(12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) 159844 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 273721 ( 2) Data zgłoszenia: 14.07.1988 (51) IntCl.5: C12N 15/51 A61K 37/02 C12P 21/02 Sposób wytwarzania polipeptydu o własnościach antygenowych rejonu pre S1 otoczki wi- (54) rusa zapalenia wątroby typu B (43) Zgłoszenie ogłoszono: 22.01.1990 BU P 02/90 (73) Uprawniony z patentu: Polska Akademia Nauk, Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych, Łódź, PL Akademia Medyczna, Łódź, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.01.1993 W UP 01/93 (72) Twórcy wynalazku: Andrzej Płucienniczak, Łódź, PL Bogdan Uznański, Łódź, PL Małgorzata Sidorkiewicz, Łódź, PL Adam Nowosławski, Warszawa, PL Wojciech J. Stec, Łódź, PL Grażyna Płucienniczak, Łódź, PL Piotr Guga, Łódź, PL Maria Koziołkiewicz, Łódź, PL Andrzej Okruszek, Łódź, PL Andrzej Wilk, Łódź, PL PL 159844 B1 1. Sposób wytwarzania polipeptydu o (57) własnościach antygenowych rejonu pre S 1 otoczki wirusa zapalenia w ątroby typu B, znamienny tym, że hoduje się kom órki gospodarza bakteryjnego transform ow ane zrekombinow anym w ektorem ekspresyjnym zaw ierającym sekwencję DNA o wzorze (X)a-(Y)b-(Z)c, w którym a = 1, b = 2-15, c = 1, X oznacza sekwencję: 5' A A TTC A A TA A G 3', Y oznacza sekwencję: 5' A A TC C G C TG G G TTTCTTC - C C G G A TC A C C A G C TG G A TCCGGCTTT- T G G TG C TA AC TC TA A CAACCCGGAT- T G G G A TTTC A A C C C G A A TA A G 3', a Z oznacza sekwencję: 5' A A TCCGCTG TA A T- C T A G A TTG C C G C C A G TTCCGCTG G C G - GCATTTTA 3' kodującą aminokwasy 20-49 rejonu pre S 1, w postaci zwielokrotnionej, składającej się co najm niej z dw óch kopii, wyodrębnia się polipeptyd z hodowli i w razie potrzeby oddziela się białko nośnikow e. fig. 1

SPOSÓB WYTWARZANIA POLIPEPTYDU O WŁASNOŚCIACH ANTYGENOWYCH REJONU PRE S1 OTOCZKI WIRUSA ZAPALENIA WĄTROBY TYPU B Z a s t r z e ż e n i a p a t e n t o w e 1. Sposób wytwarzania polipeptydu o własnościach antygenowych rejonu pre S1 otoczki wirusa zapalenia wątroby typu B, z n a m i e n n y t y m, że hoduje się komórki gospodarza bakteryjnego transformowane zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA o wzorze (X)a- (Y) b- (Z)c, w którym a = 1, b = 2-1 5, c = 1, X oznacza sekwencję: 5 ' AATTCAATAAG 3 ', Y oznacza sekwencję: 5 ' AATCCGCTGGGTTTCTTCCCGGATCACCAGCTGGATCCGGCTTTTGGTGCTAAC TCTAACAACCCGGA- TTGGGATTTCAACCCGAATAAG 3 ', a Z oznacza sekwencję: 5 ' AATCCGCTGTAATCTAGATTGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTA 3 ' kodująca aminokwasy 20-49 rejonu pre S 1, w postaci zwielokrotnionej, składającej się co najmniej z dwóch kopii, wyodrębnia się polipeptyd z hodowli i w razie potrzeby, oddziela się białko nośnikowe. 2. Sposób według zastrz. 1, z n a m i e n n y t y m, że stosuje się wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą białko nośnikowe. * * * Przedmiotem wynalazku j est sposób wytwarzania polipeptydu o własnościach antygenowych rejonu pre S1 otoczki wirusa zapalenia wątroby typu B HBV. Wirusowe zapalenie wątroby typu B (żółtaczka zakaźna, wszczepienna) jest chorobą szeroko rozpowszechnioną na świecie, a jej przebieg i skutki stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia i życia. Dotyczy to w szczególności przewlekłych zakazeń HBV przebiegających pod postacią agresywnego zapalenia, prowadzących najczęściej do rozwoju marskości, a następnie raka pierwotnego wątroby. Szczególnie poważne zagrożenie stanowi ta choroba w krajach o niskim standardzie sanitarnym. Jednocześnie dotychczas produkowane szczepionki, wytwarzane z surowic nosicieli HBV, mimo udowodnionej skuteczności, nie są szeroko stosowane ze względu na ich wysoką cenę przewyż szającą roczne nakłady na opiekę zdrowotną na jednego mieszkańca wielu krajów rozwijających się. W tej sytuacji próby wytworzenia skutecznej, bezpiecznej i taniej szczepionki uodparniającej przeciw HBV oraz białka o własnościach antygenowych są w pełni uzasadnione. Prowadzone są obecnie liczne prace związane z wytwarzaniem - np. na drodze inżynierii genetycznej lub syntezy chemicznej z aminokwasów - polipeptydów o własnościach antygenowych wirusa HBV, które mogłyby stanowić podstawowy składnik testów diagnostycznych służących do wykrywania infekcji wirusowej oraz składnik szczepionki przeciw HBV. Znany jest sposób otrzymywania na drodze syntezy chemicznej, polegający na łączeniu aminokwasów, polipeptydu o sekwencji identycznej z częścią białka rejonu pre S1 otoczki wirusa HBV, składającego się z aminokwasów 21-47. Polipeptyd ten wiązany jest silnie przez receptory hepatocytów dla HBV oraz wykazuje zdolności indukowania przeciwciał neutralizujących natywne cząstki wirusa Neurath A. R., Kent S. B. H., Strick N., Parker K., 1986 Cell, 46, 429-4 3 6. Syntezy chemiczne polipeptydów z aminokwasów są jednak bardzo drogie i nie nadają się do stosowania przemysłowego, a ponadto ograniczają długość otrzymywanych łańcuchów peptydowych.

159 844 3 Znane są także sposoby otrzymywania białek całej otoczki wirusa HBV lub białek rejonu pre S1 metodami inżynierii genetycznej, przez wyodrębnianie fragmentu DNA kodującego to białko z cząsteczki wirusa, wprowadzenie DNA za pomocą wektora ekspresyjnego do komórek bakteryjnych, hodowanie transformowanych komórek i wyodrębnianie białka. Te znane metody pozwalają na uzyskanie polipeptydu o własnościach antygenowych z niewielką wydajnością, wynoszącą kilka µg z 1 litra hodowli [Kozłowskaya T., Pumpen P. (1986) M ol. Biol. USSR, 20, 8 8 4 /9 0 1]. Ponadto, wspomniane metody wymagają posługiwania się patogennym materiałem. Sposobem według wynalazku wytwarza się polipeptyd o własnościach antygenowych, zawierający aminokwasy 20-49 rejonu pre S1 otoczki wirusa HBV, w postaci zwielokrotnionej, składającej się co najmniej z dwu kopii, z dużą wydajnością wynoszącą około 40 mg z 1 litra hodowli bakteryjnej. Sposób według wynalazku polega na tym, że transformuje się komórki gospodarza bakteryjnego zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA o wzorze (X ) a-(y)b-( Z )c, w którym a = 1, b = 2-15, c = 1, X oznacza sekwencję: 5 ' AATTCAATAAG 3 ', Y oznacza sekwencję: 5 ' AATCCGCTGGGTTTCTTCCCGGATCACCAGCTGGATCCGGCTTTTGGTGCTAAC TCTAACAACCCGGATTGGGATTTCAACCCGAATAAG 3 ', a Z oznacza sekwencję: 5' AATCCGCTGTAATCTAGATTGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTA 3 ' kodującą aminokwasy 20-49 rejonu pre S1, w postaci zwielokrotnionej, składającej się co najmniej z dwu kopii, wyodrębnia się polipeptyd z hodowli i, w razie potrzeby, oddziela się białko nośnikowe. Syntetyczny DNA różni się od znanych sekwencji wirusa HBV, jednakże koduje właściwą sekwencję aminokwasów i umożliwia zwielokrotnienie sekwencji kodującej aminokwasy 2 0-49 rejonu pre S1 wirusa. Otrzymanie antygenu poliwalentnego, składającego się np. z 4 kopii 30 aminokwasowej sekwencji, połączonych wiązaniami peptydowymi, t j. zawierającego 120 aminokwasów nie jest możliwe na drodze syntezy chemicznej. Antygen poliwalentny lepiej indukuje powstawanie przeciwciał n i ż pojedynczy polipeptyd. Stosowaną w sposobie według wynalazku sekwencję DNA otrzymuje się z oligonukleotydowych odcinków, które łączy się enzymatycznie w dwuniciowy łańcuch DNA. Oligonukleotydowe odcinki syntetyzuje się chemicznie przez kolejne łączenie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Funkcje aminowe zasad nukleinowych korzystnie blokuje się za pomocą grupy izopropoksyscetylowej co umożliwia uzyskanie dużej ilości czystych odcinków, stanowiących części sekwencji DNA kodującej antygen rejonu pre S1. Otrzymanie dużej ilości chemicznie czystych odcinków pozwala z kolei zastosować szybką metodę ich łą czenia enzymatycznego za pomocą ligazy, po uprzednim fosforylowaniu z użyciem kinazy polinukleotydowej. Metoda ta polega na jednoczesnym łączeniu enzymatycznym, w jednej mieszaninie reakcyjnej, wszystkich oligonukleotydowych odcinków DNA niezbędnych do wytworzenia fragmentu DNA kodującego antygen pre S1. Daje to możliwość otrzymania fragmentu DNA kodującego antygen pre S1 w krótkim czasie i to bez użycia izotopów radioaktywnych do detekcji otrzymanego fragmentu. Otrzymaną sekwencję DNA liguje się z wektorem plazmidowym przeciętym odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi. Jako wektory stosować można plazmidy pbr322, puc19, pur222.

4 159 844 Selekcję genetyczną zrekombinowanych klonów można prowadzić przy użyciu bakterii E.c o li, takich jak JM83, JH10 1, JM105 i podobne. W celu zwielokrotnienia fragmentu DNA kodującego aminokwasy 2 0-49 rejonu pre S1, otrzymany zrekombinowany wektor plazmidowy trawi się odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i powtórnie liguje uzyskując klony zawierające co najmniej jedno powtórzenie, tzn. co najmniej dwie kopie sekwencji DNA kodującej 30 aminokwasów rejonu pre S1. Korzystnie uzyskuje się 2-15 kopii. W celu uzyskania biosyntezy białka, wektor plazmidowy zawierający sekwencję DNA kodującą aminokwasy 2 0-49 rejonu pre S1 lub jej wielokrotności składającą się co najmniej z dwu kopii trawi się enzymami restrykcyjnymi i wycięty fragment DNA wprowadza się w odpowiednie miejsca restrykcyjne do wektora ekspresyjnego, trawionego enzymem restrykcyjnym wybranym do trawienia plazmidu. Zrekombinowanym wektorem transformuje się bakterie, takie jak HB101, DH5, etc. Polipeptyd wytworzony przy pomocy zrekombinowanego wektora skonstruowanego sposobem według wynalazku posiada własności antygenowe wystarczające do wykrycia przeciwciał anty-hbv w surowicy chorych. Ponadto, zrekombinowany wektor można stosować do wytwarzania sondy zawierającej DNA i RNA, służącej do wykrywania genów wirusa HBV. Na załączonych rysunkach: Fig. 1 przedstawia konstrukcję syntetycznego fragmentu DNA kodującego 30 aminokwasów rejonu pre S1 wirusa HBV. 1. A. - sekwencja zsyntetyzowanego fragmentu DNA o długości 150 par nukleotydów z zaznaczeniem: sposobu połączenia ze sobą syntetycznych oligonukleotydów, sekwencji kodującej 30 aminokwasów z rejonu pre S1 /podkreślona część sekwencji nukleotydów/ i miejsc rozpoznawanych przez nukleazy restrykcyjne EcoRI, HinfI i HindI I I. 1. B. - sekwencja zasad azotowych dwudziestu oligonukleotydów wchodzących w skład dolnej i górnej nici fragmentu DNA. 1. C. - sekwencja nukleotydów górnej nici DNA z wyodrębnionymi kodonami i odpowiadającymi im aminokwasami: n = 2-15. Fig. 2 przedstawia elektroforetyczny obraz mieszaniny ligacyjnej na 10 % żelu poliakryloamidowym trawionej nukleazami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I /ścieżka 3/, fragment DNA kodujący 30 aminokwasów rejonu pre S1 zaznaczono strzałką. Wzorce długości fragmentu DNA: ścieżka 1 - fragment o długości 160 par nukleotydów: ścieżka 2 - DNA plazmidu pbr322 trawiony nukleazą restrykcyjną BspRI: ścieżka 4 - wielokrotności 172 par nukleotydów pochodzące z satelitarnego DNA małpy zielonej, trawionego nukleazą restrykcyjną HindI I I. Fig. 3 przedstawia elektroforetyczny obraz wyizolowanego fragmentu DNA kodującego 30 aminokwasów rejonu pre S1 o długości 150 par nukleotydów /ścieżka 2 /. Wzorce - wielkorotności 172 par nukleotydów pochodzące z satelitarnego DNA małpy zielonej trawionego nukleazą restrykcyjną HindI I I /ścieżka 2 /. Rozdział prowadzono na 10 % żelu poliakryloamidowym, stosunek bis: akrylamid = 1 : 59. Fig. 4 przedstawia rozdział elektroforetyczny 10 wybranych plazmidów po klonowaniu syntetycznego fragmentu DNA kodującego 30 aminokwasów rejonu pre S1, trawionych nukleazami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I. Skrajne ścieżki - wzorce długości DNA, wielokrotności 172 par nukleotydów /patrz fig. 3/. Fig. 5 przedstawia autoradiogram żelu sekwencyjnego obejmującego fragment sekwencji DNA rejonu pre S1 w pozycjach A. 20-110 i B. 8 2-114. Fig. 5 przedstawia rozdział elektroforetyczny plazmidów trawionych nukleazami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I, zawierających zwielokrotnione fragmenty kodujące kolejność 30 aminokwasów rejonu pre S1. Obserwuje się trzy rodzaje

159 844 5 wstawek zawierających trzy powtórzenia kodującego fragmentu DNA ścieżki 2 i 3, cztery powtórzenia ścieżka 4 i pięć powtórzeń (ścieżka 5), o długości odpowiednio: 330, 420 i 510 par nukleotydów. Wzorzec długości DNA - wielokrotności 172 par nukleotydów, ścieżka 1. Warunki elektroforezy - patrz fig. 3. F ig. 7 przedstawia rozdział elektroforetyczny plazmidów zawierających różne wielokrotności fragmentu kodującego 30 aminokwasów rejonu pre S1, trawionych enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I (ścieżka 2, 4 i 6) oraz HinfI (ścieżki 3, 5 i 7 ). Plazmid zawierający 3 powtórzenia fragmentu kodującego - ścieżki 6 i 7, cztery powtórzenia - ścieżki 4 i 5, pięć powtórzeń - ścieżki 2 i 3. Charakteryzowane plazmidy zawierają wstawki o różnej długości (ścież k i 2, 4 i 6 ). Wstawki te jednakże po trawieniu nukleazą restrykcyjną HinfI dają fragmenty DNA o jednakowej długości. Zwielokrotniony fragment HinfI -HinfI zaznaczono strzałką. Warunki elektroforezy - patrz fig. 3. Fig. 8 przedstawia schemat konstrukcji plazmidu zawierającego sekwencje zasad azotowych kodujące poliwalentny antygen pre S1 HBV. Niżej podany przykład wyjaśnia bliżej wynalazek nie ograniczając jego zakresu. P r z y k ł a d. Na fig. 1. B pokazano zestaw odcinków oligonukleotydo wych, które otrzymano na drodze chemicznej syntezy metodą amidofosforynową, z wykorzystaniem grup izopropoksyacetylowych do blokowania funkcji egzoami nowych 5-dimetoksy trietylonukleozydo-3(β-cyjanoetylo)-n-(bisizopropylo)amidofosforynów. Przedstawiono także sposób ich ułożenia, warunkujący po ich enzymatycznym połączeniu powstanie fragmentu DNA kodującego 30 aminokwasów polipeptydu z rejonu pre S1 HBV (aminokwasy 20-49 tego rejonu, fig. 1. C). Zsyntetyzowany fragment DNA zawiera także sekwencje zasad azotowych pozwalające na jego zwielokrotnienie w wektorze ekspresyjnym oraz sekwencje, które dają możliwość umieszczenia zwielokrotnionego fragmentu w wektorze ekspresyjnym. Sekwencje umożliwiające zwielokrotnienie fragmentu (GAATC, współrzędne 11-15 i 101-105, f ig. 1. A) są rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną HinfI. Sekwencje, za pomocą których zwielokrotniony fragment można umieścić w wektorach przeciętych nukleazami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I, znajdują się odpowiednio na lewym i prawym końcu fragmentu (f i g. 1. A). Enzymatyczne łączenie syntetycznych odcinków DNA. Oczyszczone po chemicznej syntezie oligodezoksyrybonukleotydy rozpuszczono w buforze o składzie 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 7,6 tak, aby stężenie w roztworze każdego fragmentu wynosiło 200 µg/ml. Pierwszym etapem była fosforylacja końców 5 'syntetycznych odcinków. W celu jej przeprowadzenia syntetyczne odcinki stanowią- ce nić górną (fig. 1. A i 1. C) zebrano w jednej mieszaninie reakcyjnej, biorąc po 1 µg każdego oligonukleotydu (po 5 µl roztworu każdego fragmentu). Następnie do mieszaniny dodano 1/10 objętości buforu o składzie 0, 5 M Tris-HCl, ph 7,6, 50 mm HgCl2, 50 mmβ -merkaptoetanolu, 10 mm ATP i 5 j ednostek enzymu, kinazy polinukleotydowej. Mieszaninę reakcyjną o podanym składzie inkubowano przez 4 godziny w 37 C. Fosforylację odcinków DNA tworzących dolną nić przeprowadzono analogicznie. Po fosforylowaniu odcinki dolnej i górnej nici połączono w jednej probówce i podgrzewano przez 5 minut w temperaturze 65 C, następnie schłodzono je powoli (około 30 minut) do temperatury pokojowej, dodano jedną jednostkę enzymu, ligazy faga T4 i inkubowano przez noc w temperaturze 10 C.

6 159 844 Mieszaninę ligacyjną poddano trawieniu nukleazami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I oraz elektroforezie w 10 % żelu poliakryloamidowym. Otrzymano obraz świadczący o powstaniu fragmentu DNA o długości 150 par nukleotydów (fig. 2). Fragment ten wyizolowano z żelu poliakryloamidowego (fig. 3), po czym ligowano z wektorem plazmidowym puc19 [Yanish-Perron G., Vieira J., Messing J. (1985) Gene, 33, 103-119], który uprzednio trawiono nukleazami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I, i klonowano w bakteriach E.c o li JM101 [Messing J. (1979) Recombinant DNA Technical B ulletin, NIH Publication No 7 9-99, 2, 43-481 ]. Po transformacji z dziesięciu wybranych przypadków kolonii bakteryjnych wyizolowano plazmidy, które trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindI I I. Z przeprowadzonej analizy wynika, że 9 kolonii bakteryjnych posiadało plazmid ze wstawką o długości 150 par nukleotydów (fig. 4). Fragment o długości 150 par nukleotydów wyizolowano z żelu poliakryloamidowego i określono jego sekwencję nukleotydową metodą Maxama i Gilberta [Maxam A. M., Gilbert W. ( 1960) Methods in Enzymology, 65, 499-560 ] potwierdzając zgodność otrzymanej sekwencji ( f i g. 5). W celu zwielokrotnienia kodującego fragmentu DNA, wyizolowany z plazmidu fragment DNA o długości 150 par nukleotydów poddano trawieniu nukleazą restrykcyjną HinfI. Otrzymane fragmenty Hinf-Hinf ligowano ze sobą. Mieszaninę ligacyjną połączono z fragmentem EcoR I-HindI I I ( 150 par nukleotydów), trawionym częściowo nukleazą restrykcyjną H in fi, ligowano i klonowano przy użyciu wektora plazmidowego puc19 w bakteriach E.coli DH5 [Hanahan D. "DNA cloning" v. 1, ed. by Glover D. M., IRL Press, Oxford-Washington]. W wyniku tego klonowania otrzymano bakterie zawierające plazmidy z trzema, czterema i pięcioma powtórzeniami fragmentu DNA kodującego 30 aminokwasów rejonu pre S1 o długościach wstawek odpowiednio 330, 420 i 510 par nukleotydów (f i g. 6). W celu porównania ilo ści fragmentu Hinf-Hinf o długości 90 par nukleotydów w tych plazmidach trawiono je nukleazą restrykcyjną HinfI. Oddzielnie przeprowadzono podwójne trawienie nukleazami restrykcyjnymi HindI I I i EcoRI. Wynik tych trawień stanowi dowód na to, że charakteryzowane plazmidy rzeczywiście zawierają wielokrotność kodującego fragmentu DNA (fig. 7 ). fig. 8

159 844 fig. 7 fig. 6

159 844 fig. 5 fig. 4

159 844 fig.3 fig. 2

159 844 fig. 1 Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł