zakwaszania są podsumowane na Figurze 2. [0121] Jest oczywiste, że F-DVS CH N14 wolne od dodatków traci aktywność. Zmniejszenie stabilności jest równe 0,25 jednostki ph dla CH N14 po przechowywaniu przez 65 dni w -50 o C. 0,25 jednostki ph jest prawie równe 50 % utracie aktywności zakwaszania (tj. stabilizowana kultura jest około dwa razy aktywniejsza niż niestabilizowana kultura). Przykład 3 Badanie stabilności zamrożonej kultury-ld F-DVS CH N14 z zastosowaniem IMP jako czynników krioochronnych testowanych zgodnie z profilem temperatury [0122] W tym doświadczeniu testowano próbki z kultury opisanej w Przykładzie 2 po przechowywaniu przez około dwa miesiące w -50 o C. Aktywność zakwaszania mierzono w kilku punktach czasowych podczas inkubacji zgodnie z symulowanym profilem temperaturowym Danbo patrz Tabela 2. Pożywką fermentacyjną było nisko pasteryzowane mleko pełne podobne do mleka, które normalnie jest stosowane do handlowego wytwarzania sera Danbo. [0123] Porównywano aktywność zakwaszania kultur z i bez inozyno-5 -monofosforanu (IMP) dodanego przed zamrożeniem. [0124] Jeden zestaw butelek z nisko pasteryzowanym, pełnym mlekiem zaszczepiono zamrożoną kulturą CH N14 bez dodania IMP. W tym przypadku ilość dodanej kultury wynosiła odpowiednio 0,01 %, 0,02 % i 0,03 % (wag./wag. %). [0125] Inny zestaw butelek z nisko pasteryzowanym, pełnym mlekiem zaszczepiono zamrożoną hodowlą CH N14 z 3 % (wag./wag. %) IMP dodanym przed zamrożeniem. W tym przypadku ilość dodanej hodowli wynosiła 0,01 % (wag./wag. %). 16
[0126] Jak widać w Przykładzie 2 kultura bez IMP utraciła około 50 % aktywności zakwaszania co jest równoznaczne z faktem, że kultura z dodanym IMP ma aktywność, która jest prawie podwojoną aktywnością w porównaniu z podobną ilością podobnej kultury bez dodanego IMP. [0127] W celu zilustrowania pobudzającego działania IMP próbkę bez dodanego IMP zaszczepiono stosując trzy różne ilości kultury CH N14. Sądząc na podstawie wyników otrzymanych w Przykładzie 1 (tj. że nieco mniej niż 50 % aktywności traci się podczas przechowywania kultury bez dodanego IMP) można byłoby oczekiwać, że aktywność zakwaszania 0,01 % inokulum kultury z dodanym IMP będzie między aktywnością zakwaszania 0,01 %, a 0,02 % inokulum kultury bez dodanego IMP. [0128] Jednak jak zilustrowano na Figurze 3, to nie jest ten przypadek. Aktywność zakwaszania 0,01 % inokulum kultury z dodanym IMP okazuje się być gdzieś między aktywnością zakwaszania 0,02 % a 0,03 % inokulum kultury bez dodanego IMP. Tę ekstra aktywność przypisujemy działaniu pobudzającemu dodanego IMP. [0129] Doświadczenie to pokazuje, że dodanie IMP do kultury skutkuje 2-2,5 razy wyższą aktywnością w porównaniu z dodaniem podobnej ilości podobnej kultury bez dodanego IMP. [0130] Działanie pobudzające było nieoczywiste w Przykładzie 2, ponieważ w Przykładzie 2 było poddane raczej ostrej procedurze sterylizacji ciepłem tj. mleko LAB. W naszym doświadczeniu działanie pobudzające było najbardziej wyraźne w mleku stosowanym do wytwarzania sera, ponieważ takie mleko typowo jest nisko pasteryzowanym mlekiem. Przykład 4 Utrata aktywności w CH-N19 w trakcie zamrażania [0131] W przykładzie tym opisuje utratę aktywności podczas zamrażania kultury CH-N19 formułowanej z IMP jako czynnikiem krioochronnym. W doświadczeniach stężenie IMP było utrzymywane przy 3 % wag./wag. na gram zatężonej biomasy (dodane jako sterylny 30 % wag./wag. roztwór). [0132] Po fermentacji zebrano biomasę i zatężono przez odwirowanie z brzeczki fermentacyjnej kultury CH- N 19. Koncentrat komórkowy podzielono na dwie porcje po 300g, a IMP dodano do jednej porcji. Dodatki i koncentraty mieszano przez 30 min, a następnie 150 g z dwóch porcji zamrożono w ciekłym azocie. Kultura miała zawartość żywotnych bakterii co najmniej 10 10 jednostek tworzących kolonie (CFU) na gram zamrożonego materiału. Zamrożone i niezamrożone kultury z i bez dodanego IMP testowano na ich aktywności zakwaszania natychmiast po wytworzeniu. Zmierzono aktywność kultury w mleku (sterylizowane ciepłem mleko LAB). [0133] Wyniki przedstawione na Figurze 4 pokazują utratę aktywności zakwaszania 0,06 jednostki ph jeżeli kultura była zamrożona bez dodatku IMP. Utrata 0,06 jednostki ph jest równoważna 5-10 % utracie aktywności zakwaszania. Jednak jeżeli dodano IMP do tej kultury nie obserwowano istotnej utraty aktywności. Różnica 0,01 jednostki ph jest tej samej wielkości co błąd standardowy, jak wskazują słupki błędu na figurze. [0134] Wnioskuje się, że IMP również jest zdolne do działania jako czynnik krioochronny i przeciwdziała wpływowi wywieranemu przez zamrażanie tego typu kultury. Przykład 5 Odpowiedź dawki dla IMP z zastosowaniem kultury F-DVS FI-Da N [0135] Przykład ten opisuje badanie odpowiedzi dawki z zamrożonymi kulturami (F-DVS ) FI-Da-N sformułowany z IMP jako czynnikiem krioochronnym. W doświadczeniach stężenie IMP wynosiło 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 17
1 %, 3 % i 6 % wag./wag. na gram zatężonej biomasy. Dodatek dodano do koncentratu jako 30 % sterylny roztwór. [0136] Po fermentacji zebrano biomasę i zatężono przez odwirowanie z fermentacyjnej brzeczki F1-DaN. Koncentrat komórkowy podzielono na 6 porcji po 300 g i dodano IMP do każdej z porcji. Do symulowania sytuacji podobnej do sytuacji przemysłowej w czasie procesu zamrażania dodatki i koncentraty mieszano i przechowywano przez 5 godzin w 8 o C, a następnie zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano dalej w - 50 o C. Zatem ten przykład nie może być porównywany z wcześniejszymi przykładami. Zamrożona kultura ma zawartość żywotnych bakterii co najmniej 10 10 jednostek tworzących kolonię (CFU) na gram zamrożonego materiału. Aktywność kultury w mleku (mleko-lab) mierzono tego samego dnia, gdy sformułowano zamrożone kultury. [0137] Wyniki są przedstawione na Figurze 5. [0138] Z tych wyników jest jasne, że zatężone kultury, które zamrożono bez dodania IMP wykazały większą utratę aktywności zakwaszania. Optymalny wynik (tj. mniejszy spadek aktywności zakwaszania) otrzymano po dodaniu 3 % (wag./wag. %) IMP. Przykład 6 Procedura analityczna QAm-052 aktywność zakwaszania UHT Chr. Hansen A/S (Dania) Zastosowanie [0139] Ten sposób stosuje się do określania aktywności zakwaszania. Zasada [0140] Dla produktów F-DVS i FD-DVS: [0141] Kulturę rozcieńcza się i zaszczepia się nią mleko. Inkubuje się przez podany czas w podanej temperaturze. Po inkubacji mierzy się ph. [0142] Dla zamrożonych Redi-Set (F-RS) i liofilizowanych produktów Redi-Set FD-RS. [0143] Dla tych produktów analiza aktywności składa się z dwóch etapów wzrostu. Kultury typu bulk starter przygotowuje się przez hodowanie kultury w mleku przez podany czas i temperaturę. Po tym mleko zaszczepia się tą kulturą typu bulk starter, a po nowej inkubacji mierzy się ph. Parametry analizy [0144] Oświadczenie o parametrach analizowania produktu może być odczytane w Laboratory Information Management System (LIMS). Przykłady: rodzaj mleka, temperatura mleka przy pierwszym i drugim ważeniu, czas inkubacji, temperatura inkubacji, procent inokulacji dla próbek i standardów kontrolnych. Aparaty i reagenty [0145] ph-metr; elektroda ph; bufory kalibracyjne, ph 7,00 ± 0,01 i ph 4,01 ± 0,01; łaźnia wodna z termostatem, dokładność ± 0,2 o C; czujnik temperatury; waga, dokładność 0,01 g z minimum dwoma miejscami po przecinku; aparat rotacyjny, termometr; zegarek; mieszadło magnetyczne; magnesy; zlewki 50 ml. Procedura [0146] Przygotowanie analizy: [0147] Uwaga: wszystkie kolby powinny pochodzić z tej samej partii tj. z tej samej daty. [0148] Co najmniej 16 godzin przed rozpoczęciem analizy wieczka wszystkich butelek zostały poluzowane. Łaźnia wodna (łaźnie) jest/są ochłodzone do temperatury inkubacji. Butelki do pierwszego ważenia chłodzi się do temperatury inokulacji (może być albo zimne albo gorące mleko). Bufor ph 4,01 i ph 7,00 umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze inkubacji co najmniej 30min. przed kalibracją ph-metru. 18
[0149] Uwaga: dla próbek, które umieszcza się w łaźni lodowej w temperaturze 4 o C przed inkubacją, ogrzanie łaźni wodnej rozpoczyna się przez czasomierz. [0150] Wytwarzanie próbek przed analizą. [0151] Zamrożone hodowle: zamrożone próbki/wzorce kontrolne przed pierwszym ważeniem umieszcza się w pudełku piankowym z suchym lodem i trzyma się tam dopóki nie dokona się wszystkich ważeń. [0152] Zamrożone kultury, które rozmraża się przed użyciem: [0153] Dla zamrożonych produktów, gdzie stosuje się pełen karton, produkt rozmraża się zgodnie z, patrz miejscowa instrukcja. Po rozmrożeniu próbka może być trzymana w 4 o C przez maks. 30 min. przed użyciem. Dla zamrożonych kultur w puszkach puszkę umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 22 o C na 20min. w celu rozmrożenia zawartości. Po rozmrożeniu kultura może być trzymana w temperaturze 4 o C przez maks. 30min. przed zastosowaniem. [0154] Kultury liofilizowane: [0155] Próbki liofilizowane/wzorce kontrolne aklimatyzuje się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem analizy. [0156] Procedura zaszczepiania (inokulacji). [0157] 1-sze ważenie/rozcieńczanie; [0158] Butelkę do 1 szego ważenia umieszcza się na wadze, którą ustawia się na 0. [0159] Odważanie produktu/ wzorców kontrolnych przeprowadza się bezpośrednio do mleka. [0160] Czas 1-szego ważenia rozpoczyna się zawsze, gdy przeprowadza się szczepienie w gorącym mleku. Rzeczywistą ilość inokulum (1-sze ważenie) wprowadza się z co najmniej dwoma miejscami po przecinku. [0161] Zamrożone i rozmrożone produkty wstrząsa się ostrożnie, aż produkt zostanie rozproszony lub maks. 10-krotnie, po czym butelki stoją przez około 50 sek. [0162] Dla produktów liofilizowanych stosowano aparat rotacyjny (szybkość 2) przez 5 min. lub aż do rozproszenia produktu. [0163] Uwaga: Dla produktów liofilizowanych L. acidophilus, Bifidocacterium lub L. casei, wszystkie szczepienia przeprowadza się na czystym stole. [0164] 2-gie ważenie. [0165] Butlę do 2-giego ważenia umieszcza się na wadze, którą ustawia się na zero. [0166] Dla zamrożonych i rozmrożonych produktów butelkę do rozcieńczania wstrząsa się ostrożnie przed przeprowadzeniem drugiego ważenia. 2-gie ważenie przeprowadza się zgodnie z powszechnie przyjętą procedurą kontroli jakości (Qc) w czasie 1 minuty. [0167] Dla produktów liofilizowanych 2-gie ważenie przeprowadza się zgodnie z powszechnie przyjętą Qc. [0168] Czas 2-giego ważenia rozpoczyna się, gdy zaszczepione materiały są zimne/gorące. Rzeczywistą ilość inokulum (2-gie ważenie-) wprowadza się z co najmniej 2 miejscami po przecinku. [0169] Butelki do mierzenia aktywności obraca się, procedurę zaszczepiania powtarza się dla następnych próbek/kontroli. [0170] Butelki do mierzenia aktywności, które szczepi się tą samą 1-odważką, kolejno się szczepi. [0171] Uwaga: odważanie mieszanych produktów: [0172] Najpierw przygotowuje się 1-szą odważkę z każdego wzorca kontrolnego/pojedynczego szczepu. Dla każdego z nich 2-gą odważkę przeprowadza się do tej samej butelki do mierzenia aktywności, zatem będzie ona zawierała wszystkie wzorce kontrolne/ pojedyncze szczepy. 19
[0173] Dla produktów zamrożonych czas od pierwszego ważenia do drugiego ważenia musi wynosić maks. 5 min. Dla produktów liofilizowanych czas od pierwszego ważenia do drugiego ważenia musi wynosić maks. 10 min. [0174] Na koniec należy umieścić butelkę z niezaszczepionym mlekiem w łaźni wodnej. [0175] Dla produktów, gdzie 1-sze ważenie odbywa się w zimnym mleku: Czas( pomiaru) = Czas 2 ważenia + Czas inkubacji lub produktów, gdzie 1-sze ważenie ma miejsce w gorącym mleku: Czas( pomiaru) = Czas 1 ważenia + Czas inkubacji [0176] Uwaga: Dla produktów, które są ponadto badane na długi czas zakwaszania, szczepienie w tym celu można przeprowadzić w tym samym czasie co szczepienie na aktywność zakwaszania. [0177] Z 1-szego ważenia stosowanego do aktywności zakwaszania, 2-gie ważenie można przeprowadzić w zimnym aktywnym mleku, które umieszcza się w 4 o C w celu inkubacji w łaźni wodnej, którą ogrzewa się do temperatury inkubacji. W tym przypadku butelek inkubuje się je przez ½ godziny dłużej niż podany czas inkubacji. [0178] Uwaga: dla produktów gdzie niemożliwe jest zarówno szczepienie jak i pomiar ph próbek/wzorców kontrolnych z powodu długiego czasu zakwaszania w czasie normalnych godzin pracy, 1-sze ważenie przeprowadza się w zimnym mleku. [0179] Po zaszczepieniu aktywnego mleka butelki umieszcza się w łaźni wodnej z chłodzeniem. Czujnik temperatury z zegara kontaktowego umieszcza się w butelce z mlekiem niezaszczepionym, którą umieszcza się w łaźni wodnej. Zegar kontaktowy jest połączony z początkiem ogrzewania w podanym czasie, z chwilą rozpoczęcia ogrzewania produktu będącego przedmiotem zainteresowania, rozpoczyna się czas inkubacji. [0180] Uwaga: Jeżeli jest konieczne zastosowanie więcej niż jednej łaźni wodnej wzorzec kontrolny musi być inkubowany w tej samej łaźni wodnej razem z połączonymi z nim próbkami. [0181] Pomiar elektrody ph [0182] Kalibrację przeprowadza się zgodnie z powszechnie przyjętymi instrukcjami dotyczącymi kalibracji i utrzymania elektrody. Pomiar ph-metru [0183] ph musi być zmierzone w próbkach/wzorcach kontrolnych w Czasie pomiaru. Jeżeli czas jest przekroczony o jedną minutę, jest zanotowany. Jeżeli czas jest przekroczony więcej niż dwie minuty, pomiar jest pominięty. Tuż przed czasem pomiaru butelkę obraca się o 180 o C. [0184] Pomiar ph przeprowadza się w butelce lub w próbce, która jest wlana do 50 ml zlewki z magnesem do mieszania. [0185] ph rejestruje się z co najmniej dwoma miejscami po przecinku. [0186] Rejestruje się możliwe uwagi dotyczące pomiaru. Procedurę pomiarową kontynuuje się, aż zostaną zmierzone wszystkie próbki / wzorce kontrolne i niezaszczepione mleko. Temperaturę łaźni wodnej mierzy się w butelce z zaszczepionym mlekiem i rejestruje w rejestrze. [0187] Na koniec mierzy się ph w buforach do kalibracji. 20
Przykład 7: Procedura analityczna QAm-043, aktywność zakwaszania programowany profil temperaturowy Chr. Hansen A/S (Dania) Zastosowanie [0188] Sposób ten stosuje się do określenia aktywności zakwaszania według testu Pearca i w innych sytuacjach, gdzie zakwaszanie przeprowadza się zgodnie z profilem temperaturowym np. profilem Danbo. Tylko test Pearca jest objęty wzorcem IDF (międzynarodowy wzorzec mleczarski) Zasada [0189] Zakwaszenie przeprowadza się zgodnie z profilem temperaturowym odzwierciedlającym przebieg temperatury, który typowo będzie napotykać kultura, gdy jest stosowana w mleczarstwie do wytwarzania danego produktu mleczarskiego. [0190] Dla testu Pearce a jest to temperatura wytwarzania sera w czasie produkcji Cheddar. [0191] ph jest mierzona w wyznaczonym czasie. [0192] Dla kultur, gdzie w trakcie analizy nie dodaje się podpuszczki, może być stosowany ciągły pomiar ph. Parametry analizy [0193] W LIMS podaje się parametry analizy, które są swoiste dla produktu. [0194] Definicja profilu temperatury (dla produktów, gdzie nie jest stosowany profil Pearce a). [0195] Należy stosować wzorzec kontrolny. [0196] Typ pomiaru ph. [0197] Procent inokulatu dla próbki i wzorców kontrolnych. [0198] Mleko rozcieńczone: 206,9 g zimnego (4 o C) mleka-lab (tj. sterylizowanego UHT rekonstytuowanego odtłuszczonego mleka (RSM) zawierającego 9,5% (wag./wag.) substancji stałej i ogrzewano w 99 o C przez 30 minut). [0199] Aktywne mleko : 200 g zimnego (4 o C) pasteryzowanego mleka pełnego 3,5% tłuszczu. [0200] Podpuszczka: wzorzec Naturén 190 rozcieńczony wodą 1:40. Aparat i reagenty [0201] ph-metr/ph-metr do półciągłego pomiaru ph eks. Radiometer PHM92. [0202] elektroda ph Radiometer PFC2401. [0203] Bufory: ph 7,00±0,01 i ph 4,01±0,01. [0204] Łaźnia wodna z termostatem zaprogramowanym na ogrzewanie według wcześniej określonego profilu temperatury ±0,2 o C. [0205] Czujnik temperatury. [0206] Waga, dokładność 0,01 g z minimum dwoma miejscami po przecinku. [0207] Zegarek. [0208] Mieszadło magnetyczne. [0209] Magnesy. [0210] Zlewki, 50 ml. [0211] Małe nakrętki plastikowe. [0212] Aparat rotacyjny. Procedura [0213] Przygotowanie analizy [0214] Wszystkie butelki powinny być z tej samej partii tj. z tej samej daty. 21
[0215] Łaźnia ( e) wodna (e) jest/są ochłodzone do temperatury początkowej zastosowanego profilu temperatury. [0216] Butelki do rozcieńczania (= 1-sze ważenie) i do pomiaru aktywności (2-gie ważenie) umieszcza się w 4 o C tuż przed użyciem. [0217] Buforowy ph 4,01 i ph 7,00 umieszcza się w łaźni wodnej w określonej temperaturze pomiaru ± 0,2 C co najmniej 30 minut przed kalibracją ph-metru. [0218] Przygotowanie próbek przed analizą [0219] Zamrożone kultury: [0220] Zamrożone próbki /wzorce kontrolne przed 1-szym ważeniem umieszcza się w pudełku piankowym z suchym lodem i trzyma się tam, aż przeprowadzi się wszystkie ważenia. [0221] Zamrożone kultury, które są rozmrażane przed użyciem: [0222] Dla zamrożonych produktów, gdy cały karton został zużyty, produkt rozmraża się zgodnie z powszechnie przyjętymi instrukcjami. [0223] Po rozmrożeniu próbki można trzymać w 4 C przez maks. 30 minut przed użyciem. [0224] Kultury liofilizowane: [0225] Liofilizowane próbki i wzorce kontrolne aklimatyzuje się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem analizy. [0226] Jeśli próbkę zamierza się użyć do ponownego badania następnego dnia, może być przechowana w +8 C. [0227] Procedura zaszczepiania (inokulacji): [0228] Ważenie produktu/wzorca kontrolnego przeprowadza się bezpośrednio do mleka. [0229] Rzeczywistą ilość inokulum (1-sze ważenie) wprowadza się z co najmniej dwoma miejscami po przecinku. [0230] Zamrożone i rozmrożone produkty obraca się ostrożnie około 4-krotnie, po czym butelka stoi przez około 50 sekund. [0231] Dla produktów liofilizowanych musi być zastosowany aparat rotacyjny. Musi to być przeprowadzone z często stosowaną szybkością przez 5 minut lub do czasu, gdy produkt rozpuści się całkowicie. Kontroluje się to przez pozostawienie butelki na moment na stole, a następnie sprawdzenie roztworu przez oglądanie dna butelki. [0232] Uwaga: [0233] Jeśli dla rutynowej pracy jest dogodne zimno, 1-sza odważka może stać w temperaturze pokojowej przez maks. 15 minut przed 2-gim ważeniem. [0234] 2-gie ważenie: [0235] Zanim przeprowadzi się 2-gie ważenie, obraca się butelkę do rozcieńczania. [0236] Rzeczywistą ilość inokulum (2-ga odważka) wprowadza się z co najmniej dwoma miejscami po przecinku. [0237] Butelkę do pomiaru aktywności obraca się i procedurę inokulacji powtarza się dla próbek/wzorców kontrolnych. [0238] Butelki do pomiaru aktywności, które zaszczepia się z tego samego 1-szego ważenia są kolejno zaszczepiane. 22
[0239] Do każdej butelki dodaje się 2 ml podpuszczki albo przed albo po 2-gim ważeniu. Następnie butelki obraca się, aby podpuszczka została rozprowadzona. [0240] Podpuszczki nie dodawano do profilu Danbo. [0241] (Wzorzec nie IDF). [0242] Następnie butelki inkubuje się w jednym czasie, jak opisano w 6. [0243] Na końcu, 2 butelki niezaszczepionego mleka umieszcza się w łaźni wodnej. Jedną dla zmierzenia temperatury łaźni wodnej i jedną dla zmierzenia ph w ślepym (kontrolnym) mleku. INKUBACJA [0244] Uwaga: Jeżeli jest wymagana więcej niż jedna łaźnia wodna, wzorzec kontrolny MUSI być inkubowany razem z połączonymi z nim próbkami w tej samej łaźni wodnej. [0245] Wszystkie butelki do pomiaru aktywności inkubuje się w tym samym czasie we wcześniej ogrzanej łaźni wodnej w określonej temperaturze początkowej dla profilu temperatury. [246] Profil temperatury rozpoczyna się w tym samym czasie, gdy butelki umieszcza się w łaźni wodnej. [247] Odtąd kontroluje się temperaturę inkubacji przez termostat zaprogramowany do śledzenia pewnego profilu temperatury. Dla testu Pearce patrz tabela 3, a Danbo - tabela 4. [0248] Poziom wody w łaźni wodnej powinien być min. 2 cm wyższy niż poziom mleka. Mleko. Tabela 3. Program temperatury w profilu Pearce ( śledzący IDF) Czas, minuty Temperatura, o C Odchylenie 0 31,0 ±0,2 C 50 31,0 ±0,2 C 54 31,7 ±0,5 C 58 32,2 ±0,5 C 62 32,8 ±0,5 C 66 33,3 ±0,5 C 70 33,9 ±0,5 C 73 34,4 ±0,5 C 76 35,0 ±0,5 C 79 35,6 ±0,5 C 82 36,1 ±0,5 C 85 36,7 ±0,5 C 87,5 37,2 ±0,5 C 90 37,8 ±0,2 C 360 37,8 ±0,2 C Tabela 4: Profil Danbo Czas, minuty Temperatura, o C Odchylenie 02:40 31, 0 o C ±0,2 C 00:15 Ramp 31,0 do 38,0 o C ±0,5 C 00:35 38,0 o C ±0,2 C 04:24 Ramp 38,0 o C do 16,0 o C ±0,5 C aż do 16:00 16 C ±0,2 C 23
[0249] Uwaga: Po czasie 3 godzin i 30 minut, odkręć wodę chłodzącą. * Pomiar ręczny ph po 06:00 godzinach +/- 2 minutach odpowiada temperaturze w łaźni wodnej 25,5 C +/- 0,5 C. KALIBROWANIE ELEKTRODY ph [0250] Kalibrowanie przeprowadza się w temperaturze początkowej zgodnie z powszechnie przyjętą instrukcją dotyczącą kalibracji i trzymania elektrody. POMIAR ph [0251] Po inkubacji butelki dobrze wstrząsa się i mierzy się ph. [0252] Pomiar ph przeprowadza się w butelce lub w próbce, którą przelewa się do 50 ml zlewki z mieszadłem magnetycznym. [0253] ph mierzy się przynajmniej do drugiego miejsca po przecinku. [0254] Zapisuje się możliwe uwagi dotyczące pomiaru. [0255] Procedurę pomiaru kontynuuje się do czasu, aż zmierzy się wszystkie próbki /wzorce kontrolne i niezaszczepione mleko. [0256] Mierzy się i zapisuje końcowe ph w buforach. [0257] Ciągły pomiar ph. [0258] Wartości ph mierzy się od momentu, gdy uruchamia się profil temperatury. Po zakończeniu inkubacji, rejestruje się wartości ph w obu buforach zmierzone w temperaturze początkowej. Przykład 8: Procedura analityczna Q-AM-071 Policzenie mikroorganizmów Chr-Hansen A/S (Dania) DZIEDZINA ZASTOSOWANIA [0259] Sposób ten stosowany jest do policzenia bakterii kwasu mlekowego w różnych kulturach starterowych i do policzenia zanieczyszczeń krzyżowych. Sposób jest możliwy do zastosowania jedynie razem z dotyczącym kultury programem analitycznym, zgodnie z powszechnie przyjętymi procedurami kontroli jakości (Qc) i musi być tu podane odniesienie do parametrów analitycznych. ZASADA [0260] Sposób jest sposobem ilościowym, gdzie wynik jest przedstawiony jako CFU/g. [0261] Znaną ilość próbki homogenizuje się z rozcieńczalnikiem i przygotowuje się rozcieńczenia dziesiętne. Odpowiednie rozcieńczenia miesza się z Agarem Leesment a lub rozprowadza się na powierzchni. Po inkubacji liczy się wszystkie kolonie. POBIERANIA PRÓBEK Pobierz próbki zgodnie z ustalonymi mikrobiologicznymi zasadami, tak aby próbka, była możliwie najbardziej reprezentatywna dla badanego produktu. APARATURA I SZKŁO [0263] 250 ml butelki [0264] Probówki 20 ml z nakrętkami [0265] Autoklaw, działający przy ±1 C [0266] ph metr czuły do ±0,2 [0267] Waga, działająca przy ± 0,01 g [0268] Mikser wirowy [0269] Homogenizator typu Stomacher [0270] Sterylne torebki Stomacher, 400 ml 24
[0271] Inkubator, działający w ±1 C [0272] Łaźnia wodna, działająca w ±1 C [0273] Sterylne pipety [0274] Szalki Petriego, 9 cm [0275] Sterylne głaszczki Drigalskiego Pożywki [0276] Tabela 5. Rozcieńczalnik, zawartości Pepton kazeinowy 15,0 g NaCl 9,0 g Antyspieniacz FG-10,2% 1,14 ml [0277] Przygotowanie [0278] Zawiesić składniki w 1000 ml wody destylowanej. Ogrzać do temperatury wrzenia przy częstym wstrząsaniu. Odmierzyć rozcieńczalnik do butelek lub probówek i autoklawować w 121 C przez 15 minut. [0279] ph po autoklawowaniu 7,0±0,2. [0280] Zawartość w butelkach po autoklawowaniu: 99,0±1,0 ml. [0281] Zawartość w probówkach po autoklawowaniu: 9,0±0,05 ml. [0282] Jeśli rozcieńczalnik ma być natychmiast stosowany (Tabela 5), wtedy chłodzi się do 20 C lub niżej. [0283] Przechowywanie [0284] Przygotowany rozcieńczalnik (Tabela 5) można przechowywać przez 6 miesięcy w 5 C w ciemnym pomieszczeniu. Tabela 6. Agar Leesment a, zawartość Trypton (Oxoid L 42) 20,0 g Wyciąg drożdżowy (Oxoid L 21) 5,0 g Żelatyna 2,5 g Laktoza 10,0 g NaCl 4,0 g Cytrynian trisodu, 2H 2 O (Merck 6432) 2,0 g Mleczan wapnia, 5H 2 O (Merck 2102) 8,0 g Agar (So-Bi-Gel) 12,0 g [0285] Przygotowanie [0286] Zawiesić składniki w 1000 ml wody destylowanej. Ogrzać do temperatury wrzenia w trakcie częstego wstrząsania, aż do całkowitego rozpuszczenia. Rozdzielić pożywkę do butelek i autoklawować w 1214 C przez 15 min. ph po autoklawowaniu : 6,8±0,2 [0287] Jeżeli pożywka ma być natychmiast stosowana, schłodzić ją do około 47 o C w łaźni wodnej. Dla wszystkich kultur CR przed użyciem 2 ml 50% roztworu glukozy musi być dodane do 200 ml Agaru Leesment a (Tabela 6). [0288] Jeżeli pożywkę stosowaną do posiewu powierzchniowego rozlewa się po 12-15 ml stopionej pożywki na szalki Petriego i pozostawia do zastygnięcia i wyschnięcia przez 30 minut na czystym stole. 25
[0289] Roztwór glukozy [0290] 2,0 g glukozy rozpuszcza się w 100 ml wody destylowanej. Następnie roztwór filtruje się sterylnie z zastosowaniem filtra 0,20 nm. [0291] Agar glukozowy Leesment a [0292] Bezpośrednio przed użyciem 2 ml 50% roztworu glukozy dodaje się do 200 ml Element Agar (Tabela 6) [0293] Przechowywanie [0294] Wytworzony Agar Leesment a (Tabela 6) można przechowywać w ciemności przez 6 miesięcy w 5 o C. [0295] Wylane płytki zapakowane w plastikowe torebki można przechowywać w ciemności przez 10 dni w 5 o C. PROCEDURA [0296] NB - Okres analityczny od odważenia próbki aż do czasu, gdy próbka jest wylewana na płytkę lub wysiewana na płytkę, nie może przekroczyć 30 minut. [0297] Przed rozpoczęciem badania mikrobiologicznego, roztopić pożywkę we wrzącej łaźni wodnej lub przez zagotowanie w autoklawie, a następnie ochłodzić do 47 ± 1 C w łaźni wodnej. [0298] Uwaga jeżeli mają być stosowane płytki przed posiewem lanym powierzchnia pożywki musi być osuszona przed posiewem. [0299] W Analitycznym Programie lub Qc dotyczących produktu podawane jest, co następuje: [0300] a) Ilość gramów (X) zastosowanych do pierwszego rozcieńczenia (D1) [0301] b) Minuty w Homogenizatorze typu Stomacher (M) [0302] c) Odpowiednie rozcieńczenie (D2) [0303] d) Ilość do posiewu (A ml) [0304] e) Parametry inkubacji [0305] f) Sposób posiewu [0306] Przygotowanie rozcieńczeń [0307] Odważyć X gramów produktu do sterylnej torby Stomacher i dodać przez odważenie wystarczającą ilość sterylnego rozcieńczalnika, aby wytworzyć pierwszy roztwór.(d1). Umieścić torbę w Homogenizatorze typu Stomacher i potraktować przez (M) minut. Jeśli jest to dogodne, wlać zawartość torby do pustej, sterylnej butelki. Używając sterylnej pipety, przenieść 0,1 lub 1,0 ml z najniższego rozcieńczenia do butelki lub probówki ze sterylnym rozcieńczalnikiem do wytworzenia następnego rozcieńczenia (które obecnie jest najniższe). [0308] Zawartość w butelce miesza się przez wstrząsanie butelki przez 7 sekund 20-25-krotnie pod kątem 30 o. Zawartość w probówce miesza się w mikserze obrotowym przy maksymalnej szybkości przez 3 x 1 sek. [0309] Pozwolić, aby piana osiadła i powtarzać punkt 4 i 5 aż do osiągnięcia właściwego(ch) rozcieńczenia/rozcieńczeń (D2). [0310] Szalka do posiewu lanego [0311] Używając sterylnej pipety przenieść A ml odpowiedniego rozcieńczenia/rozcieńczeń (D2) do szalek Petriego. Wlać do każdej szalki Petriego 10-12 ml stopionej pożywki w nie więcej niż 47± 1 o C i dobrze wymieszać z próbką. Jako kontrolę sterylności wlać do pustej szalki Petriego 10-12 ml stopionej pożywki. Pozostawić szalki na czystej poziomej powierzchni do czasu zestalenia pożywki. Odwrócić szalki i inkubować zgodnie z dotyczącą produktów Qc. 26
[0312] Szalka do posiewu powierzchniowego [0313] Używając sterylnej pipety przenieść A ml odpowiedniego rozcieńczenia/rozcieńczeń (D2) na powierzchnię pożywki. Rozprowadzić próbkę po całej pożywce używając głaszczki Drigalskiego. Użyć niezaszczepionej szalki Petriego z pożywką, jako kontroli sterylności. Pozostawić próbkę do zaabsorbowania jej przez pożywkę, zanim szalki zostaną odwrócone i inkubowane, zgodnie z dotyczącą produktów Qc. ZLICZANIE KOLONII [0314] W celu całkowitego zliczenia żywotnych komórek wybrano szalki Petriego zawierające między 30-300 kolonii. Wszystkie kolonie policzono. [0315] W celu policzenia zakażenia krzyżowego wybrano szalki Petriego niezawierające więcej niż 300 kolonii. Wszystkie kolonie policzono. [0316] Uwaga - Dzięki policzeniu krzyżowego zakażenia analizowany produkt może wytwarzać kolonie punktowe, które mogą tworzyć mgiełkę w tle. Dlatego liczono tylko kolonie punktowe większe niż w mgiełce. OBLICZANIE [0317] Po policzeniu musi być przeprowadzony test χ2 na zliczeniach płytkowych, zgodnie ze standardowymi statystycznymi procedurami. [0318] Uwaga - Testu χ2 nie przeprowadza się, gdy sposób stosuje się dla zakażeń krzyżowych. [0319] Jeżeli nie akceptuje się testu χ2, wyniki muszą być odrzucone, a analiza powtórzona. [0320] Jeżeli test χ2 akceptuje się, średnią liczbę (N) CFU/g oblicza się zgodnie z poniższym: N=(Σ c)/((n1+0,1n2)d) gdzie: Σc jest sumą kolonii obliczoną na wszystkich szalkach Petriego; n1 jest liczbą szalek Petriego w pierwszym rozcieńczeniu; n2 jest liczbą szalek Petriego w drugim rozcieńczeniu; d jest czynnikiem rozcieńczenia odpowiadającym pierwszemu rozcieńczeniu. Przedstawienie wyników [0321] Obliczoną liczbę można przedstawić, jak w przykładzie powyżej, jako liczbę zaokrągloną do dwóch istotnych cyfr. [0322] Wyniki, które przedstawia się na zewnątrz, powinny być zawsze zaokrąglane. Przykład [0323] 19 184 zaokrągla się do 19 000 i przedstawia jako 1,9 x 10 4. [0324] 294 x 10 8 zaokrągla się do 290 x 10 8 i przedstawia jako 2,9 x 10 10. [0325] Dla liczby trzy cyfrowej, zaokrąglić trzecią cyfrę do najbliższego zera - jeśli trzecią cyfrą jest 5, a poprzednią cyfrą jest liczba parzysta, zaokrąglić liczbę do dołu. Jeśli poprzedzającą cyfrą jest liczba nieparzysta, zaokrąglić liczbę do góry. [0326] Przykład 28 500 zaokrągla się do 28 000, a [0327] 11 500 zaokrągla się do 12 000. Przykład 9: Badanie stabilności liofilizowanych kultur LD FI-Da N [0328] W przykładzie tym, dokonuje się porównania między stopniem zmiany podczas wytwarzania liofilizo- 27
wanych kultur (FD-DVS) z FI-Da-N, utworzonych z lub bez IMP, jako czynnika krioochronnego. W tych doświadczeniach stężenie IMP wynosiło 0% i 3% wag./wag. na gram skoncentrowanej biomasy. Dodawano dodatek do koncentratu jako 30% sterylny roztwór. [0329] Po fermentacji, zbierano biomasę i zagęszczono przez odwirowanie z bulionu fermentacyjnego z F1- Da N. Komórkowy koncentrat podzielono na dwie 300 gramowe porcje i do jednej z porcji dodano IMP. W celu symulacji sytuacji napotykanej w przemysłowych warunkach podczas procesu zamrażania, dodatki i koncentraty zmieszano i przechowywano przez 5 godzin w 8 o C, a następnie zamrożono w ciekłym azocie i dalej przechowywano w -50 o C przez 1 dzień przed liofilizacją. Po zakończeniu liofilizacji kulturę przechowywano w -50 o C do czasu analizy. Zamrożone kultury miały zawartość żywotnych bakterii co najmniej 10 10 jednostek tworzących kolonie (CFU) na g zamrożonego materiału. Aktywność kultur w mleku (mleko-lab) zmierzono po 7 dniach przechowywania w -50 o C. [0330] Wyniki pokazano na Figurze 6. [0331] Jest oczywiste, że liofilizowane DVS FI-Dn N bez dodatku IMP straciły więcej aktywności. Zmniejszenie stabilności równa się 0,25 jednostkom ph dla FI-Dn N po przechowywaniu przez 7 dni w -50 o C. 0,25 jednostek ph prawie równa się utracie 50% aktywności zakwaszania. Przykład 10; Badanie stabilności zamrożonych kultur LD z F-DVS FI-Da N z zastosowaniem innych związków włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych jako czynników krioochronnych [0332] W przykładzie tym opisano badanie stabilności zamrożonych kultur do bezpośredniego zaszczepiania F-DVS FI-Da N (Chr. Hansen A/S Pozycja ewidencyjna Nr 501691), wytworzonych z nukleotydami IMP lub GMP (guanozyno- 5 -monofosforan) lub nukleozydem, inozyną, jako czynnikiem krioochronnym. W doświadczeniach, stężenie IMP, GMP lub inozyny utrzymywano przy 3% wag./wag. na gram skoncentrowanej biomasy. IMP i GMP dodano do koncentratu jako 25% wag./wag. sterylny roztwór wodny, podczas gdy inozynę dodano w postaci suchego proszku. W przypadku inozyny do kultury dodano wodę w ilości równej ilości dodawanej w przypadku IMP lub GMP. [0333] Po fermentacji biomasę zbierano i zatężano przez wirowanie z bulionu fermentacyjnego z F-DVS FI-Da N. Koncentrat komórkowy podzielono na cztery porcje po 300 gramów każda i dodawano IMP, GMP, inozynę lub do jednej z porcji niczego nie dodawano. Dodatki i koncentraty mieszano przez 30 minut, zamrożono w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w 50 o C. Zamrożona kultura miała zawartość żywotnych bakterii co najmniej 10 10 jednostek tworzących kolonie (CFU) na g zamrożonego materiału. Aktywność kultur w mleku (mleko-lab) zmierzono tego samego dnia, gdy kultury zamrożono, a aktywność obserwowano okresowo aż do 13 dni. [0334] Na figurze 7 podsumowano profile stabilności dla F-DVS FI-Da N podane jako aktywność zakwaszania. [0335] Jest oczywiste, że F-DVS FI-Da N bez dodatków traci aktywność. Odnośnie do kultury stabilizowanej inozyną, obniżenie stabilności kultury bez dodanej inozyny jest równe 0,41 jednostki ph dla F-DVS FI-Da N po przechowywaniu przez 13 dni w -50 o C. 0,41 jednostki ph odpowiada 60% utracie aktywności zakwaszania. Podobnie, różnica w stabilności między kulturą F-DVS FI-Da N z lub bez dodanej GMP wynosi 0,31 jednostki ph, co odpowiada 50% utracie aktywności zakwaszania. Przykład 11: Badanie przedłużonej stabilności zamrożonych kultur LD z F-DVS FI-Da N z zastosowaniem różnych związków włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych, jako czynników krioochronnych 28
[0336] W przykładzie tym opisano badanie przedłużonej stabilności z zamrożonymi kulturami do bezpośredniego zaszczepiania F-DVS FI-Da N (Chr. Hansen A/S Pozycja Nr 501691), sformułowanymi albo z nukleotydami IMP lub GMP (guanozyno-5 -monofosforan) albo z nukleozydem, inozyną jako czynnikami kriochronnymi. Szczegóły doświadczalne były, jak opisane w Przykładzie 10, z wyjątkiem tego, że aktywność monitorowano przez wydłużony czas. [0337] Otrzymano profile stabilności dla F-DVS FI-Da N podane jako aktywność zakwaszająca. [0338] Okazuje się, że tendencję zaobserwowaną podczas początkowej fazy przechowywania F-DVS FI- Da N można przedłużyć do 21 lub nawet 49 dni. Również podczas przedłużonego przechowywania inozyna wydaje się być lepszym środkiem krioochronnym dla F-DVS Fi-Da N niż GMP, który znowu jest lepszy niż IMP. Co więcej, doświadczenie to pokazuje, że korzyść ze stosowania inozyny jako czynnika krioochronnego podczas fazy początkowej przechowywania także można rozciągnąć na sytuację przedłużonego przechowywania. Zatem, oczekuje się, że zastosowanie inozyny,jako czynnika krioochronnego da produkt ze zwiększoną więcej niż dwukrotnie aktywnością zakwaszania, nawet po przedłużonym przechowywaniu. [0339] Jest to ważny wynik, ponieważ średni okres póltrwania komercyjnych zamrożonych kultur wynosi 1 rok. Przykład 12: Wpływ różnych dodatków na stabilność liofilizowanych kultur- LD z FI-Da N [0340] W przykładzie tym opisano stabilność liofilizowanych kultur LD (FD-DVS) z FI-Da-N, utworzonych z lub bez pewnej liczby różnych dodatków, które mogą działać jako czynniki krioochronne. W doświadczeniach stężenie różnych dodatków wynosiło 3% wag./wag. na gram skoncentrowanej biomasy, jeśli nie wskazano inaczej. [0341] Po fermentacji, biomasę zbierano i zatężano przez wirowanie z bulionu fermentacyjnego z F1-Da N, jak opisano w Sekcji Materiały i Metody. Koncentrat komórkowy podzielono na pewną ilość porcji i dodawano do każdej porcji. W celu symulacji sytuacji spotykanych w warunkach przemysłowych podczas procesu zamrażania, dodatki i koncentraty zmieszano i przechowywano przez 5 godzin w 8 o C, a następnie zamrożono w ciekłym azocie i dalej przechowywano w -50 o C przez jeden dzień przed liofilizacją. Po zakończeniu liofilizacji kulturę przechowywano w -50 o C aż do analizy. Liofilizowane kultury miały zawartość żywotnych bakterii co najmniej 10 10 jednostek tworzących kolonie (CFU) na gram liofilizowanego materiału. Aktywność kultur w mleku (mleko-lab) zmierzono przez oznaczanie aktywności zakwaszania po 1 dniu i po 2 miesiącach przechowywania w -50 o C. [0342] Z doświadczenia wynika jasno, że różne dodatki mają bardzo różny wpływ na stabilność liofilizowanej kultury DVS FI-Dn N. Dodatkowo, doświadczenie to pokazuje, że dodatki, które okazały się optymalne w początkowej fazie przechowywania, niekoniecznie są optymalne w trakcie przedłużonego przechowywania. Jest to zilustrowane przez wpływ dodania do kultur 3% wag./wag. inozyny lub adenozyny. Przetestowane zaledwie po jednym dniu przechowywania w -50 o C, pokazują, że zarówno 3% wag/wag inozyny, jak i 3% wag/wag adenozyny jest wysoce skuteczne dla zapewnienia stabilności kultury, ale po 2 miesiącach przechowywania w -50 o C było jasne, że korzystne jest 3% wag/wag. CMP, UMP lub IMP. Nieoczekiwanie, wynik 2 miesięcznego doświadczenia ze stabilnością w 50 o C wskazuje, że adenozyna jest szkodliwa dla kultury. MSG (glutaminian jednosodowy), który jest dobrze znanym czynnikiem krioochronnym, (Font de Valdez, 1983) włączono do doświadczenia dla porównania. Ponadto, należy zauważyć, że stężenie mrówczanu Na wynosi ½ % wag./wag., ponieważ 3% wag./wag. jest szkodliwe dla zamrożonych kultur, patrz przykład 15 poniżej. 29
Przykład 13. Wpływ kombinacji dodatków na stabilność zamrożonych kultur L. bulgaricus, zamrażanych z szybkością zamrażania 1 o C na min. [0343] W przykładzie tym opisano wpływ dodania kombinacji dwóch potencjalnych czynników krioochronnych (IMP i inozyny) na aktywność wywołaną przez wytwarzanie zamrożonej kultury L. bulgaris. W przykładzie porównywano aktywność kultur z lub bez takiego dodatku. [0344] Kulturę L. bulgaricus hodowano w bulionie MRS (Difco) przez 12 godzin w 40 o C. Kulturę schłodzono do 12 o C, a ph kultury doprowadzono do 6. Po schłodzeniu, bakterie w schłodzonym bulionie zagęszczano 10-20-krotnie przez odwirowanie, dodano dodatki, a następnie wolno zamrożono w zamrażarce z kontrolowanym chłodzeniem zapewniającej szybkość chłodzenia około 1 o C na minutę aż do osiągnięcia -50 C. Kultury przechowywano w -50 o C do następnego dnia (około 18 godzin), zanim przeprowadzono próbę zakwaszania. Próbę zakwaszania przeprowadzono, jak opisano w rozdziale Materiały i Metody, za wyjątkiem, że próba była oparta się na 0,02 % wag./wag. inokulum i była przeprowadzona w 40 o C przez 5 godzin. [0345] W doświadczeniu 3% wag./wag. IMP i 2 % wag./wag. inozyny dodano jako środki krioochronne, wag/wag odnosi się do ciężaru dodatku na gram skoncentrowanej biomasy. IMP i inozynę dodawano do koncentratu jako roztwór wodny dający 13% zwiększenie objętości kultury. [0346] W doświadczeniu tym pokazano, że kombinacja dwóch dodatków według niniejszego wynalazku, w przypadku 3% wag./wag. IMP i 2% wag./wag. inozyny, sprawia, że kultura jest znacząco bardziej stabilna. Różnica w stabilności równa się 0,26 jednostki ph dla kultury L. bulgaricus po przechowywaniu przez 1 dzień w -50 o C. 0,26 jednostki ph jest prawie równe 50% różnicy w aktywności zakwaszania ( tj. stabilizowana kultura jest około 2-krotnie tak aktywna, jak kultura niestabilizowana). Ponadto, to doświadczenie pokazuje, że działanie krioochronne IMP i inozyny można także rozszerzyć, tak aby obejmowało kultury, które są powoli zamrażane. Przykład 14: Wpływ kombinacji dodatków na żywotność zamrożonej B. infantis [0347] W przykładzie tym zbadano wpływ kombinacji 3% wag./wag. IMP i 2% wag/.wag. inozyny na stabilność powoli zamrażanej Bifidobacterium infantis. [0348] Kulturę Bifidobacterium infantis hodowano na bulionie MRS (Difco). Kulturę chłodzono do 12 o C, a ph kultury doprowadzono do 6,0. Po ochłodzeniu, bakterię w fermentowanym bulionie zagęszczono 10-20- krotnie przez odwirowanie, dodano dodatki, a następnie kultury zamrażano albo szybko przez wkraplanie skoncentrowanej kultury do ciekłego azotu (kultura A) albo wolno przez schładzanie kultury w zamrażarce z kontrolowanym chłodzeniem zapewniającym szybkość chłodzenia około 1 o C na minutę, aż do osiągnięcia 50 o C (kultura B i C). Kultury przechowywano w 50 o C do następnego dnia (około 18 godzin) przed próbą żywotności (próba CFU) przeprowadzoną, jak opisano w Materiałach i Metodach. [0349] W tym doświadczeniu wykazano, że w porównaniu do szybko zamrażanej kultury Bifidobacterium infantis (kultura A), żywotność wolno zamrażanej kultury (B) jest znacząco zmniejszona. Co istotne, w doświadczeniu tym wskazano dalej, że jeśli kombinację dwóch dodatków według niniejszego wynalazku, w przypadku 3% wag./wag. IMP i 2% wag./wag. inozyny, dodano przed zamrażaniem (kultura C), wtedy ilość CFU powoli zamrażanej kultury była prawie identyczna, jak szybko zamrażanej kultury. [0350] Dochodzimy do wniosku, że kombinacja % wag./wag. IMP i 2% inozyny jest efektywna jako krioochronny dodatek dla B. infantis, które zamrożono powoli. Przykład 15: Wpływ różnych dodatków na stabilność zamrożonej kultury F-DVS CH-N 19 [0351] W przykładzie tym opisano stabilność zamrożonych kultur do bezpośredniego zaszczepienia (F- 30
DVS ) kultury CH-N 19 formułowanych z kilkoma różnymi dodatkami, które mogą działać jako krioochronne czynniki i bez dodatków. [0352] Po fermentacji, zbierano biomasę i zagęszczano przez odwirowanie z bulionu fermentacyjnego F- DVS CH-N 19. Koncentrat komórkowy podzielono na pewną ilość porcji i dodano różne dodatki. [0353] Dodatki i koncentraty mieszano przez 30 minut, wkraplając zamrażano w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w -50 o C. [0354] Aktywność kultury w mleku (mleko-lab) mierzono jako aktywność zakwaszania po 1 dniu i 6 dniach przechowywania w -50 o C. Próba aktywności opiera się na 0,005% wag./obj. inokulum i 6 godzinach inkubacji w 30 o C. [0355] Jak widać w przykładzie 12, także to doświadczenie wykazało, że różne dodatki mają bardzo różny wpływ na stabilność zamrożonej kultury. Interesujące jest, iż doświadczenie to pokazało, że zarówno adenozyna jak i adenozyno-5'-monofosforan są szkodliwe dla aktywności kultury. Doświadczenie to dostarczyło także dowodu, że 3% wag./wag. mrówczanna jest szkodliwy dla aktywności zamrożonych kultur. Przykład 16: Próba z dodatkiem IMP i inozyny (z przykładu 15) z CH-N 19 dodanych do wytwarzania sera Gouda 45+ Wytwarzanie Gouda 45+ w 150 kg serowych kadziach 1. Mleko [0356] Surowe mleko dostarczono z Mleczarni Borup, Dania, pasteryzowano je w ~72 o C przez 15 sekund (mleko naturalne, 76-78 o C przez 15 sek.), a następnie schłodzono do 5 o C. Zawartość białka prawidłowo była w zakresie od 3,4-3,7% białka. Otrzymane mleko analizowano na Mlekoskanerze (Foss Electric A/S, Hillerød, Dania) na % tłuszczu i białka. Zmierzono temperaturę mleka i pobrano próbkę do analizy bakteriologicznej. Mleko przechowywano w chłodni aż do zastosowania. 2. Standaryzacja [0357] Mleko do wytwarzania Gouda 45+ powinno mieć zawartość tłuszczu 3,00% (z zawartością białka 3,4%), co w końcowym serze będzie skutkowało ~45% tłuszczu w suchej masie. Stosunek tłuszczu do białka obliczono stosując standardowe w dziedzinie metody. Mleko serowe standaryzowano przez dodanie obliczonej ilości śmietany lub odtłuszczonego mleka. Po standaryzacji mleko podgrzewano w wymienniku ciepła do temperatury wstępnego dojrzewania 32 o C i wpompowano do kadzi serowych. Powolne wstrząsanie (235 obr./min.) kontynuowano aż do czasu, gdy podpuszczka zdyspergowała się w mleku. 3. CaCl 2 i saletra potasowa [0358] Saletrę potasową dodawano w stężeniu 0,020%, wynoszącym 30 g na 150 kg mleka. CaCl 2 dodano do mleka w ilości 0-20 g na 150 kg mleka z 34% roztworu, w razie potrzeby. 4. Kultura [0359] W tym doświadczeniu, wytworzono i porównywano 4 partie. W pierwszym zestawie partii, jedną partię zaszczepiano 0,005 % F-DVS CH-N 19 z IMP i inozyną, dodanymi przed zamrożeniem (partia 1B). Kulturę partii referencyjnej zaszczepiono 0,01% F-DVS CH-N 19 bez IMP i inozyny (partia 1A). Drugi zestaw partii zaszczepiono 0,005% F-DVS CH-N 19 z IMP i inozyną, dodanymi przed zamrożeniem (partia 2B). Partię referencyjną zaszczepiono 0,01% F-DVS CH-N 19 bez dodanych IMP i inozyny (partia 2A). Przed dodaniem podpuszczki, kulturę pozostawiano do wzrostu przez 35 min. w 32 o C. 5. Podpuszczka [0360] Podpuszczkę CHY-MAX Plus (200 IMCU/ml) dodano w ilości 0,022% wag./wag. (30,0 g na 150 kg). 31
Podpuszczkę rozcieńczano przed użyciem w jej 3-krotnej objętości czystej, zimnej wody z kranu. Mieszanie (235 obr./min.) kontynuowano nie dłużej niż przez 1 min. po dodaniu podpuszczki i mieszadło usunięto z kadzi. Wydaje się, że mleko ścięło się po 35 min. po dodaniu podpuszczki. Wytwarzanie Gouda 45+ [0361] Krzepnięcie mleka zazwyczaj trwa 30-45min. Skrzep pocięto za pomocą krajalnicy ramowej z 5 mm między strunami. Krajalnica ramowa najpierw poruszała się poziomo od końca do końca, po czym poruszała się pionowo od końca do końca w serowej kadzi. Następnie skrzep pocięto pionowo od brzegu do brzegu 3 razy w dół brzegów kadzi do czasu otrzymania 5 mm kostek. Na tym etapie skrzep traktowano bardzo ostrożnie, aby uniknąć strat serwatki. Mieszadło wprowadzono z powrotem do kadzi i skrzep powoli wstępnie wymieszano (350 obr./min) przez 15-20 min. Po 15-20 min. odciągnięto 45 kg serwatki i mieszadło dostosowano do szybszego poziomu mieszania przez 20 min (415 obr./min.). Dogrzewanie rozpoczynano przez podnoszenie temperatury do 38 o C w pierwszym zestawie partii i 40 o C w drugim zestawie partii w ciągu 20 min. Wymagano powolnego, stałego i kontrolowanego wzrostu temperatury. Po osiągnięciu 38 o C lub 40 o C przeprowadzono mieszanie z 85 minutowym całkowitym mieszaniem (oznaczające 35-45 min. w 38 o C lub 40 o C). 6. Prasowanie [0362] Po 95 min. mieszania usunięto mieszadło i pozostawiono do osadzenia się skrzepu w kadzi. Następnie skrzep rozbito i wstępnie sprasowano stosując prasę do prasowania wstępnego i cylindry hydrauliczne, aby zastosować do skrzepu ciśnienie 2,5 bara przez 30 min. Po wstępnym prasowaniu skrzep pocięto na dwa bloki. Bloki sera umieszczono w odpowiednich formach (30 x 30 cm) z tą samą stroną na dół, jak podczas wstępnego prasowania. Następnie formy umieszczono w jednostce prasującej i prasowano przez 20 min. przy 2 barach i następnie przez 1-2 godzin w 4-6 barach. Po zakończeniu prasowania, mierzono wysokość sera, sery ważono, oznaczano i badano ph. Na koniec, sery przechowywano w formach aż do osiągnięcia ph 5,7, a potem przeszły bezpośrednio do solenia w solance. 7. Solenie [0363] Solenie przeprowadzono przez 20-24 godziny w solance z 20% NaCl + 0,25% CaCl 2, w temperaturze 10-12 o C do osiągnięcia zawartości soli około 1,7% w końcowych serach. Ważne było, aby sery były właściwie oddzielone i zanurzone podczas solenia w solance, aby otrzymać żądaną zawartość soli. Po posoleniu sery suszono przez 1-2 godziny przed zapakowaniem. 8. Pakowanie [0364] Przed zapakowaniem sery opryskano Natamycyną (300 ppm w wodzie), następnie zapakowano pod ciśnieniem w plastikowe torebki Cryovac (BK1L) i włożono do twardych plastikowych pudełek (30 x 30 cm). Po zapakowaniu pudełka przechowywano w 14 oc przez 4 tygodnie, a potem przechowywano w 5-8 o C. Warunki hodowania Partia 1: A) Kultura Doświadczalna F-DVS CH-N 19 z IMP i dodaną inozyną. Temperatura dogrzewania 38 C. Szczepienie 0,005%. 32
[0365] Traktowa-nie Partia nr CH-N19 z IMP i inozyną 1B Czas Temperatura Szybkość mieszania ph Miano Ustalony Fakty- Ustalona Fakty- Ustalona Faktyczna na czny na czna na Dodane mleko Dodana saletra potasowa 09:30 32,0 235 6,64 09:35 Dodana kultura 9:45 Dodane dodatki 10:15 Dodana podpuszczka 10:20 6,55 Krojenie 10:55 Wstępne mieszanie 11:00 350 Bez Serwatki 11:20 32,0 6,53 0,14 Średnie mieszanie 11:25 390 Dogrzewanie 11:35 6,52 0,14 Start/ mieszanie Koniec dogrzewania 11:50 38,0 390 6,51 0,15 Koniec mieszania 12:30 6,48 0,16 Prasowanie 12:35 wstępne Koniec wstępnego 13:05 6,34 0,17 praso- wania Wypełnianie 13:10 form Prasowanie 1 13:15 Prasowanie 2 13:45 Prasowanie 3 15:15 Koniec prasowania 15:15 ph po 6 godzinach 15:45 5,75 W wodzie 16:00 W Solance 17:15 Solanka: 21% NaCl, ph 5,2, temp:11,5 C 5,48 Bez Solanki 15:45 22,5 godz. Prasowanie wstępne 2,5 bara 30 min ph po 30 godzinach 5,21 B.) Kultura Referencyjna F-DVS CH-N 19 bez IMP i dodanej inozyny Temperatura dogrzewania 38 C, Szczepienie 0,01% 33
[0366] Partia nr Odniesienie CHN 19 1A Czas Temperatura Szybkość mieszania ph Miano Ustalony na Faktyczny Ustalona na Faktyczna Ustalona na Faktyczna Dodane 09:00 32,0 235 6,63 mleko Dodana 09:05 saletra potasowa Dodana 09:15 kultura Dodane 09:45 dodatki Dodana 09:50 6,57 podpuszczka Krojenie 10:25 Wstępne mieszanie 10:30 350 Bez serwatki 10:50 32,0 6,53 0,15 Średnie mieszanie 10:55 390 Dogrzewanie 11:05 6,52 0,15 Start/miesza nie Koniec dogrzewania 11:20 38,0 390 6,52 0,15 Koniec mieszania 12:00 6,51 0,16 Wstępne 12:05 prasowanie Koniec 12:35 6,41 0,17 wstępnego prasowania Wypełnianie 12:40 form Prasowanie 12:45 1 Prasowanie 13:15 2 Prasowanie 14:45 3 Koniec prasowania 14:45 ph po 6 godzinach 15:15 5,92 W wodzie 15:30 W Solance 16:45 Solanka: 21% NaCl, ph 5,2, temp:11,5 C 5,70 Bez Solanki 15:15 22,5 godz. Wstępne prasowanie 2,5 bara 30 min. ph po 30 godzinach 5,20 34
Partia 2: EP 1 644 481 B1 A.) Kultura Doświadczalna F-DVS CH-N 19 z dodanym IMP i inozyną. Temperatura dogrzewania 40 C. Szczepienie 0,005% [0367] Traktowanie Partia nr CH-N19 z IMP i inozyną 2B Czas Temperatura Szybkość mieszania ph Miano Ustalony Fakty- Ustalona na Fakty- Ustalona Faktyczna na czny czna na Dodane 08:30 32,0 235 6,63 mleko Dodana 08:35 saletra potasowa Dodana 8:45 kultura Dodane 9:15 dodatki Dodana 9:20 6,54 podpuszczka Krojenie 9:55 Wstępne mieszanie 10:00 350 Bez Serwatki 10:20 32,0 6,52 0,14 Średnie mieszanie 10:25 390 Dogrzewanie 10:35 6,52 0,15 Start/ mieszanie Koniec 10:50 40,0 390 6,50 0,15 dogrzewania Koniec mieszania 11:30 6,47 0,16 Prasowanie 11:35 wstępne Koniec 12:05 6,36 0,16 wstępnego prasowania Wypełnianie 12:10 form Prasowanie 12:15 1 Prasowanie 12:45 2 Prasowanie 14:15 3 Koniec prasowania 14:15 ph po 6 godzinach 14:45 6,02 W wodzie 16:00 W Solance 19:00 5,60 Bez Solanki 17:30 22,5godz. Wstępne prasowanie 2,5 bara 30 min 35
ph po 30 godzinach 5,22 B.) B.) Kultura Referencyjna F-DVS CH-N 19 bez IMP i dodanej Inozyny Temperatura pasteryzowania 40 C, Szczepienie 0,01% [0368] Traktowanie Odniesienia CHN: 19 Partia nr 2A Czas Temperatura Szybkość mieszania ph Miano Ustalony na Faktyczny Ustalona na Faktyczna Ustalona na Faktyczna Dodane 08:00 32,0 235 6,60 mleko Dodana 08:05 saletra potasowa Dodana 08:15 kultura Dodane 08:45 dodatki Dodana 08:50 6,54 podpuszczka Krojenie 9:25 Wstępne mieszanie 09:30 350 Bez Serwatki 09:50 32,0 6,54 0,14 Średnie mieszanie 09:55 390 Dogrzewanie 10:05 6,53 0,14 Start/miesza nie Koniec 10:20 40,0 390 6,51 0,14 dogrzewania Koniec mieszania 11:30 6,49 0,15 Prasowanie 11:05 wstępne Koniec 11:35 6,41 0,16 wstępnego prasowania Wypełnianie 11:40 form Prasowanie 11:45 1 Prasowanie 12:15 2 Prasowanie 13:45 3 Koniec prasowania 13:45 ph po 6 godzinach 14:15 6,24 W wodzie 15:30 W Solance 19:00 Solanka: 21% NaCl, ph 5,2, temp:11,5 C 5,84 Bez Solanki 17:30 22,5godz. Wstępne prasowanie 2,5 bara 30 min 36
ph po 30 godzinach 5,32 Wyniki: [0369] Sery oceniono po 8 tygodniach. Przeprowadzono analizęchemiczną, aby upewnić się, że ser spełnia wymagania tego rodzaju sera (wilgotność, sól, tłuszcz) mającego 4 tygodnie. Ocenę sensoryczną sera przeprowadzono również dla upewnienia się, że ma on właściwe ukształtowanie oczek, teksturę i smak. [0370] Produkty serowe analizowano dalej pod kątem następujących wad: [0371] 1.) Wady zewnętrzne: (forma, skórka, kolor, zapach). [0372] 2.) Wady wewnętrzne (kolor,struktura, konsystencja). [0373] Wady w zapachu i smaku. [0374] Partie następnie oceniano w punktach stosując jedną z następujących liczb: 0, 3, 6, 8, 9, 10, 11, 12 lub 13. Wynik 13 jest najlepszy. Partie 1 [0375] 1A. Odnośnik. Vat 406 F-DVS CHN-19. Temperatura dogrzewania 38 o C. Formowanie oczek było dobre, 11. Zapach był dobry, przyjemny i prawidłowy, opinia 11. Smak był taki, jak wymagany dla Gouda, bardzo dobry, 11 (maślany, lekko gorzkawy, słonawy i orzechowy). [0376] 1B.) Vat 407 F-DVS CHN-19 dodane IMP i inozyna. Temperatura dogrzewania 38 o C. Formowanie oczek było dobre, 11. Zapach był dobry, przyjemny i prawidłowy, opinia 11. Smak był taki, jak wymagany dla Gouda, bardzo dobry, 11 (maślany, lekko gorzkawy, słonawy i orzechowy). Nie dostrzeżono żadnych różnic w serach z powodu istniejącej kultury i wykrywano testowaną kulturę. Partie 2 [0377] 2A.) Odnośnik. Vat 404 F-DVS CHN-19. Temperatura dogrzewania 40 o C. Nie miał całkiem wymaganego uformowania oczka; oczka były za małe, opinia 9. Zapach był dobry, przyjemny i prawidłowy, opinia 11. Smak był jak wymagany u Gouda, być może, trochę za słony, ale bardzo dobry, 11. [0378] 2B.) Vat 405. F-DVS CHN-19 z IMP i inozyną. Temperatura dogrzewania 38 o C. formowanie oczek trochę lepsze niż u innych, lecz ciągle wymagamy większych dziur, 10. Zapach był dobry, przyjemny i prawidłowy, opinia 11. Smak był taki, jak wymagany dla Gouda, być może trochę za słony, ale bardzo dobry, 11. Nie dostrzeżono żadnych różnic w serach z powodu istniejącej kultury i wykrywano testowaną kulturę. Przykład 17: Próba z dodatkiem IMP i inozyny do F-DVS R-604 do wytwarzania sera Cheddar Standardowa instrukcja do wytwarzania sera Cheddar w 150 kg kadziach serowych [0379] Cheddar jest jednym z najpowszechniej wytwarzanych serów. Początkowo był wytwarzany tylko w UK, ale obecnie jest wytwarzany na całym świecie, głównie w Australii, Kanadzie, Irlandii, Nowej Zelandii i 37
USA. Główne zasady wytwarzania sera Cheddar pozostają takie same we wszystkich krajach z niewielkimi tylko modyfikacjami. [0380] Kolor może oscylować od jasnokremowego do ciemnożółtego. W pewnych przypadkach dodaje się Annatto, aby otrzymać pomarańczowy/czerwony kolor. Tekstura jest twarda i ścisła, a ser nie kruszy się podczas krojenia. Większość sera Cheddar sprzedaje się, gdy dojrzewał przez 3-5 miesięcy i jest bardzo łagodny. Dobrze dojrzały Cheddar ma posmak orzechowy z charakterystyczną ostrością i jest najbardziej dojrzały po 9-12 miesiącach. [0381] W procedurze tej opisano tradycyjną procedurę wytwarzania sera Cheddar i służy ona do określenia wpływu krioochronny z IMP i inozyną na inokulum kultury. 3. Mleko [0382] Mleko zamawiano w Mleczarni Borup (Dania) i dostarczano jako mleko surowe, które pasteryzowano w temperaturze około 72 o C (162 F) przez 15 sekund, a następnie schładzano do około 30-32 o C. Gdy pożądany jest barwiony Cheddar dodaje się 475-600 ml Annatto A320WS Chr. Hansen s na 5000 mleka. Przygotowuje się równoległe partie kultury dla porównania wpływu krioochrony w obecności IMP i inozyny na F-DVS R-604. 4. Kultura [0383] Kulturę kontrolną F-DVS R-604 poddaną krioochronie bez IMP i inozyny (Partia 1) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 750 g/5000 litrów kultury. Kulturę testową F-DVS R-604 poddaną kroochronie z IMP i inozyną (Partia 2) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 500g/5000 litrów kultury. 5. Podpuszczka [0384] Podpuszczkę proszkową Extra CHY-MAX dodaje się do każdej partii w ilości 2,5-3 g na 100 l mleka. Po dodaniu podpuszczki w ciągu 30-45 minut będzie tworzył się żel. 6. Wytwarzanie sera Cheddar [0385] Dla każdej testowanej partii postępuje się możliwie dokładnie według procedury. Skrzep kroi się na małe kostki 5 x 5 mm. Następnie temperaturę podnosi się do około 38-40 o C w ciągu 40-50 min. Skrzep i serwatkę miesza się przez 30-50 minut w zależności od wymaganej zawartości wilgoci. 7. Cheddaryzacja [0386] Skrzep i serwatkę oddziela się i skrzep pozostawia do zmięknięcia. Następnie skrzep jest Cheddarowany. Zmiękczony skrzep kroi się na bloki, które obraca się co 10-15 minut. Gdy zakwaszenie serwatki z bloków osiągnie ph 5,5-5,6, skrzep rozdrabnia się. Rozdrabnianie obejmuje krojenie dużych bloków skrzepu na kawałki wielkości palca. 8. Solenie [0387] Do skrzepu dodaje się około 2% soli, uzyskując końcowe stężenie soli w serze 1,6-1,8% (Sól o wilgotności 4,5-5%). 9. Pakowanie [0388] Formowanie i prasowanie ma miejsce w wieży pod częściową próżnią z ostrym mechanicznym prasowaniem. Ser formuje się w bloki 20 kg i pakuje próżniowo w plastikowe torby. Ser dojrzewa w 7-10 C przez 3-12 miesięcy w zależności od wymaganego smaku (tj. łagodny lub dojrzały). Wniosek [0389] Ser Cheddar wyprodukowany z każdej partii będzie porównywany pod względem smaku, tekstury i innych cech jakościowych w celu określenia czy zastosowane inokulum kriochronionego IMP i inozyną 38
wpływa na końcowy produkt - ser Cheddar. Inokulum zawierające mieszaninę IMP i inozyny wytworzy praktycznie tej samej jakości ser jak inokulum niezawierające mieszaniny IMP i inozyny. Kolejną zaletą wynalazku jest to, że może być zastosowana zmniejszona ilość skoncentrowanego inokulum, jeśli inokulum zawiera domieszkę IMP i inozyny. Przykład 18. Próba z dodaniem IMP i inozyny do F-DVS ST-M3 w celu wytworzenia Serka wiejskiego Instrukcja standardowa do wytwarzania serka wiejskiego w 150 kg kadziach serowych [0390] Serek wiejski jest bardzo popularnym w UK i USA niskotłuszczowym, miękkim serem dla dbających o wagę. Zwykły serek wiejski jest bardzo mdły,dlatego jest popularne przyprawianie produktu przez dodanie szczypiorku, cebulki, itp. Zastosowano dwa sposoby wytwarzania serka wiejskiego : metodę krótkiego krzepnięcia i metodę długiego krzepnięcia. Szczegóły obu udostępniono. W sekcji piątej opisano metodę krótkiego krzepnięcia, po której bezpośrednio opisano metodę długiego krzepnięcia. 1. Mleko [0391] Mleko zamawiano z mleczarni Borup (Dania) i dostarczano jako surowe mleko, które pasteryzowano w około 72 C (162 F) przez 15 sek., a następnie schładzano do około 34 C. 2. Kultura [0392] W metodzie krótkiego krzepnięcia, krioochronną kulturę kontrolną F-DVS ST-M3 bez IMP i inozyny (Partia 1) dodawano jako inokulum w stężeniu około 2500 g/5000 litrów kultury. Krioochronną kulturę testową F-DVS ST-M3 z IMP i inozyną (Partia 2) dodawano jako inokulum w stężeniu około 2000g/5000 litrów kultury. 3. Podpuszczka [0393] Podpuszczkę Proszkową Ekstra CHY-MAX dodaje się do każdej partii w ilości 0,2-0,5 g na 5000 l mleka. 4. Wytwarzanie Serka wiejskiego [0394] Następującą procedurę przeprowadza się możliwie dokładnie dla każdej testowanej partii. Mleko inkubuje się przez 4,5-5 godzin, aż do czasu osiągnięcia ph 4,65-4,8. Skrzep kroi się na gładkie kostki około 12 mm. Skrzep leżakuje przez 10-15 minut. Skrzep miesza się bardzo ostrożnie, a dogrzewanie rozpoczyna się w temperaturze 55-58 C, co osiąga się w 60-75 minut. Gdy skrzep jest wystarczająco mocny, serwatkę usuwa się przez odciekanie. Następnie skrzep przemywa sie i odsącza trzy razy jak następuje: [0395] Po pierwsze, przemywa się wodą (13-15 C) dla obniżenia temperatury skrzepu do 29-32 C. Po drugie, przemywa się wodą (13-15 C) dla obniżenia temperatury skrzepu do 18 C. Ostatecznie, przemywa się wodą (2-5 C) dla obniżenia temperatury skrzepu do 2-5 C. Po ostatecznym odcieknięciu, skrzep gotowy jest do zmieszania ze słodką lub hodowaną przyprawą. Przyprawy mogą być zrobione z różnych połączeń śmietany, mleka i odtłuszczonego mleka w proszku. 5. Metoda długiego krzepnięcia [0396] Proces jest podobny do tego, jaki można zastosować w przypadku metody krótkiego krzepnięcia, z wyjątkiem zatężania kultury inokulum, temperatury inkubacji i czasu inkubacji. Dla metody długiego krzepnięcia, krioochronną kulturę kontrolną F-DVS ST-M3, bez IMP i inozyny (Partia 1) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 500g/5000 litrów kultury. Kulturę testową F-DVS ST-M3 krioochronioną IMP i inozyną (Partia 2) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 300g/5000 litrów kultury. Mniejsze stężenie inokulum i temperatura inkubacji 20-22 C powoduje dłuższy czas inkubacji, potrzebny do osiągnięcia żądanego końcowego ph, co zajmie zwykle 14-18 godzin. 39
Podsumowanie (Wnioski końcowe) [0397] Serek wiejski produkowany z każdej partii zostanie porównany pod względem smaku, tekstury i innych cech jakościowych, aby ocenić czy użycie krioochronnego inokulum z IMP i inozyną wpływa na końcowy produkt - Serek wiejski. Inokulum zawierające mieszaninę IMP i inozyny wytworzy ser praktycznie tej samej jakości co inokulum bez mieszaniny IMP i inozyny. Kolejną zaletą wynalazku jest to, że można zastosować zmniejszoną ilość skoncentrowanego inokulum, jeśli zawiera ono domieszkę IMP i inozyny. Przykład 19. Próba z dodaniem IMP i inozyny do F-DVS ST-M3 do produkcji sera Mozzarella/Pizza Instrukcja standardowa do produkcji sera Mozzarella/Pizza w 150 kg kadziach serowych [0398] Tego rodzaju ser Mozzarella jest najczęściej używany jako ser do Pizzy. Ponieważ jest twardszy niż Miękki Ser Mozzarella, jest łatwiejszy do starcia. Istnieje wiele rodzajów sera Mozzarella, które mają różne zawartości wody i tłuszczu w suchej masie. Część odtłuszczonej, mało wilgotnej Mozzarelli zazwyczaj stosuje się jako Ser do Pizzy. Skrzep najczęściej jest fermentowany do ph 5,0-5,2, zanim skrzep zmiesza się z gorącą wodą i rozciąga. Wybór kultury ma zasadniczy wpływ na właściwości Sera do Pizzy (tzn. rozciągliwość, możliwość przypiekania, topliwość i zdolność do wytapiania tłuszczu). 1. Mleko [0399] Mleko zamawiano w Mleczarni Borup (Dania) i dostarczano jako mleko surowe, które pasteryzowano w temperaturze około 72 C (162 F) przez 15 sekund i następnie schładzano do około 36-38 C. 2. Kultura [0400] Krioochronną kulturę testową F-DVS ST-M3 bez IMP i inozyny (Partia 1) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 750g/5000 litrów kultury. Krioochronną kulturę testową F-DVS ST-M3 z IMP i inozyną (Partia 2) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 500g/5000 litrów kultury. Kulturę inkubuje się przez 30-45 minut w 35-38 C. 3. Podpuszczka [0401] Podpuszczkę CHY-MAX Proszek Extra dodaje sie do każdej partii w ilości 1-3 g na 100 l mleka. 4. Wytwarzanie sera Mozzarella [0402] Następującą procedurę przeprowadza się możliwie dokładnie dla każdej testowanej partii. Skrzep kroi się na kostki 5-8 mm i pozostawia go do zasklepienia przez 5 minut. Następnie temperaturę podnosi się do 40-43 C przez 15-20 minut w trakcie mieszania. Następnie ser traktuje się stosując metodę krzepnięcia Cheddaru, gdzie cała serwatka jest usunięta przez odcieknięcie, skrzep krojony jest na bloki i obracany w trakcie fermentacji. Rozdrabnianie skrzepu przeprowadza się przy ph 5-5,25. Gdy uzyskuje się wymagane ph, ser umieszcza się w maszynie do rozciągania i miesza z gorącą wodą, 75-80 C. Proces zabierze około 10-15 minut, a temperatura utwardzania osiąga w przybliżeniu 58-65 C. Rozciągnięty ser formuje się i natychmiast schładza w chłodnej wodzie do 5-10 C, co kończy dalsze zakwaszanie. Zalać ser nasyconą solą solanką w temperaturze 10 C lub niższej. [0403] Wytworzony z każdej partii ser Mozzarella/Pizza zostanie porównany pod względem smaku, tekstury i innych cech jakościowych, aby ocenić czy zastosowanie krioodpornego inokulum z IMP i inozyną wpływa na końcowy produkt - ser Mozzarella/Pizza. Inokulum zawierające mieszaninę IMP i inozyny będzie produkowało praktycznie tej samej jakości ser co inokulum bez mieszaniny IMP i inozyny. Kolejną zaletą wynalazku jest to, że można użyć zmniejszoną ilość skoncentrowanego inokulum, gdy inokulum zawiera mieszaninę IMP i inozyny. 40
Przykład 20. Próba z dodaniem IMP i inozyny do F-DVS CH-N 11 do produkcji sera Maasdammer Instrukcja standardowa do produkcji sera Maasdammer w 150 kg kadziach serowych [0404] Ser Maasdammer jest szwajcarskim rodzajem sera, nazwanym od nazwy rzeki Maas w Holandii. Ser ma ukształtowane stosunkowo duże oczka, jak również łagodny i orzechowy smak, spowodowany dodaniem bakterii kwasu propionowego. 1. Mleko [0405] Mleko zamawiano w Mleczarni Borup (Dania) i dostarczano jako mleko surowe, które pasteryzowano w temperaturze około 72 C (162 F) przez 15 sekund lub traktowano ciepłem w temperaturze 65-70 C przez 20 sekund, a następnie schładzano do około 30-32 C. 2. Kultura [0406] Krioochronną kulturę kontrolną F-DVS CH-N 11 bez IMP i inozyny (Partia 1) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 750g/5000 litrów kultury. Krioochronną kulturę testową F-DVS CH N 11 z IMP i inozyną (Partia 2) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 500g/5000 litrów kultury. Kulturę inkubuje się przez 10-40 minut w 32 C. 3. Podpuszczka [0407] Podpuszczkę CHY-MAX Proszek Extra dodaje się do każdej partii w ilości 1-3 g na 100 l mleka. 4. Wytwarzanie sera Maasdammer [0408] Żel zostanie uformowany w około 30-45 minut. Koagulat kroi się na 5-7 mm kostki, a skrzep miesza się wolno przez 15-25 minut. Około 35-45% serwatki usuwa się przez odcieknięcie, a skrzep miesza się wolno przez 15 minut. Dodaje się około 15-20% (objętość początkowa) gorącej wody o około 60 C. Temperatura skrzepu wynosi około 35-38 C, i skrzep miesza się przez około 30-45 minut. Większość serwatki usuwa się przez odcieknięcie, a skrzep lekko prasuje się pod 2-4 kg/cm 2 z pozostałą serwatką przez 15-30 minut. Skrzep kroi się na odpowiedniej wielkości bloki, które przystosowane są do form. Formy są lekko dociskane przez 20 minut, po czym następuje prasowanie pod 4-6 kg/ cm 2 przez 1-2 godzin. Bloki skrzepu wrzuca się bezpośrednio do zimnej solanki przy ph 5,6-5,7, a stężenie docelowe soli w serze wynosi 1-1,5 %. [0409] Wyprodukowany z każdej partii ser Maasdammer będzie porównywany pod względem smaku, tekstury i innych cech jakościowych, aby ocenić, czy zastosowanie krioochronnego inokulum z IMP i inozyną wpływa na końcowy produkt - ser Maasdammer. Inokulum zawierające mieszaninę IMP i inozyny wytworzy praktycznie tej samej jakości ser co inokulum bez mieszaniny IMP i inozyny. Kolejną zaletą wynalazku jest to, że można użyć zmniejszoną ilość skoncentrowanego inokulum, jeśli inokulum zawiera domieszkę IMP i inozyny. Przykład 21. Próba z dodaniem IMP i inozyny do F-DVS CHN- 12 do produkcji sera Brie/Camembert Instrukcja standardowa do produkcji sera Brie/Camembert w 150 kg kadziach serowych. [0410] Stabilizowany Brie/Camembert różni się od Tradycyjnego Brie/Camembert tym, że zmiękczanie rdzenia sera nie zależy tak bardzo od czasu, ponieważ min. ph, pod koniec wytwarzania skrzepu, wynosi 4,9-5,4 w porównaniu z 4,6-4,8 dla Tradycyjnego Brie/Camembert. Białe pleśnie są używane do nadania serowi jego charakterystycznej białej powierzchni i smaku. Występują dwa podstawowe sposoby stabilizowania ph sera: [0411] 1) Stabilizowanie - Przemywanie skrzepu, tzn. usuwanie laktozy i w ten sposób obniżanie ilości cukru dostępnego do przemiany na kwas mlekowy. Pomaga to w osiągnięciu wymaganego wysokiego ph. Dla 41
Stabilizowanego Brie/Camembert stosuje się zarówno mezofilne jak i termofilne kultury, zwykle 30% mezofilnych i 70% termofilnych. [0412] 2.) Solubilizacja - Zahamowanie startera, gdy ph jest bliskie wymaganego poziomu, np. przez solenie lub schładzanie. Ten rodzaj przeprowadza się tylko z kulturami termofilnymi, gdyż są one bardziej wrażliwe na niższe temperatury niż kultury mezofilne. 1. Mleko [0413] Mleko zamawiano z mleczarni Borup (Dania) i dostarczano jako surowe mleko, które pasteryzowano w około 72 C (162 F) przez 15 sek., a następnie ochładzano do około 35-37 C. 2. Kultura [0414] Krioochronną kulturę kontrolną F-DVS CHN-12 bez IMP i inozyny (Partia 1) dodaje się jako inokulum w stężeniu około 250 g/5000 litrów kultury. Krioochronną testową kulturę F-DVS CHN-12 z IMP i inozyną (Partia 2) dodaje sie jako inokulum w stężeniu około 200g/5000 litrów kultury. Do formy wprowadza się 3-5 jednostek ciekłej PCa 1, PCa3 lub PCa FD na 1000 litrów oraz 0,5-1 jednostki GEO CD 1. 3. Podpuszczka [0415] Podpuszczkę CHY-Max Proszek Ekstra dodaje się do każdej partii w ilości 2,5-3 g na 100 l mleka. 4. Wytwarzanie sera Brie/Camembert [0416] Żel uformuje się w około 30-45 minut. Koagulat kroi się na 10 mm kostki, a 40% serwatki usuwa się przez odciekanie. Dodawana jest ta sama objętość wody w około 40-45 C. Kulturę pozostawia się na 30-50 minut do odstania z delikatnym mieszaniem od czasu do czasu. Skrzep przelewa się z kadzi do formy, a forma jest obracana po raz pierwszy po jednej godzinie,, obracana po raz drugi po trzech godzinach i obracana po raz trzeci po ośmiu godzinach. Skrzep usuwany jest z formy i zanurzany w 18% solance. Skrzep spryskuje się 1-2 jedn. PCa 1, PCa 3 lub PCa FD na 100 kg sera. Ser dojrzewa w 14-15 C i 85% względnej wilgotności przez 1 dzień, następnie w 12 C w 95% względnej wilgotności przez 8-10 dni. Gdy wzrost pleśni jest zadawalający, osusza się powierzchnię sera, pakuje się i przechowuje w 4 C. Każdy ser pakuje się w tłuszczo odporny papier i umieszcza w kartonie lub pudełku z chipem. [0417] Wyprodukowany ser Brie/Camembert z każdej partii będzie porównywany pod względem smaku, tekstury i innych cech jakościowych, aby ocenić czy zastosowanie krioochronnego inokulum z IMP i inozyną wpływa na końcowy produkt, ser Brie/Camembert. Inokulum zawierające mieszaninę IMP i inozyny wyprodukuje praktycznie tej samej jakości ser co inokulum bez mieszaniny IMP i inozyny. Kolejną zaletą wynalazku jest to, że można zastosować zmniejszoną ilość skoncentrowanego inokulum, jeśli zawiera ono domieszkę IMP i inozyny. Przykład 22 Próba z dodaniem IMP i inozyny do DVS FD-N do produkcji Maślanki kulturowanej w 3 litrowej skali Maślanka Kulturowana Proponowana receptura Wstępne traktowanie [0418] Wysokiej jakości, standaryzowane, homogenizowane mleko z 0,5% tłuszczu wstępnie traktowano pasteryzując w 90 C przez 20 min. w kadzi. [0419] 3% IMP wag./wag. i 2 % inozyny dodaje się jako stabilizatory do skoncentrowanej kultury DVS FD-N, której mieszanina zostaje następnie zamrożona. Nazwą zamrożonego produktu jest obecnie F-DVS FD-N 42
.[0420] Kultury F-DVS FD-N zamrożono bez IMP i inozyny dla celów kontroli. Wszystkie kultury F-DVS przechowywano przed użyciem przez dwa miesiące w -50 C. [0421] Skoncentrowane kultury (DVS FD-N) zawierające IMP i inozynę używano do szczepienia mleka w stężeniu 0,005%, a mleko było kulturowane w temperaturze 25 C do ph około 4,5 w 3 litrowym fermentorze. Kultury kontrolne F-DVS FD-N, zamrożone bez IMP i inozyny, zostały użyte do zaszczepiania mleka w stężeniu 0,01 %, a do mleka dodano kulturę w temperaturze 25 C do ph w przybliżeniu 4,5 w 3-litrowym fermentorze. Test nr Kultura Ilość inokulanta Czas fermentacji Do ph 1 FD-N z IMP i Inozyną 0,005% 15½ 4,51 2 FD-N bez IMP i inozyny 0,01% 15½ 4,51 Późniejsza obróbka [0422] Gdy ph osiągnęło 4,51, produkt najpierw mieszany był w wiadrze z ręcznym mieszadłem, a następnie przez 1 min pod napięciem 55, mikserem Ystral. Po mieszaniu, wiadro umieszczano w łaźni chłodzącej i schładzano do 18 C w trakcie okresowego mieszania mikserem ręcznym. Produkt następnie przelewany był do butelek i przechowywany w 8 C. Wyniki: [0423] Maślankę z kulturą testowano na właściwy smak w dniach 1 i 8: Dzień 1: FD-N z IMP i inozyną: Świeży, niskie CO 2, dobry zapach FD-N bez IMP i inozyny: Świeży, niskie CO 2, dobry zapach Dzień 8 FD-N z IMP i inozyną: Świeży, niskie CO 2, dobry zapach FD-N bez IMP i inozyny: Wyjątkowy smak, świeży, niskie CO 2, dobry zapach [0424] Stosowano ten sam czas fermentacji i ph dla inokulum 0,005% F-DVS FD-N z dodanymi IMP i inozyną, porównano z inokulum 0,01% F-DVS bez IMP i inozyny. Dodatek IMP i inozyny nie wywoływał żadnej zmiany w lepkości lub zapachu/smaku maślanki kulturowanej. [0425] Okazało się, że ilość materiału do szczepienia może być zmniejszona do połowy, jeśli mieszaninę IMP i inozyny dodano do materiału do szczepienia, w porównaniu z materiałem do szczepienia bez IMP i inozyny. Podobny pod względem jakości ser, w zakresie smaku i tekstury produkowany był z użyciem doświadczalnego inokulum lub kontrolnego inokulum. 43
ODNOŚNIKI Zastrzeżenia 1. Zamrożona lub liofilizowana kultura, która zawiera jeden lub więcej czynników krio ochronnych wybranych z grupy składającej się z jednego lub więcej związków włączonych w biosyntezę kwasów nukleinowych lub jednej lub więcej pochodnych jakichkolwiek takich związków; i w których jeden lub więcej czynników krioochronnych jest wybranych z grupy składającej się z zasad purynowych, zasad pirymidynowych, nukleozydów i nukleotydów i, w których kultura obejmuje od 0,1% do około 20% czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników krioochronnych mierzonych jako % wag./wag. zamrożonego materiału; lub w przypadku, w którym kultura jest kulturą liofilizowaną czynnik krioochronny lub mieszanina czynników krioochronnych są obecne w ilości 0,8% do 55% wagowych i, w których kultura zawiera jeden lub więcej organizmów wybranych z grupy składającej się z Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp. Propionibacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., lub Corynebacterium spp. 2. Kultura według zastrzeżenia 1, w której jednym lub więcej czynnikami krioochronnymi jest nukleotyd. 3. 3. Kultura według zastrzeżenia 1, w której jeden lub więcej czynników krioochronnych jest wybranych z grupy nukleotydów pirymidynowych i inozyny. 4. Kultura według zastrzeżenia 3, w której jeden lub więcej czynników krioochronnych jest wybranych z grupy składającej się z IMP, UMP i CMP. 44
5. Kultura według zastrzeżenia 3, w której czynnik krioochronny obejmuje inozyno-5 monofosforan (IMP) i inozynę. 6. Kultura według zastrzeżenia 3, w której czynnikiem krioochronnym jest inozyno-5 -monofosforan (IMP). 7. Kultura według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-6, w której jeden lub więcej krioochronnych czynnik jest czynnikiem lub mieszaniną czynników, które, oprócz właściwości krioochronnych, mają działanie wzmacniacza. 8. Kultura według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, która obejmuje od około 2% do około 5% czynnika krioochronnego lub mieszaniny czynników mierzonych jako % wag./wag. zamrożonego materiału. 9. Kultura według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, która jest zliofilizowana. 10. Kultura według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, która jest kulturą starterową. 11. Kultura według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, która obejmuje jeden lub więcej organizmów mezofilnych mających optymalne temperatury wzrostu około 30 C. 12. Kultura według zastrzeżenia 11, która obejmuje jeden lub więcej organizmów mezofilnych wybranych z grupy zawierającej Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei i Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. 13. Kultura według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 lub 9-10, która obejmuje jeden lub więcej organizmów termofilnych mających optymalne temperatury wzrostu około 35 C do około 45 C. 14. Kultura, według zastrzeżenia 13, która obejmuje jeden lub więcej organizmów termofilnych wybranych z grupy zawierającej Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i Lactobacillus acidophilus. 15. Kultura według zastrzeżenia 1, w której organizmem jest Lactococcus spp., który obejmuje jeden lub więcej Lactococcus lactis subsp.lactis i Lactococcus lactis subsp. cremoris. 16. Kultura według zastrzeżenia 1, w której organizmem jest Lactobacillus spp, obejmujący Lactobacillus acidophilus. 17. Sposób wytwarzania zamrożonej kultury według zastrzeżenia 1, obejmujący następujące etapy: 1) dodawanie krioochronnego czynnika wybranego z czynnika jak określono w zastrzeżeniu 1 do skoncentrowanej kultury żywych organizmów, jak określono w zastrzeżeniu 1, 2) zamrażanie materiału do otrzymania zamrożonego materiału z ilością krioochronnego czynnika lub mieszaniny czynników, jak określono w zastrzeżeniu 1, i 3) pakowanie zamrożonego materiału w odpowiedni sposób. 18. Sposób wytwarzania liofilizowanych kultur, według zastrzeżenia 1, obejmujący następujące etapy: 1) dodawanie krioochronnego czynnika wybranego z czynnika jak określono w zastrzeżeniu 1 do skoncentrowanej kultury żywych organizmów, jak określono w zastrzeżeniu 1, 2) zamrażanie materiału do otrzymania zamrożonego materiału, 3) sublimacja wody z zamrożonego materiału dla otrzymania liofilizowanego materiału z ilością krioochronnego czynnika lub mieszaniny czynników, jak określono w zastrzeżeniu 1, i 45
4) pakowanie zamrożonego materiału w odpowiedni sposób. 19. Sposób według zastrzeżenia 17, w którym organizmem jest Lactococcus spp., obejmujący jeden lub więcej Lactococcus lactis subsp.lactis i Lactococcus lactis subsp. cremoris. 20. Sposób według zastrzeżenia 17, w którym organizmem jest Lactobacillus spp. obejmujący Lactobacillus acidophilus. 21. Sposób według zastrzeżenia 18, w którym organizmem jest Lactococcus spp obejmujący jeden lub więcej Lactococcus lactis subsp.lactis i Lactococcus lactis subsp. cremoris. 22. Sposób według zastrzeżenia 18 w którym organizmem jest Lactobacillus spp., obejmujący Lactobacillus acidophilus. 23. Sposób wytwarzania produktu żywnościowego z kulturą obejmujący kulturowanie materiału prekursora z kulturą według któregokolwiek zastrzeżenia 1-16, i otrzymywanie kulturowanego produktu żywnościowego. 24. Sposób z zastrzeżenia 23, w którym kulturowany produkt żywnościowy wytwarzany jest z mleczarskiego materiału prekursora. 25. Sposób z zastrzeżenia 24, w którym kulturowanym produktem żywnościowym jest maślanka. 26. Sposób z zastrzeżenia 24, w którym kulturowanym produktem żywnościowym jest ser wybrany z Cheddar, Gouda, Cottage, Emmental, Grana, Mozzarella/Pizza, Maasdammer i stabilizowany Brie lub Camembert. 46
47
48
49
50
51
52
53
ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Lista przytoczonych przez zgłaszającego odnośników ma na uwadze jedynie wygodę czytelnika. Nie stanowi ona części Europejskiego dokumentu patentowego. Mimo, że zestawienie było wykonane z dużą starannością, nie można wykluczyć błędów lub pominięć i EUP nie bierze za nie żadnej odpowiedzialności. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 54