Płynna biopsja jako nowa metoda diagnostyczna w chorobach wątroby

Transkrypt

1 Płynna biopsja jako nowa metoda diagnostyczna w chorobach wątroby Dr. Marcin Krawczyk 1 Laboratorium Chorób Metabolicznych Wątroby, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, Saarland University, Homburg, Germany

2 Mikrocząsteczki komórkowe - ang. extracellular vesicles (EVs) Opisane po raz pierwszy w roku 1967 przez Wolf et al jako platelet dust, zanieczyszczenie Analizy przy pomocy FACS i proteomiki pozwoliły w ostatnich latach na dokładną charakterystykę EVs EVs są uwalnianymi przez komórki nośnikami bioaktywnych czynników (np. białek, kwasy nukleinowe, mirna) Możliwość zastosowania jako nieinwazyjnych biomarkerów w onkologii tzw. liquid biopsy Julich et al., Front. in Immunology 2016

3 Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013

4 Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Eksosomy: <100 nm Uwalniane z wnętrza komórek Analiza: proteomika Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013

5 Rak wątrobowokomórkowy - HCC Najczęstszy nowotwór wątroby, stanowi 90% pierwotnych nowotworów wątroby. HCC stanowi 7% wszystkich nowotworów złośliwych Rocznie na świecie rozpoznaje się ok. 750 tysięcy nowych zachorowań na HCC. Liczba rozpoznań HCC i zgonów związanych z tym nowotworem wyniosła w 2008 r. w Europie odpowiednio 65 tysięcy i 60 tysięcy. EASL 2012

6 Cholangiocarcinoma (CCC) Drugi najczęstszy nowotwór pierwotny wątroby Rosnąca liczba zachorowań Banales JM, et al. Nature Reviews G&H 2016

7 Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013

8 1. Czy istnieje panel mikrocząsteczek komórkowych charakterystyczny dla nowotworów wątroby? 2. Czy mikrocząsteczki mogą być użyte do monitorowania efektów leczenia onkologicznego?

9 Metodyka: rok 2016, panel mirocząsteczek rak jelita grubego 3-4 ml blood 1 ml serum ultracentrifugation and enrichment for MPs EpCAM+ tamps CD147+ tamps EpCAM+CD147+ tamps Minimal invasive sampling MP preparation MP profiling Willms / Kornek Oncorarget 2016

10 W poszukiwaniu nowych antygenów: CD133 and ASGPR1

11 EpCAM + ASGPR1 + CD133 + tamps

12 Porównanie marskość vs. nowotwory wątroby

13 Potencjalne zastosowanie EVs w klinice Julich-Haertel*, Urban*, Krawczyk*, et al. J Hepatol. 2017

14 Mikrocząsteczki komórkowe Microvesicles: Mikrofragmenty komórkowe nm Obłonione pęcherzyki uwalniane z powierzchni komórek Analiza: FACS Eksosomy: <100 nm Uwalniane z wnętrza komórek Analiza: proteomika Raposo / Stoorvogel J. Cell Biol. 2013

15 Rola mikrocząsteczek komórkowych (eksosomów) w diagnostyce CCA Arbelaiz, Azkargorta, Krawczyk, et al. Hepatologyl. in press

16 Hipoteza Eksosomy mogą zawierać w sobie markery PSC, CCA i HCC Mikrocząsteczki związene z CCA mogą zawierać w sobie proteiny związane z progresją guza Electron microscopy (TEM) 100 nm

17 Proteomika Ctrl Ctrl 126 PSC CCA HCC Group # proteins (EV) Healthy controls 541 PSC 427 CCA 574 HCC 399

18 Porównanie eksosomów: CCC vs. kontrole Control (n=43) CCA (n= 32) CCA (n=43) vs Control (n=32) CCA I-II (n=13) vs Control (n=22) Protein SEN SPE AUC p value Protein SEN SPE AUC p value AMPN <0.001 VNN <0.001 PIGR <0.001 IGHA <0.001 CRP <0.001 GGT <0.001 IGHA <0.001 FIBG <0.001 NEP <0.001 GPC5C <0.001 CA <0.001 PIGR <0.001 AMPN <0.01 FIBG <0.01 IGHG <0.01 IGHA <0.01 LG3BP <0.01 HV <0.01 A1AT <0.01 IGHA <0.01 SAMP <0.01 CA <0.001 Fold change

19 Porównanie eksosomów: PSC vs. kontrole Control n=43 PSC n=30 PSC (n=30) vs Control (n=32) Protein SEN SPE AUC p value AMPN <0.001 FCN <0.001 NEP <0.001 PIGR VNN GPC5C <0.01 IGHM <0.01 KV <0.01 A2MG <0.01 Fold change BAIP <0.01

20 Porównanie eksosomów: PSC vs. CCC PSC n=30 CCA n= 32 Protein CCA (n=43) vs PSC (n=30) SEN SPE AUC p value Protein CCA I-II (n=13) vs PSC (n=30) SEN SPE AUC p value Fold change FIBG <0.001 A1AG <0.001 S10A <0.001 S10A <0.001 SAMP FIBB GGT <0.01 CRP <0.01 FCN <0.01 IGHA <0.01 CA <0.001 FCN <0.001 ITIH <0.001 FIBG <0.001 IC <0.01 SAMP <0.01 LBP <0.01 CO <0.01 LRP <0.01 MASP <0.01 PROS <0.01 CA <0.05

21 Porównanie eksosomów: HCC vs. kontrole Control n=43 HCC (n=29) HCC (n=29) vs Control (n=32) icca (n=12) vs HCC (n=29) Protein SEN SPE AUC p value Protein SEN SPE AUC p value Fold change LG3BP <0.001 PIGR <0.001 A2MG <0.001 IGHG <0.001 FIBG HV <0.01 SPTB <0.01 LV <0.01 APOE <0.01 AMPN ,704 <0.01 AFP <0.001 FIBG <0.001 A1AG VTDB CRP <0.01 VNN <0.01 A1BG <0.01 FIBB <0.01 CO <0.05 GPC5C <0.05 CA <0.01 *AFP <0.05

22 Proteomika Nowe markery mogą być wykryte w serum Control PSC CCA EV Total serum EV Total serum EV Total serum PIGR AMPN CRP

23 Analiza eksosomów vs. MRT MRI Initial timepoint 1 month 2 months Human proteins in serum EV Alpha-2-macroglobulin Galectin-3-binding protein Fibronectin Complement C3 Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase Pyruvate kinase PKM Clusterin Alpha-enolase Annexin A1

24 Podsumowanie 1. Mikrocząsteczki komórkowe stanowią nowe markery w nowotworach wątroby. 2. Eksosomy zawierają w sobie proteiny która są związane z progresją nowotworów wątroby. Dodatkowe badania są potrzebne w celu określenia ich roli w terapii nowotworów. 3. Płynna biopsja pozwala na dokładną diagnostykę oraz monitorowanie terapii.

25 San Sebastian and Homburg

26 Dziękuję za uwagę! Piotr Milkiewicz Marek Krawczyk Beata Kruk Frank Lammert