Rozpraszanie światła Światło fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego (400-700nm) strumień fotonów E.Banachowicz 1
Natura falowa światła E z (t)=e o sin(2πυt-ky) H x (t)=h o sin(2πυt-ky) E o,h o - amplitudy υ - częstotliwość k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa Natura falowa światła w liczach: prędkośćświatła c=2,9979 10 8 m/s długość fali λ=(390-780)nm (nm = 10-9 m = 10Å) częstotliwośćυ= (7,7-3,8) 10 14 Hz (fioletowe-czerwone) licza falowa (częstośćυ=1/λ) 25000-13000 cm -1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: 10-100Å (1-10 nm) E.Banachowicz 2
Natura korpuskularna światła promieniowanie EM jest strumieniem fotonów E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν Hemogloina ma kolor czerwony! - silnie asoruje promieniowanie żółte, zielone i nieieskie a przepuszcza czerwone Zaasorowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm) to energia 3,61 10-19 J Rozpraszanie światła http://www.wyatt.com/theory/ Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłem promieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność E.Banachowicz 3
Cechy promieniowania rozproszonego Intensywność (natężenie), I I ~ E o 2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I ~λ -4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe) I zależy od kąta rozpraszania θ Częstość: równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne Dlaczego nieo jest nieieskie? E.Banachowicz 4
Dlaczego nieo jest nieieskie! I ~ 1/λ 4 (700 nm / 400 nm) 4 = 1.75 4 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słaiej niż fioletowe. Dlaczego nieo jest nieieskie! I ~ 1/λ 4 (700 nm / 400 nm) 4 = 1.75 4 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słaiej niż fioletowe. E.Banachowicz 5
Rozpraszanie w roztworze V Eo, λo v r ks θ ki q v R ES P v-mikroskopijnie mały element ojętości zawierający molekuły rozpraszające światło, k i, k s wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt oserwacji natężenia pola elektrycznego E s, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, k i i k s są soie równe, q = k i - k s = 2πn/λsin(θ). Częstotliwośćświatła rozproszonego Częstotliwość: równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływaniezmiana stanu energetycznego atomu lu cząsteczki!!ale zmiana częstotliwość może wyniknąć z ruch cząsteczek rozpraszających - efekt Doplera E.Banachowicz 6
Zmiana częstotliwości Widmo światła rozproszonego E.Banachowicz 7
Fluktuacje natężenia Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentu Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) SLS (Statyczne Rozpraszanie Światła) Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fary- Perota) Fluktuacje natężenia światła rozproszonego DLS lu PCS (Dynamiczne Rozpraszanie Światła lu Spektroskopia Korelacji Fotonów) E.Banachowicz 8
Układ pomiarowy próka θ I λ, I i laser I st - standard (enzen, toluen) detektor I o - rozpuszczalnik (uffor) I - roztwór (iałka, DNA, etc.) q = 2πn/λsin(θ) Układ pomiarowy E.Banachowicz 9
gdzie: Rozpraszanie promieniowania Natężenie promieniowania rozproszonego I(q): R R = Θ Θ = R st I I I st KMcP( q) S( q) o n n o st 2 2 4πno dn K = 4 N λ dc R Θ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa) A 2 E.Banachowicz 10
Rozpraszanie statyczne w roztworze Kc/R siła jonowa 1/M R = Θ KMcP( q) S( q) c Kc R Θ = 1 + 2 B M 22 c P(q) 1 (interferencje wewnątrzcząsteczkowe) S(q) interferencje międzycząsteczkowe Indykatrysy rozpraszania światła I(θ) P(q) Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d << λ Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d λ E.Banachowicz 11
Rozpraszanie statyczne w roztworze I(θ) P(q) 1/I α tg α = 1/3 q 2 R g 2 q 2 P(q) interferencje wewnątrzcząsteczkowe ~ R g 1 Oliczone czynniki kształtu dla trzech rył o takiej samej ojętości P(q) 0.1 0.01 kula kula wydrążona pałeczka Wymiary: R = 10 nm R = 17.7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm 1E-3 0.01 0.1 1 q / nm E.Banachowicz 12
Rozpraszanie dynamiczne światło rozproszone światło lasera widmo I ω I ω natężenie g(τ) t g(τ) t funkcja korelacji τ τ E.Banachowicz 13
Spektroskopia Korelacji Fotonów (Photon Correlation Spectroscopy - PCS) Zastosowanie do adań sumikrosopowych oiektów iologicznych. Co można zmierzyć: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (D T ): makrocząsteczek iologicznych (iałka, kwasy nukleinowe), iologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z łony lipidowej, asocjaty iałkowe, mniejsze komórki) G(t) = <I(0)I(t)> g (2) (t) = 1 + exp(-2 q 2 D T ). Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS) Pomiar D T - informacje o rozmiarze i kształcie oiektu rozpraszającego kula elipsoida orotowa pałeczka model kulkowy D T = k B T/(6πηR H ) E.Banachowicz 14
Spektroskopia Korelacji Fotonów Z zależności D T od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między oiektami. D T odpychanie kompensacja przyciąganie c Kula -najprostszy model hydrodynamiczy D T = kt/(6πηr H ) Interpretacja np. np. współczynnika dyfuzji dyfuzji (+) (+) Rozmiar (?) (?) Kształt Kształt (?) (?) Upakowanie (?) (?) Hydratacja R H E.Banachowicz 15
Kominacja R H z v 2 iδ 1 v 1 V h = V o = V H2O (ojętość hydratowanego iałka) V o = (M w /N A )v 2 (ojętość suchego iałka) V H2O = δ 1 (M w /N A )v 1 (ojętość dołączonej wody) V h = h (M (M w /N w /N A )(v A )(v 2 + 2 δ 1 v 1 1 ) 1 ) R h = h [(3/4π)V h ]1/3 h ] = [(3/4π)(M w /N /N A )(v )(v 2 +δ 2 1 v 1 1 )] 1 )] 1/3 1/3 vv 2-2 -ojętość ojętośćwłaściwa właściwacząsteczki, cząsteczki, dla dla iałek iałek 0.69-0.75 0.69-0.75 (cm (cm 3 /g), 3 /g), średnio średnio 0.73 0.73 (cm (cm 3 /g) 3 /g)[na [na podstawie podstawie sekwencji] sekwencji] δ 1-1 -hydratacja, dla dla iałek iałek 0.2-0.6 0.2-0.6 (g (g H 2 O/g 2 O/g iałka), iałka), średnio średnio 0.35(g 0.35(g H 2 O/g 2 O/g iałka) iałka) [na [na podstawie podstawie sekwencji] sekwencji] vv 1 1 ojętość ojętośćwłaściwa właściwawody wody związanej związanej z z makrocząsteczką, makrocząsteczką, vv 1 = 1 0.9058(cm 0.9058(cm 3 /g) 3 /g) R H = R hh F a a Lizozym - model elipsoidy η N A 0.0102 g/cm s 6.02E+23 1/mol k B 1.38E-16 g cm2/s2k M w 14300.00 MU v 2 0.73 v 1 0.99009901 δ1 0.2 a a D T 1.14E-06 cm2/s R H 1.846E-07 cm R h 1.739E-07 cm R o 1.605E-07 cm f 3.549E-8 kt/d f h 3.344E-8 6πηR o f/f h 1.0612 max δ 1 0.1439 g/g F przy δ 1 1.06123 el.wydł. el.spłaszcz. a(wydl.) (wydl.) a(spl.) (spl) 0.442 /a 2.312 /a 30.0E-8 cm 13.3E-8 cm 09.9E-8 cm 23.0E-8 cm E.Banachowicz 16
a a d L Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) ędą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej) Kominacje różnych parametrów parametry hydrodynamiczne D T - współczynnik dyfuzji S - współczynnik sedymentacji τ - czas relaksacji rotacyjnej [η] - graniczna licza lepkościowa informacje M w (masa), R H, R g (rozmiar), υ 1, ρ (ojętość właściwa, hydratacja) a/ (kształt) giętkość stopień asocjacji E.Banachowicz 17
Kominacja parametrów D T i D R (lu τ ) S i D T D T i [η] D T i R g p=/a lu p=l/d + informacje o ojętości właściwej i hydratacji Proste modele hydrodynamiczne elipsoida orotowa wydłużona (p=a/) elipsoida orotowa spłaszczona (p=a/) BPTI pałeczka (cylinder) (p=l/d) aktyna 20mer DNA E.Banachowicz 18
Modele kulkowe Wymagają informacji o udowie (np. z NMR lu krystalografii) (F = -fv) i F i = ξ u v ), i = 1, 2,..., N i ( i i v i D T = kt Ξ -1 Programy oliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego: HYDRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydro/hydro.htm HYDROPRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm HI4 (R. Pastor - u autora) Różne typy modeli kulkowych a) c) ) a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, ) model kulkaaminokwas inhiitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglouliny IgG3. E.Banachowicz 19
Model powłokowy Kulka na atom pierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model) powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model) Kulka na aminokwas 4.5 Å 4.5 Å 2.6 Å 2.6 Å E.Banachowicz 20
Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd Podsumowanie Informacje najczęściej wykorzystywane w adaniach iologicznych: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (D T ), Promień hydrodynamiczny (R h ), Licza składników w roztworze, Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osono) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), Zjawiska asocjacji i agregacji, Kinetyka agregacji, Oddziaływania w roztworze, Ładunek efektywny cząsteczek, Mody drgań wewnętrznych dla dużych oiektów (np. długie fragmenty DNA), Kształt dużych oiektów (czynnik kształtu pomiary kątowe). E.Banachowicz 21
Koniec Zadania E.Banachowicz 22