1. Lista publikacji wchodzących w skład rozprawy a) Toma A, Widłak W, Vydra N (2012) Rola czynnika transkrypcyjnego HSF1 w procesie nowotworzenia. Postępy Biologii Komórki 39(2):269 288 b) Vydra N, Toma A, Widlak W (2014) Pleiotropic role of HSF1 in neoplastic transformation. Current Cancer Drug Targets 14:144-155 c) Vydra N, Toma A, Glowala-Kosinska M, Gogler-Piglowska A, Widlak W (2013) Overexpression of heat shock transcription factor 1 enhances the resistance of melanoma cells to doxorubicin and paclitaxel. BMC Cancer 13:504-515 d) Toma-Jonik A, Widlak W, Korfanty J, Cichon T, Smolarczyk R, Gogler-Piglowska A, Widlak P, Vydra N (2015) Active heat shock transcription factor 1 supports migration of the melanoma cells via vinculin downregulation. Cellular Signalling 27(2):394-401 e) Toma A, Cichon T, Smolarczyk R, Widlak W, Vydra N (2012) Heat Shock Transcription Factor 1 (HSF1) enhances mobility of mouse melanoma B16(F10) cells. EACR 22-22 Biennial Congress of The European Association for Cancer Research (From Basic Research to Personalised Cancer Treatment), 7-10 lipiec 2012, Barcelona streszczenie zamieszczone w European Journal of Cancer 48(5):S54 S55 2. Streszczenie rozprawy w języku polskim 2.1 Wprowadzenie Niniejsza rozprawa doktorska powstała w oparciu o cztery tematycznie powiązane artykuły opublikowane w latach 2012-2015. Dwa z nich to artykuły przeglądowe omawiające znaczenie czynnika transkrypcyjnego HSF1 w powstawaniu i progresji nowotworu. Pozostałe dwie to prace eksperymentalne dotyczące wpływu HSF1 na zjawisko chemooporności wielolekowej oraz na procesy migracji i przerzutowania komórek czerniaka. Czynnik transkrypcyjny HSF1 (ang. Heat Shock Factor 1) jest jednym z kluczowych regulatorów homeostazy komórkowej. Jest on aktywowany pod wpływem stresu środowiskowego (między innymi przez obniżenie ph, reaktywne formy tlenu, metale ciężkie oraz podwyższoną temperaturę), wywołując w komórce syntezę białek szoku cieplnego HSP (ang. Heat Shock Proteins). Białka HSP jako molekularne opiekunki stanowią ważny 5
czynnik cytoprotekcyjny, chroniąc inne białka przed utratą ich prawidłowej konformacji i zapobiegając apoptozie (Toma i wsp., 2012, Vydra i wsp., 2014). Oprócz HSF1 do rodziny czynników transkrypcyjnych HSF zaliczane są również HSF2, HSF3, HSF4, HSF5, HSFX i HSFy. Ich regulacja przebiega w odmienny sposób, dlatego też różnie wpływają na ekspresję genów. W komórkach prawidłowych, w warunkach fizjologicznych HSF1 znajduje się w cytoplazmie w postaci nieaktywnego monomeru. W trakcie aktywacji HSF1 ulega trimeryzacji, fosforylacji i translokacji do jądra komórkowego, gdzie wiąże się ze swoją sekwencją docelową HSE (ang. Heat Shock Element), aktywując ekspresję genów (Toma i wsp., 2012, Vydra i wsp., 2014). W budowie HSF1 wyróżniono kilka domen. Na końcu aminowym białka znajduje się domena wiążąca DNA. Dalej zlokalizowane są regiony umożliwiające monomeryzację oraz homotrimeryzację cząsteczek HSF1. W środkowej części białka znajduje się domena regulatorowa, która zawiera ulegające fosforylacji reszty serynowe, co wpływa na aktywność domeny transaktywacyjnej, znajdującej się na końcu karboksylowym białka. Oddziałuje ona z białkami kompleksu inicjacyjnego w warunkach stresu komórkowego, stymulując zarówno inicjację transkrypcji jak i elongację (Toma i wsp., 2012, Vydra i wsp., 2014). W wielu typach nowotworów HSF1 i HSP ulegają zwiększonej ekspresji. Gen HSF1 nie ma charakteru klasycznego onkogenu, czy też supresora wzrostu nowotworowego, jednak jego aktywność wpływa na wiele aspektów metabolizmu komórkowego istotnych dla fenotypu nowotworowego. HSF1 może wspierać transformację nowotworową, a także ułatwiać przetrwanie komórek zmienionych nowotworowo, modulując ścieżki sygnałowe związane ze wzrostem i proliferacją, apoptozą, metabolizmem glukozy oraz ruchliwością. HSF1 może promować niestabilność genetyczną przez unikanie punktów kontrolnych cyklu komórkowego. Nie bez znaczenia pozostaje również związek HSF1 ze zjawiskiem oporności wielolekowej. W badaniach funkcjonalnych udowodniono, że komórki ze zwiększoną ekspresją HSF1 wykazywały obniżoną akumulację chemioterapeutyków w wyniku ich zwiększonego wyrzutu. Modulacja ekspresji genu oporności wielolekowej MDR1 (ang. Multi Drug Resistance 1) w tych komórkach zachodzi prawdopodobnie na poziomie posttranskrypcyjnym, co powoduje powstanie chemoopornego fenotypu (Toma i wsp., 2012, Vydra i wsp., 2014). 6
Celem dwóch prac eksperymentalnych wchodzących w skład rozprawy było zbadanie wpływu HSF1 na rozwój potencjału tumorogennego komórek nowotworowych, a w szczególności ustalenie wpływu HSF1 na zdolność komórek nowotworowych do wzrostu niezależnego od podłoża, migracji in vitro, wzrostu i tworzenia przerzutów in vivo. Ponadto w toku przeprowadzonych badań skupiono się również na określeniu wpływu HSF1 na przeżywalność komórek nowotworowych, traktowanych czynnikami cytotoksycznymi w warunkach in vitro oraz na zdolności komórek do ich aktywnego usuwania. 2.2 Streszczenie prac eksperymentalnych Model badawczy skonstruowano w oparciu o linie komórkowe czerniaka mysiego B16F10 oraz czerniaka ludzkiego 1205Lu i WM793B. Linia 1205Lu wyizolowana została z przerzutu do płuc w myszy bezgrasicznej i wywodzi się z linii WM793B. Za pomocą Retrowirusowego Transferu Genów w liniach 1205Lu i WM793B uzyskano stabilną nadekspresję konstytutywnie aktywnego HSF1 (ahsf1 z usuniętą domeną regulatorową), formy Dominant Negative (HSF1-DN z usuniętą domeną transaktywacyjną) oraz pełnej formy ludzkiego HSF1 (hhsf1). Linia B16F10 została zmodyfikowana za pomocą stabilnej transfekcji lipofektaminą. Ponadto w linii mysiej obniżono ekspresję endogennego HSF1 przy użyciu techniki RNAi. W badaniach in vivo wykorzystano wsobny szczep myszy C57BL/6Crl. Wyprowadzone linie komórkowe scharakteryzowano pod względem ekspresji genów zależnych od HSF1 (za pomocą techniki RT-PCR oraz Western Blot). Nadekspresja konstytutywnie aktywnego HSF1 (ahsf1) oraz pełnej formy (hhsf1) indukuje ekspresję genów HSP już w temperaturze fizjologicznej (37 C). Natomiast obniżenie ekspresji HSF1 oraz forma HSF1-DN wydajnie blokują aktywację genów HSP w warunkach stresu termicznego (43 C) (Vydra i wsp., 2013). Prawidłowe działanie modelu badawczego zweryfikowano również za pomocą funkcjonalnego testu termotolerancji, wykazując cytoprotekcyjny wpływ ahsf1 w warunkach ostrego szoku termicznego (Toma-Jonik i wsp., 2015). W pierwszym etapie badań funkcjonalnych zbadano proliferację uzyskanych linii komórkowych o różnym statusie HSF1. Wykazano, że zróżnicowana ekspresja HSF1 nie wpływa na szybkość podziałów komórek zarówno mysiego i ludzkiego czerniaka. Następnie wykonano szereg testów w systemie Boydena, określających zdolność komórek do migracji 7
w warunkach in vitro. Komórki linii B16F10 oraz 1205Lu charakteryzujące się nadekspresją ahsf1 cechuje większa ruchliwość w komorze Boydena w porównaniu do komórek kontrolnych. W przypadku linii B16F10 zaobserwowano również zwiększoną wydajność tworzenia kolonii w miękkim agarze i zmniejszoną adhezję do fibronektyny, ważnego składnika macierzy zewnątrzkomórkowej, co obrazuje lepszą zdolność tych komórek do wzrostu niezależnego od podłoża. W dalszych badaniach oceniono wpływ HSF1 na potencjał tumorogenny komórek nowotworowych in vivo. Zróżnicowana ekspresja HSF1 nie wpływa na szybkość wzrostu guzów po podskórnym szczepieniu komórek B16F10 do myszy szczepu C57BL/6Crl. Natomiast po zaszczepieniu komórek z nadekspresją ahsf1 do żyły ogonowej zaobserwowano tworzenie się większej liczby ognisk nowotworowych w płucach, co świadczy o wydajniejszej zdolności tych komórek do kolonizowania odległych organów (Toma-Jonik i wsp., 2015). Ponadto scharakteryzowano wstępnie molekularny mechanizm wspierania ruchliwości komórek czerniaka przez HSF1. Zwiększona mobilność komórek towarzyszy często przejściu epitelialno-mezenchymalnemu. Analiza ekspresji markerów EMT (ang. Epithelial to Mesenchymal Transition) takich jak: N-kadheryna, wimentyna, beta1-katenina i innych techniką Western Blot nie wykazała istotnych różnic w ilości tych białek w komórkach o różnym statusie HSF1. Zależna od HSF1 zwiększona migracja komórek nie jest więc związana z EMT. W związku z tym zbadano ekspresję 84 genów zaangażowanych w procesy migracji i ruchliwości (posługując się macierzami PCR, Mouse Cell Motility RT 2 Profiler PCR Array) w komórkach linii B16F10 z nadekspresją ahsf1 i kontrolnych. Wykazano obniżoną ekspresję genów takich jak: winkulina, kaweolina 1, kalpaina 1, metaloproteinaza 2. Walidacja ekspresji tych genów przy pomocy ilościowej reakcji RT-PCR oraz techniką Western Blot potwierdziła istotny spadek ekspresji winkuliny w komórkach ludzkiego i mysiego czerniaka z nadekspresją aktywnej formy HSF1. Analiza sekwencji genu winkuliny w poszukiwaniu potencjalnych miejsc wiązania HSF1 wykazała, że zarówno w mysim jak i ludzkim genie winkuliny istnieje kilka typowych miejsc HSE. Dzięki eksperymentom z zastosowaniem immunoprecypitacji chromatyny wykazano wiązanie HSF1 w liniach 1205Lu i WM793B w obrębie drugiego intronu, zaś w linii B16F10 w obrębie pierwszego egzonu (Toma-Jonik i wsp., 2015). 8
Odrębnym badanym zagadnieniem była ocena wpływu HSF1 na wrażliwość komórek na chemioterapeutyki. W tym celu komórki czerniaka wykazujące nadekspresję zmutowanych form HSF1 (ahsf1, HSF1-DN) oraz pełnej formy (hhsf1) potraktowano chemioterapeutykami o różnym mechanizmie działania: doksorubicyną, winblastyną, cisplatyną, paklitakselem i bortezomibem. Następnie testem MTT oceniono ich przeżywalność oraz ustalono maksymalną wartość stężenia leku wywołującego śmierć 50% populacji komórek (IC50). Udowodniono, iż zarówno komórki mysiego jak i ludzkiego czerniaka z nadekspresją hhsf1 oraz formy HSF1-DN charakteryzują się zwiększoną chemoopornością na doksorubicynę i paklitaksel w porównaniu do komórek kontrolnych oraz typu dzikiego (Vydra i wsp., 2013). W celu ustalenia molekularnych przyczyn tego zjawiska zanalizowano przy pomocy ilościowej (półilościowej dla linii B16F10) reakcji RT-PCR poziom ekspresji genów z rodziny transporterów ABC (ang. ATP Binding Cassette) ABCB1, ABCB8, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCD1. We wszystkich badanych liniach komórkowych charakteryzujących się nadekspresją formy HSF1-DN oraz hhsf1 zaobserwowano wzrost poziomu liczby transkryptów genu ABCB1 oraz wielu innych z tej rodziny. Zarówno nadekspresja ahsf1, jak i wyciszenie ekspresji HSF1 w komórkach mysiego czerniaka B16F10 nie miały wpływu na ekspresję genów z rodziny ABC oraz na przeżywalność komórek w warunkach traktowania ich cytostatykami (Vydra i wsp., 2013). Zbadano również za pomocą cytometrii przepływowej aktywność transporterów błonowych usuwających substancje toksyczne z komórek. W tym celu wykorzystano fluorescencyjny barwnik efluxx-id TM Green Detection Reagent. Jest on substratem dla trzech klinicznie najważniejszych białek oporności wielolekowej: ABCB1 (MDR1), ABCC1/2 (MRP1/2) i ABCG2 (BCRP). Wykazano, że komórki ludzkiego czerniaka charakteryzujące się nadekspresją hhsf1 akumulują mniej barwnika, co świadczy o większej aktywności transporterów ABC w błonie komórkowej. Ponadto wykazano, iż hhsf1 może zwiększać liczebność populacji komórek o fenotypie SP (ang. Side Population), czyli nie akumulujących barwnika fluorescencyjnego Hoechst 33342 i często utożsamianych z frakcją nowotworowych komórek macierzystych (Vydra i wsp., 2013). Niniejsze prace pokazują, iż HSF1 promuje progresję nowotworu poprzez wspieranie migracji komórek i przerzutowania. Istotną rolę w regulacji tych procesów odgrywa 9
prawdopodobnie zależny od HSF1 spadek ekspresji winkuliny. Wyniki badań pokazują także, iż komórki czerniaka z nadekspresją HSF1 są bardziej odporne na doksorubicynę i paklitaksel. Taka zależna od HSF1 oporność nie jest związana z akumulacją białek HSP, lecz raczej ze zwiększonym usuwaniem leków z komórek za pośrednictwem transporterów ABC. Podwyższona ekspresja HSF1 w komórkach nowotworowych może przyczyniać się do zmniejszenia skuteczności chemioterapii i selekcjonowania komórek opornych na cytostatyki. Tak duży wpływ HSF1 na różne aspekty wzrostu nowotworowego może uczynić z niego w przyszłości ważny cel terapii przeciwnowotworowej. 2.3 Podsumowanie a) HSF1 (HSF1-DN i hhsf1) zwiększa oporność komórek czerniaka na doksorubicynę i paklitaksel, ale nie na winblastynę, cisplatynę i bortezomib b) Komórki czerniaka z nadekspresją hhsf1 wykazują zwiększony wyrzut barwników fluorescencyjnych, będących substratem dla transporterów z rodziny ABC c) hhsf1 zwiększa liczebność populacji komórek SP (ang. Side Population) d) Komórki czerniaka z nadekspresją HSF1 (HSF1-DN i hhsf1) charakteryzują się podwyższonym poziomem ekspresji genów z rodziny ABC e) Obserwowany efekt nie wynika z aktywności transkrypcyjnej HSF1 i nie koreluje z poziomem ekspresji HSP, lecz wymaga obecności domeny regulatorowej HSF1 f) Wyciszenie ekspresji HSF1 oraz nadekspresja konstytutywnie aktywnego HSF1 (ahsf1) nie wpływa na oporność komórek na doksorubicynę, paklitaksel, winblastynę, cisplatynę i bortezomib g) Konstytutywnie aktywny HSF1 (ahsf1) promuje zwiększoną ruchliwość, komórek czerniaka mysiego B16F10 i ludzkiego 1205Lu, jednak wyjściowo duży potencjał migracyjny komórek WM793B pozostaje bez zmian h) Nadekspresja konstytutywnie aktywnego HSF1 (ahsf1) wspiera wzrost niezależny od podłoża komórek B16F10 oraz ich zdolność do tworzenia przerzutów i) Komórki B16F10 z nadekspresją ahsf1 wykazują obniżoną adhezję do fibronektyny 10
j) Zwiększona, zależna od HSF1 ruchliwość komórek czerniaka mysiego B16F10 i ludzkiego 1205Lu nie jest związana ze zmianą ekspresji białek markerowych przejścia epitelialnomezenchymalnego k) HSF1 jest prawdopodobnie negatywnym regulatorem ekspresji genu winkuliny, kodującego białko adhezji kontaktowej, zwiększające przyczepność komórek do podłoża 11