Wielkość oraz liczba pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako potencjalne biomarkery uszkodzenia nerek u chorych na cukrzycę Kraków, 4 marca 2016 mgr inż. Agnieszka Kamińska Zakład Fizyki Medycznej Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej UJ Promotor: prof. Ewa Stępień
Plan wystąpienia: 1.Wprowadzenie Formowanie, cechy oraz źródła mikropęcherzyków w ludzkim ciele Mikropęcherzyki jako biomarkery Płyny ustrojowe (osocze, mocz) jako dobre źródło mikropęcherzyków 2. Cel naszych badań 3. Badania kliniczne 4. Metodologia: TRPS, czasowo-rozdzielcza fluorescencja 5. Wyniki 6. Podsumowanie i wnioski
Zmiany w liczbie publikacji dotyczących mikropęcherzyków w ciągu ostatnich 15 lat, PubMed
1. Wprowadzenie Proces formowania mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych A THOUSAND WORDS ABOUT MICROPARTICLES IN CARDIOLOGY M. Konkolewska, S. Kurc, E. Stępień, Journal of Medical Science 2 (83) 2014
Egzosomy vs. Mikropęcherzyki Egzosomy Mikropęcherzyki Rozmiar 30 100 nm 100 nm 1 μm Skład lipidowy cholesterol sfingomielina ceramidy, PS, tratwy lipidowe sfingomielina, PS, PA, kwas arachidonowy Białka DNA, mrna, microrna, integryny, białka z rodziny tertraspanin (CD9, CD81, CD63), białka szoku cieplnego (HSPs), GTPazy, aneksyna, flotilina Cell adhesion proteins (VEcadherin, E-selectin, sialomucin), DNA, mrna, mirna
Źródła mikropęcherzyków: - płytki krwi - komórki śródbłonka - komórki macierzyste - komórki nowotworowe - erytrocyty Gdzie możemy je znaleźć? - osocze - mocz - płyn mózgowo-rdzeniowy - medium komórkowe Zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego oraz skaningowego przedstawiające aktywowane płytki krwi oraz komórki śródbłonka, które wydzielają EVs. Zdjęcia: Prof. Ewa Stępień
Funkcje: a) proces krzepnięcia krwi b) sygnalizacja międzykomórkowa - immunosupresja - prezentacja antygenów - transfer komponentów sygnalizacyjnych - stan zapalny - angiogeneza c) adhezja komórkowa Zastosowania kliniczne: - terapia - prognozowanie - biomarkery chorób M. Konkolewska, S. Kurc, E. Stępień A thousand words about micropartocles in cardiology. Journal of Medical Science 2 (83) 2014
Mocz jako dobre źródło mikropęcherzyków: łatwa dostępność nieinwazyjne pobranie względnie wysoka koncentracja pęcherzyków przy niskim zanieczyszczeniu dobrze zdefiniowane kryteria oceny dobrze poznane protokoły izolacji E. Van der Pol, A.G. Hoekstra, A. Sturck, C. Otto, T.G. van Leeuwen, R. Nieuwland. Optical and nonoptical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. J. Thromb. Haemost. 8 (12), 2596-2607 (2010)
Rola podocytów w generowaniu EVs http://sciencenaturalphenomena.blogspot. com/2009/11/glomerulus.html Genes and podocytes new insights into mechanisms of podocytopathy A. Bierzyńska, K. Soderquest, A. Koziell; Front. Endocrinol, 23 January 2015
2. Cel naszych badań Znalezienie związku między liczbą i rozmiarem mikropęcherzyków występujących w moczu a stopniem zaawansowania choroby nerek u pacjentów z cukrzycą II typu.
3. Badanie kliniczne PACJENCI Pacjenci z uregulowaną cukrzycą (CD) n=24 Pacjenci z nieuregulowaną cukrzycą (UD) n=36 Pacjenci cukrzycowi bez powikłań nerek (NRF) n=45 Pacjenci cukrzycowi z powikłaniami nerek (RF) n=15 Kryteria podziału: CD HbA1c <7% UD HbA1c >7% NRF GFR > 60 ml/min/1.73 m 2 RF GFR < 60 ml/min/1.73 m 2
Table 1. Clinical characteristics, blood, and urine biochemistry of study groups: C, CD, UD C n=12 CD n=24 UD n=36 p-value Age [years] 49 (11) 62 (15) 61 (12) 0.0066 Gender [Male/Female] 6/6 17/7 23/13 - Serum glucose [mmol/l] 5.2 (4.9-5.4) 6.8 * (5.9-7.9) 9 * (7.4-12) <0.0001 Urine albumin [mg/l] 6.2 (4.3-11) 6.3* (2-22) 37 * (12-267) <0.0001 Urine creatinine [mmol/l] 12 (9-17) 5.4 (4.2-9) 6.8 (4.8-11) 0.0037 Serum creatinine [umol/l] 72 (63-83) 77 (67-98) 79 (62-108) 0.4567 GFR [ml/min/1.73m 2 ] 84 (77-96) 77 (59-95) 79 (59-97) 0.5623 EVs density [number/ml] 5.2E10 (2.7E10-2.3E11) 8.4E10 (3.9E10-1.7E11) 5.2E10 (2.6E10-1.5E11) 0.5049 EVs mode diameter [nm] 106 (104-109) 115 * (107-118) 109* (106-112) 0.0140 EVs mean diameter [nm] 123 (4) 134 (11) 129 (8) 0.0049
Table 2. Clinical characteristics, blood, and urine biochemistry of study groups: C, RF, NRF C n=12 RF N=15 NRF N=45 p-value Age (years) 49 (11) 69 (11) * 60 (3) * 0.0003 Gender (Male/Female) 6/6 15/3 25/17 - Serum glucose [mmol/l] 5.2 (4.9 5.4) 8.7 (6.5-11) 7.9 (6.5-10) <0.0001 Urine albumin [mg/l] 6.2 (4.3-11) 51 (7-359) 14 (4-58) 0.0708 Urine creatinine [mmol/l] 12 (9-17) 5.9 (4.5-8.1) 7.8 (4.4-11) 0.0031 Serum creatinine [umol/l] 72 (63-83) 119 * (111-123) 73* (60-84) <0.0001 GFR [ml/min/1.73m 2 ] 84 (77-96) 49 * (39-55) 89* (73-105) <0.0001 EVs density [number/ml] 5.2E10 (2.7E10-2.3E11) 2.6E10* (2.0E10-8.2E10) 8.7E10* (4.0E10-1.9E11) 0.0358 EVs mode diameter [nm] 106 (104-109) 111 (105-115) 109 (107-115) 0.1274 EVs mean diameter [nm] 122 (120-127) 129 (126-136) 129 (123-129) 0.0087
4. Metody Tunable Resistive Pulse Sensing (qnano) Extracellular Vesicle Characterisation with Tunable Resistive Pulse Sensing, Izon Science
Tunable Resistive Pulse Sensing (qnano) Kuleczki polistyrenowei
Fluorescencja czasowo-rozdzielcza oznaczenie CD81 Schematic for TRIFic exosome assay. http://www.cellgs.com/shop/exosomes/trific-exosome- Assay/1653-CD81-TRIFic-exosome-assay-kit.html
5. Wyniki - TRPS Liczba EVs vs. poziom glukozy
5. Wyniki - TRPS Liczba EVs vs. stężenie kreatyniny
5. Wyniki Fluorescencja czasowo-rozdzielcza
6. Wnioski: Konieczność poszukiwania nowych, bardziej czułych biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek u chorych na cukrzycę Liczba oraz rozmiar EVs obecnych w moczu może stać się potencjalnym biomarkerem uszkodzenia nerek Mniejsza liczba mikropęcherzyków u pacjentów cukrzycowych z powikłaniami nerek może być związana z postępującą arteriosklerozą kłębuszków nerkowych Negatywna korelacja między liczbą mikropęcherzyków a poziomem glukozy u pacjentów z nieuregulowaną cukrzycą oraz u pacjentów z powikłaniami nerek, może być związana z rozwojem hiperglikemii u tych pacjentów
Podziękowania Promotor: prof. Ewa Stępień Zakład Fizyki Medycznej Dr Mark Platt Wydział Chemii Loughborough University Badania kliniczne: mgr Aleksandra Tokarz dr Beata Kuśnierz-Cabala Ketedra Biochemii Klinicznej Collegium Medicum UJ
Dziękuję za uwagę