Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Pyrżak B. i inni Wpływ polimorfizmu GIn223Arg genu receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu... Vol. 7/2008 Nr 3(24) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Wpływ polimorfizmu Gln223Arg genu receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu metabolicznego u dzieci z otyłością prostą The Influence of Polymorphism Gln223Arg in the Leptin Receptor on Obesity, Leptin, and the Prevalence of Metabolic Syndrome in Children with Obesity Beata Pyrżak, Anna Wiśniewska, Anna Majcher Katedra i Klinika Pediatrii i Endokrynologii Warszawski Uniwersytet Medyczny Adres do korespondencji: beata.pyrzak@am.edu.pl Słowa kluczowe: polimorfizm Gln223Arg LEPR, otyłość, dzieci Key words: polymorphism Gln223Arg LEPR, obesity, children STRESZCZENIE/ABSTRACT Wprowadzenie. Leptyna należy do grupy cytokin, bierze udział w regulacji masy ciała i działa poprzez swoiste receptory. Celem pracy była ocena wpływu polimorfizmu genu Gln223Arg receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu metabolicznego ocenianego definicją IDF u dzieci z otyłością prostą. Materiał i metody. Grupę badaną stanowiło 101 dzieci z otyłością prostą, u których przeprowadzono badania antropometryczne, biochemiczne i genetyczne oraz grupę kontrolną 41 dzieci szczupłych, u których wykonywano badania genetyczne. W ocenie częstości występowania zespołu metabolicznego (ZM) uwzględniono kryteria wg IDF. Wyniki badań. Uzyskano następujący rozkład wariantów genotypów LEPR (AA) u 20,8% dzieci otyłych, i u 31,7% dzieci szczupłych, (AG) odpowiednio; u 55,4% i u 53,65%, (GG) odpowiednio; u 23,8% i u 14,65%. W ocenie częstości występowania polimorfizmu nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie pomiędzy grupami. W grupie dzieci z otyłością nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie pomiędzy homozygotami AA a heterozygotami AG i homozygotami GG w porównaniu wskaźników antropometrycznych, biochemicznych, stężeń leptyny i średnich ciśnienia tętniczego. ZM rozpoznano u 28,8 % dzieci otyłych, nie stwierdzono częstszego występowania ZM u dzieci z polimorfizmem genu w porównaniu z dziećmi bez polimorfizmu genu (OR 2,20, 95% CI 0,55-8,80, Chi 2 =1,36 NS). Wnioski. U dzieci z otyłością nie stwierdzono związku polimorfizmu genu Gln223Arg LEPR ze stopniem otyłości, stężeniami leptyny i wpływem na częstość występowania zespołu metabolicznego. Endokrynol. Ped., 7/2008; 3(24):35-44. Introduction. Leptin is a cytokine that takes part in body weight regulation and acts through the receptors. The aim of this study was to determine whether the Gln223Arg polymorhism in the LEPR gene is associated with obesity, 35

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;3(24):35-44 serum leptin and the prevalence of metabolic syndrome according IDF criteria in children with obesity. Material and methods. 101 children with obesity in which the anthropometric, biochemical and genetic investigations were performed. The control group consisted of 41 healthy non-obese children in which the genetic investigation was analyzed. The incidence of the metabolic syndrome (ZM) according IDF criteria was analyzed. Results. The three variants of genotype LEPR were obtained; (AA) in obese 20,8%, and in non-obese 31,7%, (AG) in obese 55,4% and in non-obese 53,65%, (GG) in obese 23,8% and in non-obese 14,65%. There was not significant difference between groups. Comparative analyses between AA homozygous and heterozygous AG and homozygous GG did not confirm an influence of gene polymorphism on the increase in the extent of obesity, lipid abnormalities, leptin levels and mean of blood pressure. The metabolic syndrome in obese group according IDF criteria had 28,8% children. There was not significant difference in LEPR polymorphism freguency, comparing children with metabolic syndrome and without metabolic syndrome (OR 2,20, 95% CI 0,55-8,80, Chi 2 =1,36 NS). Conclusion. In children with obesity we did not observe association of the LEPR Gln223Arg gene polymorphism with obesity, leptin levels, and the prevalence of metabolic syndrome. Pediatr. Endocrinol., 7/2008; 3(24):35-44. Wstęp Pomimo wielu badań nadal nie są jeszcze dokładnie poznane genetyczne mechanizmy rozwoju otyłości. W ostatnich latach wiele uwagi poświęca się endo i parakrynnej czynności adipocytów. Jednym z lepiej poznanych białek wydzielnych przez tkankę tłuszczową jest leptyna. 1. Biologia leptyny Leptyna jest białkiem pochodzącym od greckiego słowa leptos (chudy, szczupły, zwinny) i jest produkowana głównie w białej tkance tłuszczowej i w mózgu, niewielkie ilości syntetyzuje także łożysko, żołądek i mięśnie szkieletowe [1, 2, 3, 4]. Jest białkiem składającym się ze 167 aminokwasów, kodowanym przez gen LEP zlokalizowany na chromosomie 7q31.3. Działa za pośrednictwem receptorów, należących do rodziny receptorów cytokin klasy pierwszej. Receptory dla leptyny znajdują się w licznych tkankach: w podwzgórzu, płucach, nerkach, wątrobie, trzustce, jelitach, sercu, łożysku, gruczole krokowym, jądrach, jajnikach [5, 6]. Istnieją cztery izoformy receptora leptytowego: jedna długa i trzy krótkie oraz forma rozpuszczalna receptora występująca w surowicy. Długa izoforma receptora leptynowego występuje w podwzgórzu i jest odpowiedzialna za działanie anorektyczne hormonu. Krótkie izoformy receptora są zlokalizowane w tkankach obwodowych i w splocie naczyniówkowym mózgu, gdzie odpowiadają za wychwytywanie i transport hormonu do podwzgórza [7, 8]. Leptyna w surowicy jest u osób szczupłych w 60-80% związana z białkami i z rozpuszczalną izoformą receptora leptynowego. U otyłych większość krążącej leptyny stanowi forma wolna podlegająca szybkiej enzymatycznej degradacji, co jest prawdopodobną przyczyną zmniejszenia jej działania anorektycznego. Leptyna wykazuje rytm dobowy z wysokimi stężeniami w nocy, a niskimi w ciągu dnia oraz jak większość hormonów jest wydzielana pulsacyjnie [9, 10, 11]. Centralne działanie leptyny polega na wpływie na NPY przez jądro łukowate podwzgórza i receptor MRC-4 (receptor typu 4 dla melanokortyny hormonu melanotropowego). Zwiększenie stężenia leptyny zmniejsza łaknienie działając bezpośrednio poprzez spadek wytwarzania NPY w podwzgórzu oraz pośrednio przez MSH i aktywację receptora MCR-4. Mechanizm leptynooporności polega prawdopodobnie na zaburzeniu transportu leptyny przez barierę krew-mózg lub na defekcie przekazania sygnału przez swoiste receptory [9, 10]. Stężenie leptyny zależy od wieku i płci. U kobiet jest wyższe niż u mężczyzn przy tym samym BMI, ponieważ u kobiet występuje więcej tkanki tłuszczowej w stosunku do beztłuszczowej masy ciała. U dzieci stwierdzono, dodatnią korelację poziomu leptyny z procentową zawartością tkanki tłuszczowej u obu płci, do osiągnięcia drugiej fazy pokwitania wg Tannera. Po tym okresie u chłopców następuje obniżenie stężenia leptyny wraz z wiekiem [5]. Działanie metaboliczne leptyny polega na jej wpływie na metabolizm węglowodanów i tłuszczów. Leptyna hamuje podstawowe i stymulowane glukozą wydzielanie insuliny, a w fizjologicznych stężeniach obniża drugą fazę sekrecji insuliny. Wpływa bezpośrednio na wątrobowy metabolizm glukozy poprzez insulinopodobne działanie na glikogenolizę i glukagonopodobne działanie na glukoneogenezę. Przez zlokalizowane w ścianie jelit receptory leptyna wpływa na absorpcję glukozy. W mięśniach szkieletowych leptyna stymuluje zużycie glukozy, wykazując działanie insulinopodobne, natomiast wpływ na metabolizm lipidów jest 36

Pyrżak B. i inni Wpływ polimorfizmu GIn223Arg genu receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu... przeciwstawny do insuliny [12]. Leptyna zmniejsza antyoksydacyjne, lipogeniczne działanie insuliny na metabolizm kwasów tłuszczowych. Hiperleptynemia obserwowana w otyłości, sprzyja powstawaniu insulinooporności [12, 13]. Leptyna reguluje neuroendokrynne funkcje układu endokrynnego. Niedobór leptyny wiąże się z pobudzeniem osi podwzgórze-przysadka-nadnercza; supresją osi podwzgórze-przysadka-tarczyca i osi gonadalnej, prowadząc do ograniczenia termogenezy i bezpłodności. Leptyna obniża kortyzolemię hamując wywołaną stresem sekrecję podwzgórzowego CRH i hamując sekrecję kortyzolu z nadnerczy oraz inicjuje i przyspiesza dojrzewanie, a także normalizuje wydzielanie gonadotropin u osób z obniżonym poziomem leptyny. Leptyna działa także bezpośrednio poprzez obwodowe receptory w jajnikach, jądrach, prostacie i łożysku. Podanie leptyny normalizuje supresję hormonów tarczycy u zwierząt i ludzi z niskim jej poziomem, poprzez stymulację ekspresji TSH i wzrost sekrecji TRH w podwzgórzu [14, 15]. Leptyna odgrywa rolę w procesach immunologicznych, w hematopoezie, angiogenezie i regulacji gęstości mineralnej kośćca [7, 16, 17]. Niedobór leptyny opisano dotychczas jedynie w kilku rodzinach. Mutację typu zmiany ramki odczytu (ΔG133) wykryto u 6 pacjentów. Pacjenci charakteryzowali się ogromną hiperfagią, otyłością olbrzymią od najwcześniejszych okresów dzieciństwa, hiperinsulinemią, u dzieci występował zaawansowany wiek kostny, u dorosłych pacjentów hipogonadyzm hipogonadotropowy [18]. Niedobór receptora leptyny udokumentowano jedynie w przypadku trojga dzieci spokrewnionych rodziców pochodzenia algierskiego [19]. Receptor leptyny występuje w kilku izoformach powstajacych w trakcie alternatywnego splicingu transkryptu genu Lepr. Większość udokumentowanych efektów działania leptyny zachodzi za pośrednictwem receptora LEPR znajdującego się w rejonach mózgu wpływających na homeostazę energetyczną organizmu oraz regulację autonomiczną i hormonalną. Osoby z niedoborem receptora leptyny mają podobny fenotyp do tych z niedoborem leptyny. Urodzeniowa masa ciała chorych jest prawidłowa, ale w ciągu pierwszych miesięcy życia obserwuje się szybki przyrost masy ciała i hiperfagię. Osoby z niedoborem receptora leptynowego wykazują nieprawidłowości hormonalne niespotykane u pacjentów charakteryzujących się niedoborem leptyny takie jak zmniejszone wydzielanie hormonu wzrostu, obniżony poziom IGF-1 i IGF-BP3 oraz hypotyroidyzm pochodzenia podwzgórzowego [18, 19, 20]. Pośród wielu genów biorących udział w regulacji leptyny, uważa się, że polimorfizm genu receptora leptynowego (LEPR) Gln223Arg może odgrywać rolę w rozwoju otyłości i związanych z nią konsekwencji. Cel Celem pracy była ocena wpływu polimorfizmu Gln223Arg genu receptora leptynowego na stężenia leptyny oraz częstość występowania zespołu metabolicznego ocenianego definicją IDF u dzieci z otyłością prostą. Materiał i metody Badania przeprowadzono u dzieci z otyłością prostą, pozostających pod opieką Kliniki Pediatrii i Endokrynologii Akademii Medycznej w Warszawie. Badaną grupę stanowiło 101 dzieci, w tym 58 dziewcząt i 43 chłopców w wieku od 10 do 18 roku życia. Żadne z dzieci nie brało leków. Otyłość była zdiagnozowana jako otyłość prosta. Grupę kontrolną stanowiło 41 zdrowych, szczupłych dzieci, w tym: 24 dziewcząt i 17 chłopców dobranych wiekowo, u których przeprowadzano badanie genetyczne. Badania antropometryczne obejmowały: wysokość ciała (cm), masę ciała (kg), obwód talii (cm), ocenę obwodu talii na siatkach centylowych, oceny SDS [21], obwód bioder (cm), sumę grubości 3 i 10 fałdów skórno-tłuszczowych (mm), procent zawartości tkanki tłuszczowej z pomiarów fałd skórno- -tłuszczowych na ramieniu i pod łopatką wg wzoru Slaughtera [22]. Wyliczono wskaźnik BMI (Body Mass Index, masa ciała/wys 2 =kg/m 2 ) oraz WHR (Waist to Hip Ratio = stosunek obwodu talii do bioder). Za granicę otyłości przyjęto 2 SDS dla BMI wyrażonych w wartościach znormalizowanych dla każdego pacjenta (z-score BMI). W badanej grupie dzieci, wykonano trzykrotne pomiary ciśnienia tętniczego krwi w odstępie kilku minut, z pomiarów wyliczono wartość średnią metodą Korotkowa. W ocenie ciśnienia tętniczego stosowano wartości centylowe ciśnienia (cc) uwzględniające wiek, wzrost i płeć oparte na siatkach centylowych opracowanych na populacji dzieci i młodzieży [23]. Nadciśnienie tętnicze rozpoznawane było jako wartość ciśnienia tętniczego skurczowego i/lub rozkurczowego powyżej lub równe 95. centyla dla płci wieku i centyla wzrostu. 37

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;3(24):35-44 Wartości graniczne stan przednadciśnieniowy, jako wartości ciśnienia skurczowego i/lub rozkurczowego pomiędzy 90 a 95 centylem [24]. U każdego dziecka po 12-godzinnym okresie snu we krwi obwodowej oznaczano: cholesterol całkowity (Chol-T), cholesterol frakcji HDL (Chol- HDL), cholesterol frakcji LDL (Chol-LDL), triglicerydy (Tg) metodami enzymatycznymi, leptynę oznaczano metodą RIA. U badanych dzieci wykonano test doustnego obciążenia glukozy (1,75g glukozy /kg masy ciała, maksymalnie 75 g glukozy) z oznaczaniem glikemii i insulinemii w 0, 30, 60, 90, 120 minut. Glukozę we krwi oznaczano używając metody enzymatycznej standaryzowanej, stężenie insuliny w surowicy krwi oznaczano metodą RIA. Wyliczono indeks insulinowrażliwości OGIS 90 (Oral Glucose Insulin Sensitivity Index) używając kalkulatora OGIS [25], na podstawie metody oceny insulinowrażliwości w czasie testu OGTT wg pracy Mari A. i wsp. [26] oraz współczynnik insulinooporności HOMA-IR ze wzoru: Gluk0min (mmol/litr)x Ins0min (uu/ml): 22,5 [27]. W ocenie częstości występowania zespołu metabolicznego (ZM) uwzględniono kryteria wg IDF. Dla dzieci w wieku 10-15 lat rozpoznanie zespołu metabolicznego uwzglęnia występowanie 3 lub więcej parametrów: otyłość brzuszną obwód talii 90 percentyla, poziom triglicerydów (Tg) 1,7 mmol/l 150 mg/dl, poziom cholesterolu HDL-C<1,03 mmol/l <40 mg/dl, występowanie ciśnienia tętniczego skurczowego 130 mm Hg lub rozkurczowego 85 mm Hg, poziom glukozy na czczo 5,6 mmol/l 100 mg/dl lub rozpoznana cukrzyca typu 2. U dzieci powyżej 16 roku życia w rozpozananiu zespołu zastosowano kryteria IDF dla dorosłych otyłość brzuszną 94 cm dla mężczyzn i 80 cm dla kobiet oraz dowolne dwa z niżej wymienionych parametrów: triglicerydy (Tg) >1,7 mmol/l (150mg/ dl), cholesterol frakcji HDL-C <1,03 mmol/l (40 mg/dl) mężczyźni, <1,29 mmol/l (50 mg/dl) kobiety, ciśnienie tętnicze skurczowe 130 mmhg, ciśnienie tętnicze rozkurczowe 85 mmhg, glukoza na czczo 5,6 mmol/l (100 mg/dl) lub wcześniej rozpoznana cukrzyca [28]. Metody badań genetycznych Genomowe DNA izolowano za pomocą zestawów Genomic Midi AX firmy A&A firmy ASA Biotechnology, z 1 ml krwi obwodowej w celu określenia składu morfologicznego krwi. Metodykę PCR-RFLP zastosowaną w celu oceny występowania polimorfizmu Q223R w genie receptora leptyny, wzorowano na opisanej przez Godota i wsp [29]. Wyizolowane DNA poddano reakcji PCR ze starterami flankującymi badany fragment genu: Stosowano startery o następujących sekwencjach: forward 5 AAA CTC AAC GAC ACT CTC CTC 3 rewers 5 TGA ACT GAC ATT AGA GGT GA 3. Reakcję PCR prowadzono w objętości końcowej równej 25 μl. Mieszanina reakcyjna zawierała 100 ng matrycy DNA, 1xTag Golg polimerazy bufor, 1,5 mm/mgcl 2, 0,01 mm/ dntps, 0,75 μm każdego startera i 0,5U polimerazy TaqGold (Applied Biosystems) oraz wodę do uzupełniania do objętości 25μl. DNA poddawano amplifikacji w 35 cyklach ze wstępną denaturacją matrycy przez 10 min w temp. 94 o C i końcową elongacją przez 10 min w temp. 72 o C. Pojedynczy cykl stanowiły następujące po sobie etapy: denaturacja matrycy w temp. 94 o C przez 35s, przyłączanie starterów przez 45s w temperaturze 55 o C, wydłużanie nici w temperaturze 72 o C przez 45s. Produkt reakcji PCR przechowywano w temperaturze 4 o C do czasu dalszych analiz. Produkt reakcji PCR o wielgości 80 par zasad, poddano trawieniu endonukleazą MspI w temperaturze 37 o C w czasie 24 godzin, a następnie analizowano poprzez wykonanie elektroforezy na 3% agarozie barwionej bromkiem etydyny. Analiza RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych) przy użyciu enzymu MspI pozwala na ocenę występowania poszczególnych form allelicznych w pozycji 223 genu receptora leptyny. Nieobecność miejsc restrykcyjnych w badanym fragmencie DNA świadczy o genotypie homozygoty AA (Gln/Gln), obecność miejsc restrykcyjnych dwa fragmenty DNA o wielkości 57 i 23 pary zasad świadczą o geotypie GG (Arg/Arg), a 3 fragmenty o wielkości 80, 57 i 23 pary zasad to genotyp odpowiadający heterozygocie AG (Gln/ Arg). Metody obliczeniowe Wyniki badań opracowano statystycznie za pomocą programu komputerowego Statgraphics 4 Plus i STATISTICA 6 [30, 31]. Dla wszystkich testów przyjęto poziom istotności p<0,05. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji 38

Pyrżak B. i inni Wpływ polimorfizmu GIn223Arg genu receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu... Bioetycznej przy Akademii Medycznej w Warszawie KB/38/2006. Wyniki Wyliczono częstość występowania polimorfizmu genu receptota leptynowego LEPR w grupie dzieci otyłych i w grupie kontrolnej. Badano występowanie zamiany glutaminy na argininę w genie receptora leptynowego LEPR Gln223Arg (Q223R). Uzyskano 3 warianty genotypów: homozygot Gln/Gln (AA, Q/Q), heterozygot Gln/Arg (AG, Q/R) oraz homozygot Arg/Arg (GG,R/R). Wyliczono rozkład częstości występowania genotypów LEPR w grupie badanej i w grupie kontrolnej: Ryc. 1. Rozkład częstości wariantów genotypów LEPR w grupie badanej Ryc. 1. Frequencies of the gene variant s LEPR in studied group and in control group Grupa badana N=101 Grupa kontrolna N=41 AA N=21 AG N=56 GG N=24 20,8% 55,4% 23,8% AA N=13 AG N=22 GG N=6 31,7% 53,65% 14,65% Zwraca uwagę wyższe występowanie genotypu GG w grupie badanej, w porównaniu z grupą kontrolną. W teście chi 2 (chi 2 =2,76, NS) nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie pomiędzy rozkładami genotypów w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną. Do oceny rozkładu genotypów dla genu LEPR w grupie badanej i kontrolnej zastosowano test równowagi Hardy ego-weinberga (H-W) [32]. W wyniku przeprowadzonej analizy genotypów LEPR wykazano, że prawdopodobieństwo występowania w grupie badanej i kontrolnej glutaminy Q i argininy R było zgodne z testem H-W. Przeprowadzono analizy porównawcze pomiędzy parametrami antropometrycznymi, biochemicznymi, leptyną, Ryc. 2. Rozkład częstości wariantów genotypów LEPR w grupie kontrolnej Ryc. 2. Frequencies of the gene variant s LEPR in control group współczynnikami HOMA-IR, OGIS 90 i wartościami ciśnienia tętniczego w grupie homozygot bez polimorfizmu AA, w porównaniu z heterozygotami i homozygotami z polimorfizmem AG i GG. Wyniki badań przedstawiono w tabeli 2. W całej grupie w porównaniu wskaźników antropometrycznych i biochemicznych, stężeń leptyny i średnich ciśnienia tętniczego homozygot AA z heterozygotami AG i homozygotami GG nie stwierdzono rożnic istotnych statystycznie. W grupie dziewcząt i chłopców w porównaniu pomiędzy homozygotami AA a heterozygotami AG i homozygotami GG nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie. W analizie oceny stężeń leptyny zaobserwowano, że średnie wartości leptyny w grupie AA (homo- Tabela I. Ocena częstości rozkładu genotypów LEPR Table I. Frequency of genotypes LEPR Grupa badana Kontrole Prawdopodobieństwo występowania glutaminy A Prawdopodobieństwo występowania argininy G Prawdopodobieństwo występowania glutaminy A Prawdopodobieństwo występowania argininy G p=0,51 p=0,49 p=0,42 p=0,058 Chi-2 = 2,5; 1 st. swobody (1 df deficiency degree); NS częstość występowania A i G jest zgodna z testem H-W Chi-2 = 1,2; 1 st. swobody (1 df deficiency degree); NS częstość występowania A i G jest zgodna z testem H-W 39

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;3(24):35-44 Tabela II. Porównanie wskaźników antropometrycznych, biochemicznych, leptyny, wskaźników HOMA-IR, OGIS 90, SBP, DBP w grupie AA vs AG i GG Table II. Comparsion between of anthropometric indices, biochemic indices, leptin, HOMA-IR, OGIS 90, SBP, DBP in group AA vs AG and GG Masa ciała (kg) Body Weight (kg) BMI (kg/m 2 ) Body Mass Index (kg/m 2 ) Wskaźniki Indices SDS BMI (z-score) SDS Body Mass Index (z-score) Obwód talii (cm) Waist circumference (cm) Obwód bioder (cm) Hip circumference (cm) WHR Waist to hip ratio Suma 3 fałdów skórno-tłuszczowych Sum of 3 skinfold thickness (mm) Suma 10 fałdów skórno-tłuszczowych Sum of 10 skinfold thickness (mm) % zawartości tkanki tłuszczowej metodą Slaughter % of body fat (Slaughter equation) Cholesterol całkowity (Chol-T) (mg/dl) Total cholesterol (mg/dl) Cholesterol HDL (Chol-HDL) (mg/dl) HDL-cholesterol (mg/dl) Cholesterol LDL (Chol-LDL) (mg/dl) LDL-cholesterol (mg/dl) Triglicerydy (Tg) (mg/dl) Triglicerydes (mg/dl) Grupa AA N=21 Średnia i SD Mean xsd Standard Deviation p Grupa AG+GG N=80 Średnia i SD Mean x SD Standard Deviation 82,09±18,38 NS 84,90±22,15 31,38±5,10 NS 31,12±4,42 4,09±1,65 NS 4,11±1,44 95,25±12,76 NS 94,94±12,15 107,50±10,86 NS 109,37±11,72 0,88±0,06 NS 0,87±0,08 75,16±11,23 NS 69,45±12,00 185,97±30,11 NS 168,95±24,50 35,72±4,65 NS 34,23±5,03 168,20±30,46 NS 175,05±37,51 50,13±13,74 NS 44,69±10,84 97,25±25,40 NS 103,31±32,10 121,14±47,89 NS 141,25±64,23 Glukoza 0 OGTT (mg/dl) Glucose 0 min OGTT (mg/dl)) 79,22±9,98 NS 80,82±11,42 Insulina 0 OGTT (μiu/ml) Insulin 0 min OGTT (μiu/ml) 16,43±9,45 NS 20,32±16,32 HOMA-IR 3,10±1,32 NS 4,14±3,76 OGIS 90 448,46±73,32 NS 432,93±80,91 Ciśnienie skurczowe Systolic Blood Pressure Ciśnienie rozkurczowe Diastolic Blood Pressure Leptyna (ng/ml) Leptin (ng/ml) 120,00±10,65 NS 120,54±11,60 71,56±5,98 NS 71,46±7,94 31,42±18,57 NS 27,11±13,98 40

Pyrżak B. i inni Wpływ polimorfizmu GIn223Arg genu receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu... Tabela III. Porównanie cech zespołu metabolicznego u dzieci z polimorfizmem genu Q223R z dziećmi bez polimorfizmu genu LEPR Table III. Correlation between indices of metabolic syndrome in children with polymorphism and children without polymorphism LEPR. LEPR AA vs AG i GG Czynniki zespołu metabolicznego O.R. odds ratio 95% C.I. istotność 1. obwód talii 2. triglicerydy 3. cholesterol HDL 4. glikemia na czczo 5. nadciśnienie tętnicze 2,20 0.55-8.80 Chi 2 =1,36 NS Ryc. 3. Wartości średnie ± SD stężenia leptyny w grupach AG, AA, GG Ryc. 3. Mean ± SD serum leptin in group AG, AA, GG zygot dzikich) były nieco wyższe niż w grupie AG i GG (Ryc. 3). W teście ANOVA w porównaniu średnich stężeń leptyny w grupie AA vs AG i GG nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie F=0,63,NS. Przeprowadzono analizę wytępowania zespołu metabolicznego w badanej grupie dzieci. Analizy przeprowadzono biorąc pod uwagę 3 i więcej czynniki zespołu metaboliczego według kryteriów IDF. Zespół metaboliczny rozpoznano u 29 (28,8%) dzieci. W kolejnym etapie badań, przeprowadzono analizę częstości występowania zespołu metabolicznego u dzieci z polimorfizmem genu LEPR w porównaniu do dzieci bez polimorfizmu genu. Analiza nie wykazała zwiększonej częstości występowania zespołu metabolicznego u dzieci z polimorfizmem genu w porównaniu z dziećmi bez polimorfizmu. Przeprowadzono analizę testem ANOVA średnich leptyny w grupach AA vs AG i GG dla pacjentów spełniających kryteria zespołu metabolicznego wg IDF. Analiza nie wykazała różnic pomiędzy grupami; u dzieci bez polimorfizmu genu (AA) w porównaniu z dziećmi i z polimorfizmem genu (AG+GG) nie występowały istotnie statystycznie niższe wartości leptyny (F=0,22, NS). Dyskusja W prezentowanej pracy przedstawiono wyniki badań dotyczących wpływu polimorfizmu genu receptora leptynowego Gln223Arg (Q223R) na stopień otyłości, stężenia leptyny i parametry zespołu metabolicznego u dzieci z otyłością. Polimorfizm genu receptora leptynowego polega na zamianie białka glutaminy na argininę, w starterowym kodonie 223 exonu 6, w zewnątrzkomórkowej domenie cytokinowej C receptora leptynowego, co sugeruje wpływ na czynność funkcjonalną tego receptora. W modelu zwierzęcym u szczurów z mutacją fa (fatty Zucker rat), zamiana białka Q269R jest zlokalizowana w pierwszej domenie cytokinowej receptora leptynowego, wpływa na redukcję 41

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;3(24):35-44 ekspresji receptora oraz na zmianę przekazu wewnątrzkomórkowego prowadząc do aktywacji STAT1, STAT3 i STAT5B [33]. Prowadzi to do stanu oporności na leptynę i otyłości. Strukturalne podobieństwo Q223R polimorfizmu LEPR u ludzi do polimorfizmmu Q269R w modelu szczurzym, skłoniło badaczy do poszukiwania jego wpływu na otyłość u ludzi. Stwierdzany wysoki poziom leptyny u homozygot (GG, Arg/Arg) skłania do rozważań wpływu polimorfizmu Q223R na czynność funkcjonalną długiej izoformy ludzkiego genu receptora leptynowego. Wpływ polimorfizmu genu LEPR na stopień otyłości wykazywano w wielu badaniach. W badaniu Quebec Family Study, Chagnon et al [34] obserwowano związek polimorfizmu genu LEPR z nadmiarem tkanki tłuszczowej, nie stwierdzono korelacji z BMI. W badaniach HERITAGE przeprowadzonych w Kanadzie, wykazano wyraźny związek wpływu polimorfizmu genu Gln223Arg (Q223R) z otyłością w populacji rasy kaukaskiej, i wykazano, że szczególnie osoby w średnim wieku będące nosicielami argininy (R) charakteryzowali się większą BMI, procentową zawartością tkanki tłuszczowej i wyższymi stężeniami leptyny w porównaniu z nosicielami glutaminy (Q)[35]. W badaniach greckich wykazano związek polimorfizmu genu z BMI, procentową zawartością tkanki tłuszczowej [36], a w badaniach hiszpańskich na dużej populacji osób otyłych z BMI [37]. Ciekawe doniesienie przedstawili badacze holenderscy, którzy wykazali związek polimorfizmu genu z zaburzeniami lipidowymi u osób z rodzinną mieszaną hiperlipidemią [38]. W badaniach belgijskich wykazano związek pomiędzy otyłością trzewną wyrażoną wskaźnikiem WHR a zwiększoną częstością występowania polimorfizmu genu u kobiet w okresie pomenopauzalnym, u kobiet w okresie przedmenopauzalnym związku nie wykazano [39]. Z przeglądu piśmiennictwa w badaniach populacyjnych wynika jednak, że nie ma wyraźnego związku pomiędzy polimorfizmami genu LEPR w tym Q223R ze stopniem otyłości. W 20 badaniach przeprowadzonych na 3263 pacjentach z różnych grup etnicznych, na różnych kontynentach takiego związku nie wykazano [40]. Niewiele jest badań dotyczących populacji dziecięcej. W badaniach dzieci szkolnych z Japonii nie wykazano związku Gln223Arg polimorfizmu LEPR z otyłością [41]. Natomiast w badaniach otyłych nastolatków z Meksyku stwierdzono, że pacjenci otyli z polimorfizmem genu charakteryzowali się wyższymi parametrami otyłości, wyższymi stężeniami leptyny, insuliny i większą aktywnością sympatykomimetyczną serca [42]. W prezentowanej pracy częstość występownia homozygot GG (Arg/Arg, RR) w grupie badanej była nieznacznie wyższa niż w grupie kontrolnej, nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie pomiędzy rozkładami genotypów w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną. Również nie wykazano różnic istotnych statystycznie pomiędzy parametrami antropometrycznymi, badaniami biochemicznymi, stężeniami insuliny na czczo, wskaźnikami insulinooporności i insulinowrażliwości, wartościami ciśnienia tętniczego u dzieci bez polimorfizmu genu w porównaniu do grupy dzieci z polimorfizmem genu LEPR, nie zaobserwowno także korelacji ze stężeniami leptyny. Ponadto nie wykazano zwiazku z częstością występowania ZM u dzieci z polimorfizmem genu w porównaniu z dziećmi bez polimorfizmu genu. Na podstawie przeprowadzonej analizy oraz danych z piśmiennictwa wydaje się, że związek polimorfizmu genu LEPR Gln223Arg z otyłością może nie mieć znaczenia funkcjonalnego i może pozostawać w ścisłym sprzężeniu z innymi allelicznymi odmianami genów, i powinien być rozpatrywany wraz z innymi polimorfizmami z uwzględnieniem czynników środowiskowych. Badania genetyczne wpływu polimorfizmu genów w populacji dziecięcej na występowanie zaburzeń metabolicznych, mogą być istotnym ogniwem wyjaśnienia przyczyn rozwoju zespołu metabolicznego. Wnioski U dzieci z otyłością nie stwierdzono związku polimorfizmu genu Gln223Arg LEPR ze stopniem otyłości, stężeniami leptyny i wpływem na częstość występowania zespołu metabolicznego. 42

Pyrżak B. i inni Wpływ polimorfizmu GIn223Arg genu receptora leptynowego na stopień otyłości, stężenie leptyny oraz częstość występowania zespołu... PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Kershaw E.E., Filer J.S.: Adipose tissue as an endocrine organ. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89(6): 2548-2556. [2] Masuzaki H., Ogawa Y., Sagawa N.: Nonadipose tissue production of leptin: as a novel placenta-derived hormone in humans. Nat. Med. 1997; 3(9): 1029-1033. [3] Bado A., Levasseur S., Attoub S. et al.: The stomach is a source of leptin. Nature 1998; 20(394): 790-793. [4] Wiesner G., Vaz M., Collier G. et al : Leptin is released from the human brain : influence of adiposity and gender. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999; 84(7): 2270-2274. [5] Romer T. (red): Leptyna, hormon komórek tłuszczowych. Endokrynologia kliniczna dla ginekologa, internisty i pediatry. Springer, PWN, Warszawa 1998; 182-186. [6] Hukshorn C.J., Saris W.H.: Leptin and energy expediture. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2004; 7(6): 629-633. [7] Margetic S., Gazzola C., Pegg G.G., Hill R.A. : Leptin : A review of its peripherial actions and interactions. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2002; 26:1407-1433. [8] Bjorback C., Kahn B.B.: Leptin signaling in the central nervous system and the periphery. Recent Prog. Horm. Res. 2004; 59: 305-331. [9] Friedman J.M., Halaas J.L.: Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature 1998; 395: 763-770. [10] Flier J.S.: Obesity wars: molecular progress confronts an expanding epidemic. Cell 2004; 116: 337-350. [11] Sinha M.K., Ohannesian J.P., Heiman M.L. et al : Nocturnal rise of leptin in lean, obese, and non-insulin dependent diabetes mellitus subjects. J. Clin. Invest. 1996; 97(5): 1344-1347. [12] Fruhbeck G., Salvador J.: Relation between leptin and the regulation of glucose metabolism. Diabetologia 2000; 43(1): 3-12. [13] Fehmann H.C., Peiser H.P. et al: Leptin ; a potent inhibitor of insulin secretion. Peptides 1997; 18: 1267-73. [14] Chan J.L., Heist K., DePaoli A., Velhuls J.D.: The role of falling leptin levels in the neuroendocrine and metabolic adaptation to short-term starvation in healthy men. J. Clin. Invest. 2003; 111: 1409-1421. [15] Flier J.S., Harris M., Hollenberg A.N.: Leptin, nutrition, and the thyroid: the why, the wherefore, and the wiring. J. Clin. Invest. 2000; 105: 859-807. [16] Lord G.M., Matarese G., Howard J.K. et al : Leptin modulates the T-cell immune response and reverses starvation induced immunosupresion. Nature 1998; 394: 897-901. [17] Cock T.A., Auwerx J.: Leptin: cutting the fat off the bone. Lancet 2003; 362: 1572-1574. [18] Faroogi I.S.: Genetic and hereditary aspects of childchood obesity. Best Practice and Research. Clin.Endocrinol.Met. 2005; 16: 35-374. [19] Clement K., Vaisse C., Lahlou N., Cabrol S. et al: A mutation in the human leptin receptor gene causes obesity and pituitary difuncion. Nature 1998; 392: 398-401. [20] Spodar K., Krajewska-Walasek M.: Krótka charakterystyka genetyznych uwarunkowań otyłości- jak wpaść na trop właściwego rozpoznania. Pediatria polska 2007; 82(8): 593-606. [21] Nawarycz T., Ostrowska-Nawarycz L.: Rozkłady centylowe obwodu pasa u dzieci i młodzieży. Pediatr. Pol. 2007; (5-6): 418-424. [22] Slaughter M.H., Lohman T.G., Boileau R.A., et al: Skinfold eguations for estimation of body fatness in children and youth. Hum Biol. 1988; 60: 709-723. [23] Krzyżaniak A., Karczmarek M., Szilagyi-Pągowska I. i wsp: Ciśnienie tętnicze u dzieci i młodzieży. Wydawnictwo AM im Karola Marcinkowskiego Poznań 2004. [24] National High Blood Pressure Education Program Working Group on Hypertension Control in Children and Adolescents: Update on the 1987 Task Force Report on Hight Blood Pressure in Children and Adolescents. Pediatrics 1996; 98: 649-58. [25] OGIS http://www.ladseb.pd.cnr.it/bioing/ogis/home.html [26] Mari A., Pacini G., Murphy E., Ludvik B., Nolan J.J.: A model-based method for assessing insulin sensitivity from the oral glucose tolerance test. Diabetes Care 2001; 24: 539-548. [27] Ten S., Maclaren N.: Insulin resistance syndrome in children. J.Clin.Endocrinol.Metab. 2004; 89(6): 2526-2539. [28] Zimmet P., Alberti K.G., Kaufman F. et al: The metabolic syndrome in children and adolescens- an IDF consensus report. Pediatr. Diabetes 2007;8(5):299-306. [29] Godota T., Manning B.S., Goldstone A.P., Imric H., Evans A.L.: Leptin receptor gene variation and obesity; lack of association in white British male population. Hum.Mol.Genet.1997; 6: 869-876. [30] Dobosz M.: Statystyczna analiza wyników badań; Akademicka Oficyna Wydawnicza EXIT, Warszawa, 2001. [31] Stanisz A: Przystępny kurs statystyki z zastosowaniem STATISTICA PL; StatSoft, Kraków 2007. [32]. Hosking L., Lumsden S., Lewis K. et al: Detection of genotyping errors by Hardy-Weinberg equilibrium testing. European Journal of Human Genetics 2004; 12: 395-399. [33] Philips M.S., Liu Q., Hammond H.A., et al: Leptin receptor missense mutation in the fatty Zucker rat. Nat Gen 1996; 13: 17-19. 43

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;3(24):35-44 [34] Chagnon Y.C., Chung W.K., Pérusse L., Chagnon M., Leibel R.L., Bouchard C.: Linkages and associations between the leptin receptor (LEPR) gene and human body composition in the Québec Family Study. Int J Obes Relat Metab Disord. 1999; 23(3): 278-86. [35] Chagnon Y.C., Wilmore J.H., Borecki I.B., Gagnon J., Pérusse L., Chagnon M., Collier G.R., Leon A.S., Skinner J.S., Rao D. C., Bouchard C.: Associations between the leptin receptor gene and adiposity in middle-aged Caucasian males from the HERITAGE family study. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85(1): 29-34. [36] Yiannakouris N., Yannakoulia M. Melistas L., Chan J.L. et al: The Q223R polymorphism of the leptin receptor gene is significantly associated with obesity and predicts a small percentage of body weight and body composition variability. J Clin Endocrinol Metab.2001; 86(9): 4434-9. [37] Portolés O., Sorli J.V., Francés F., Coltell O., González J.I., Sáiz C., Corella D.: Effect of genetic variation in the leptin gene promoter and the leptin receptor gene on obesity risk in a population-based case-control study in Spain. Eur J. Epidemiol. 2006; 21(8): 605-12. [38] van der Vleuten G.M., Kluijtmans L.A., Hijmans A., Blom H.J., Stalenhoef A.F., de Graf J.: The Gln223Arg polymorphism in the leptin receptor is associated with familial combined hyperlipidemia. Int. J. Obes.(Lond) 2006; 30(6): 892-8. [39] Wauters M., Mertens I., Chagnon M., Rankinen T. et al: polimorphism in the leptin receptor gene, body composition and fat distribution in overweight and obese women. Int J Obes Ralat Metab Disord 2001;25(5):714-20. [40] Paracchini V., Pedotti P., Taioli E.: Genetics of Leptin and Obesity: A HuGE Review. American Journal of Epidemiology 2005; 162(2): 101-114. [41] Endo K., Yanagi H., Hirano C., Hamaguchi H., Tsuchiya S., Tomura S.: Association of Trp64Arg polymorphism of the beta3- -adrenergic receptor gene and no association of Gln223Arg polymorphism of the leptin receptor gene in Japanese schoolchildren with obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 2000; 24(4): 443-9. [42] Guizar-Mendoza J.M., Amador-Licona N., Flores-Martinez S.E., López-Cardona M.G., Ahuatzin-Trémary R., Sánchez-Corona J.: Association analysis of the Gln223Arg polymorphism in the human leptin receptor gene, and traits related to obesity in Mexican adolescents. J Hum Hypertens. 2005; 19(5): 341-6. 44