MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 163-168 Beata Cieśluk, Tomasz Dzieciątkowski, Anna Majewska, Mirosław Łuczak ANALIZA WRAŻLIWOŚCI IN VITRO KLINICZNYCH IZOLATÓW HERPESWIRUSA CZŁOWIEKA TYPU 1 (HIV-1) NA ACYKLOWIR I CIDOFOWIR Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. n. med. M. Łuczak Wirus opryszczki jest ludzkim patogenem odpowiedzialnym za zakażenia o łagodnym jak i ostrym przebiegu. Intensywne używanie leków przeciwwirusowych, w szczególności acyklowiru prowadzi do powstawania i selekcji szczepów opornych. W niniejszej pracy określono i porównano wrażliwość klinicznych izolatów wirusa opryszczki typu 1 na acyklowir i cidofowir. Zakażenia wirusami opryszczki typu 1 i 2 (HHV-1 i 2, określanymi potocznie jako HSV-1 i HSV-2 (4) należą do najpowszechniejszych chorób o etiologii wirusowej i występują na całym świecie (20). Do zakażenia dochodzi w wyniku bezpośredniego kontaktu, podczas gdy wrota zakażenia stanowi błona śluzowa lub uszkodzona skóra. Typ pierwszy wirusa kojarzony jest z powszechnie występującą opryszczką wargową, natomiast HHV-2 z opryszczką narządów płciowych (8). Jakkolwiek każdy z nich może powodować klinicznie nierozróżnialne zakażenia, będące często wynikiem autoinokulacji, transmisji wertykalnej lub kontaktów oralno-genitalnych (7, 20). Po pierwotnym zakażeniu, wirus zwykle ustala stan latencji w zwojach trójdzielnych (HHV-1) i lędźwiowo-krzyżowych (HHV-2) (20). Leczenie zakażeń wywołanych wirusem opryszczki ma na celu przede wszystkim skrócenie czasu trwania infekcji pierwotnej i profilaktykę zakażeń nawrotowych. Przełomem stało się odkrycie acyklowiru (ACV) - wysoce selektywnego inhibitora, który stał się standardem w leczeniu zakażeń α-herpeswirusami (5). Jego aktywność przeciwwirusowa zależna jest od metabolizmu zakażonych komórek, w których przebiega pierwszy etap aktywacji leku. Przemianę ACV do monofosforanu acyklowiru przeprowadza kinaza tymidynowa (TK) wirusa, stąd swoistość leku do komórek zakażonych α-herpeswirusami (11). Następne fosforylacje, przeprowadzane przez kinazy komórkowe, powodują, że stężenie aktywnej formy jest od 40 do 100 razy wyższe w komórkach zakażonych wirusem w odróżnieniu do komórek niezakażonych. W 95% przypadków oporność patogenów na acyklowir związana jest z mutacją w genie kinazy tymidynowej (11). Alternatywą w leczeniu zakażeń wirusem opryszczki powodowanych przez szczepy oporne na ACV jest między innymi cidofowir (CDV) (19). Aktywacja leku przeprowadzana jest wyłącznie przez kinazy komórkowe, niezależnie od enzymów wirusowych (3). Jakkolwiek poważnym ograniczeniem do stoso-
164 B. Cieśluk i inni Nr 2 wania cidofowiru jest jego duża nefrotoksyczność (3), zaletą zaś brak konieczności częstego podawania leku w celu podtrzymywania aktywności przeciwwirusowej. Celem pracy było określenie i porównanie wrażliwości klinicznych izolatów wirusa opryszczki typu 1 na acyklowir i cidofowir. MATERIAŁ I METODY Ocenie wrażliwości na leki przeciwwirusowe poddano 46 szczepów wirusa HHV-1. Dwadzieścia sześć izolatów (56%) pochodziło od osób stanowiących grupę kontrolną, tj. pacjentów bez leczenia immunosupresyjnego, natomiast 20 (44%) od pacjentów poddanych immunosupresji (osoby z zaburzeniami hematologicznymi, pacjenci po przeszczepie nerki lub wątroby). Materiał do izolacji wirusa stanowiły wymazy pobrane ze zmian na skórze lub błonach śluzowych o przypuszczalnej etiologii herpes labialis i herpes genitalis. Do izolacji wirusów z pobranych próbek klinicznych używano linii komórkowej Vero, którą wykorzystywano następnie do określenia wrażliwości szczepów na preparaty przeciwwirusowe. Komórki Vero zakażone materiałem klinicznym inkubowano codziennie oceniając codziennie efekt cytopatyczny (CPE). Hodowle, w których po kolejnych 4-5 pasażach nie stwierdzono efektu cytopatycznego uznawano za ujemne. Supernatant z hodowli dodatniej, wykazującej CPE, zbierano i przechowywano w temperaturze -70ºC. Zebrany w ten sposób materiał (n=98) wykorzystywano do identyfikacji i różnicowania wirusów opryszczki metodą PCR. Izolację DNA z supernatantu zakażonych hodowli komórkowych przeprowadzono przy użyciu zestawu QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen ) zgodnie z zaleceniami producenta. Całkowity DNA izolowano z 200 µl materiału, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 100 µl buforu elucyjnego. Reakcja łańcuchowej polimeryzacji w kierunku wykrycia i różnicowania typu 1 od 2 ludzkiego herpeswirusa odbywała się według Kimury (10) w końcowej objętości 50 µl z użyciem 10 µl wyizolowanego DNA. DNA szczepów laboratoryjnych PT366 (HHV-1) i PT368 (HHV-2) służyło za kontrolę dodatnią. Kontrolę ujemną stanowiło DNA izolowane z niezakażonej linii Vero. Rozdziału produktów dokonano drogą elektroforezy w 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Wizualizację przeprowadzano przy świetle ultrafioletowym za pomocą transiluminatora UV. Oznaczenie miana zakaźnego wirusów HHV-1 wykonano wg Reed i Muench (16) i wyrażano w TCID 50 /ml. In vitro wrażliwość izolatów HHV-1 na acyklowir i cidofowir została określona metodą redukcji miana (YRA, yield reduction assay). Hodowle komórkowe Vero po godzinnej inkubacji z wirusem HIV-1(100 TCID 50 /ml ) a następnie trzykrotnym przepłukaniu PBS poddawano inkubacji z szeregiem rozcieńczeń badanego inhibitora (ACV od 4 μg/ml do 0,016 μg/ml; CDV od 64 μg/ml do 0,25 μg/ml). Badane związki przygotowywano rozcieńczając je w 2% FBS (płodowa surowica bydlęca). Hodowlę kontrolną stanowiły komórki zakażone wirusem z dodatkiem pożywki utrzymującej. Po 24-godzinnej inkubacji komórki poddawano trzykrotnie procesowi zamrażania i odmrażania, a następnie wirowano. Zebrane supernatanty służyły do określenia zakaźnego miana wirusów w TCID 50 /ml (16) w hodowlach poddanych działaniu testowanych związków oraz w hodowlach kontrolnych. Przeciwwirusową aktywność ACV i CDV oceniano na podstawie redukcji miana zakaźnego wirusa w hodowlach poddanych działaniu związków w stosunku do hodowli kontrolnych i wyrażano
Nr 2 Wrażliwość na acyklowir i cidofowir herpeswirusa typu 1 165 jako stężenie substancji hamujące namnażanie wirusa w 50% (stężenie hamujące IC 50 w μg/ ml). Doświadczenia powyższe wykonywano w trzykrotnych powtórzeniach. Jako wzorzec herpeswirusa typu 1 zastosowano szczep laboratoryjny McIntyre pochodzący z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej Akademii Medycznej w Warszawie. WYNIKI W badaniu metodą PCR obecność specyficznych sekwencji HHV-1 wykryto w 46 próbkach, 2 kolejne były dodatnie w kierunku HHV-2, zaś pozostałe 50 próbek było ujemnych. Materiały dodatnie w kierunku HHV-1 (n=46) wykorzystano następnie do dalszych eksperymentów. IC 50 ACV dla dwudziestu pięciu (54%) izolatów HHV-1 wynosiło poniżej 3 μg/ml przy czym szczepy te wykazywały również wrażliwość na cidofowir. Dwadzieścia (43%) izolatów wirusa było hamowanych przez ACV w stężeniu < 1 μg/ml. W przypadku cidofowiru tylko jeden szczep wirusa opryszczki był hamowany w stężeniu poniżej 1 μg/ml, pozostałe izobaty HHV-1 wykazywały IC 50 poniżej 20 μg/ml. Spektrum wrażliwości HHV-1 na obydwa preparaty jest szerokie i wynosi dla acyklowiru od 0,15 do 2,7 μg/ml, dla cidofowiru od 0,73 do 26,25 μg/ml. Podając analizie statystycznej otrzymane wyniki (zastosowano program STATISTICA 6) wykazano różnicę statystycznie istotną przy P<= 0,05 pomiędzy acyklowirem i cidofowirem w grupie pacjentów kontrolnych i w grupie pacjentów poddanych immunosupresji oraz pomiędzy cidofowirem w obu grupach pacjentów. Nie stwierdzono różnicy statystycznie istotnej w przypadku aktywności acyklowiru wobec wirusów izolowanych od obu grup osób. Odsetek wrażliwych i opornych szczepów HHV-1 pochodzących od grupy kontrolnej pacjentów oraz pacjentów poddanych immunosupresji jest zbliżony. W grupie kontrolnej 13 izolatów wirusa (50%) było hamowane w stężeniu 0,22 2,7 μg/ml, z czego 9 szczepów (70%) oznaczało się wrażliwością na ACV poniżej 1 μg/ml. W przypadku szczepów HHV-1 uzyskanych od pacjentów poddawanych immunosupresji zakres IC 50 ACV dla 12 izolatów HHV-1 (60%) wynosił 0,15 1,45 μg/ml i tylko jeden szczep był hamowany w stężeniu powyżej 1 μg/ml (Tabela I). Tabela 1. Wartości IC 50 acyklowiru i cidofowiru dla wszystkich izolatów klinicznych HHV-1 w dwóch grupach pacjentów. Acyklowir Cidofowir Średnia IC 50 Zakres Średnia Zakres μg/ml μg/ml HHV-1 z grupy immunokompetetnej 0,93 0,22-2,7 12,28 4,92 26,25 HHV-1 z grupy poddanej immunosupresji 0,53 0,15 1,45 7,92 0,73 23,24 McIntyre 0,68 0,60-0,75 28,18 26,49-29,29 IC 50 CDV dla szczepów HHV-1 grupy kontrolnej pacjentów wynosiło 12,28 μg/ml, natomiast 12 izolatów wirusa pochodzących od pacjentów poddanych immunosupresji było hamowane przez CDV w stężeniu 0,73 23,24 μg/ml (Tabela I). Jeden z izolatów HHV-1 zachowywał wrażliwość na cidofowir porównywalną ze szczepem wzorcowym, ale był IC 50
166 B. Cieśluk i inni Nr 2 oporny na acyklowir. Porównując wartości IC 50 acyklowiru i cidofowiru dla wszystkich szczepów wirusa opryszczki typu 1 zauważono, że najniższe stężenie acyklowiru, tj. 0,15 μg/ ml jest około 5 razy mniejsze od najniższego stężenia cidofowiru, wynoszącego 0,73 μg/ml niezbędnego do zahamowania replikacji wirusa. Z drugiej strony najwyższe stężenie acyklowiru wymagane do zahamowania replikacji izolatów klinicznych HHV-1 jest około 10x mniejsze od najwyższej hamującej wartości IC 50 cidofowiru (Tabela I) DYSKUSJA Wirus opryszczki pospolitej jest ważnym ludzkim patogenem, odpowiedzialnym za zakażenia występujące na całym świecie. Charakter zakażenia, predyspozycja do nawrotów, intensywność zmian oraz przebieg choroby zależą od funkcjonowania immunologicznego układu gospodarza, zarówno od odpowiedzi humoralnej i komórkowej (15). HHV-1 jest jednym z pierwszych wirusów patogennych dla człowieka, którego zakażenia leczono lekami przeciwwirusowymi i jednym z pierwszych, u którego zajmowano się zjawiskiem oporności na leki przeciwwirusowe (9). Oporność na ACV związana jest przede wszystkim z mutacją w genie kinazy tymidynowej, a szczepy TK - są zazwyczaj oporne na inne związki, których aktywacja zależna jest od wirusowej kinazy tymidynowej. Z drugiej strony izolaty oporne na acyklowir są wrażliwe na widarabinę, foskarnet, trójfluorydynę i cidofowir (3,13). Ten ostatni jest związkiem szczególnie interesującym, ponieważ nie wymaga pierwszego etapu fosforylacji przeprowadzanego przez kinazy wirusowe, może być więc ważną alternatywą w leczeniu zakażeń wirusem opryszczki opornym na acyklowir i foskarnet (17). Za przemianę cidofowiru do pochodnej mono- i dwufosforanowej odpowiedzialne są enzymy komórkowe, stąd fosforylacja związku do aktywnego metabolitu pojawia się niezależnie od obecności wirusa w komórce (3, 17). Według danych piśmiennictwa większość izolatów herpeswirusa typu 1 in vitro jest wrażliwa na acyklowir w stężeniu około 0,1 μg/ml (9), gdzie średnia wartość ID 50 ACV wynosi od 0,04 µg/ml (6) do 0,61 µg/ml (14). Dla porównania, uzyskane w niniejszej pracy wyniki wskazują, że średnia wartość ID 50 acyklowiru dla szczepów HHV-1 izolowanych w Katedrze Mikrobiologii Lekarskiej AM w Warszawie wynosi 0,74 μg/ml (w zakresie stężeń od 0,15 do 2,7 μg/ml). Szerokie spektrum wrażliwości in vitro na lek wśród izolatów otrzymanych od różnych pacjentów może wynikać z obecności mieszanej populacji wirusów w zmianie chorobowej ( tj. wirusów wrażliwych i opornych na leki przeciwwirusowe). Poziom określający oporność szczepów wirusa opryszczki na acyklowir in vitro nie jest jednomyślnie ustalony. Większość badaczy przyjmuje stężenie powyżej 2 μg/ml, pozostali powyżej 3 μg/ml, a jeszcze inni proponują definiowanie szczepu opornego na acyklowir, gdy hamowany jest przez 10-krotnie wyższe stężenie acyklowiru niż szczep wzorcowy (1). W niniejszej pracy tylko dwa izobaty HHV-1 było hamowane przez acyklowir w stężeniu powyżej 2 μg/ml. Natomiast 60% szczepów była hamowana przez acyklowir w stężeniu nie przekraczającym IC 50 ACV dla szczepu kontrolnego HHV-1 McIntyre. Jednym z głównych problemów pojawiających się w określaniu wrażliwości na leki przeciwwirusowe in vitro jest brak korelacji wyników uzyskanych w doświadczeniach in vitro z sytuacją obserwowaną in vivo. Szczepy oporne na acyklowir są bowiem łatwo izolowane in vitro i mogą nawet występować w naturalnej populacji wirionów u pacjentów, którzy
Nr 2 Wrażliwość na acyklowir i cidofowir herpeswirusa typu 1 167 nigdy nie byli leczeni ACV (3). Brak zależności pomiędzy wrażliwością in vitro izolatów i kliniczną odpowiedzią na terapię związany jest również z takimi czynnikami jak zastosowane leczenie przeciwwirusowe, absorpcja i metabolizm związku przeciwwirusowego, odpowiedź immunologiczna pacjenta i heterogenność populacji wirusowej (1). Powszechne stosowanie acyklowiru prowadzi do wzrostu występowania zakażeń szczepami wirusa opryszczki opornymi na lek wśród klinicznych izolatów. Bezpośrednią konsekwencją ich występowania jest rosnąca liczba pacjentów z immunosupresją, u których przedłużająca się terapia przeciwwirusowa przyczynia się do selekcji opornych szczepów, gdzie oporność na acyklowir sięga 30%. Wśród pacjentów zdrowych oporność na ACV jest rzadka (<1% izolatów), a większość opornych szczepów jest wykrywana w przebiegu nawrotowej opryszczki płciowej i waha się od 3,5 do 8,6% (13). W niniejszej pracy nie zauważono istotnej przewagi występowania szczepów opornych wśród izolatów HHV-1 pochodzących od grupy pacjentów poddanych immunosupresji. Zakażenia wywołane opornym na acyklowir szczepem wirusa mogą być leczone foskarnetem lub cidofowirem (19, 21). Jednakże porównując wrażliwość badanych szczepów HHV-1 na powyższe związki zaobserwowano, że cidofowir hamuje replikację wirusów w stężeniu ponad dziesięciokrotnie większym w porównaniu do acyklowiru. Wydaje się być to zgodne z wnioskami innych autorów, że choć cidofowir in vivo wykazuje skuteczność w leczeniu zakażeń o etiologii wirusami HHV-1 i HHV-2 opornymi na ACV, to w warunkach in vitro jest preparatem mniej skutecznym od acyklowiru (5). B. Cieśluk, T. Dzieciątkowski, A. Majewska, M. Łuczak IN VITRO ACYCLOVIR AND CIDOFOVIR SUSCEPTIBILITIES OF HUMAN HERPESVIRUS TYPE 1 CLINICAL ISOLATES SUMMARY Infections with human herpesviruses types 1 and 2 (HHV-1 and HHV-2) are common worldwide and cause a wide range of signs and symptoms. Antiviral drugs, in particular aciclovir are used in therapy of herpetic infections. The aim of the study was determination of susceptibilities of HHV-1 isolates (n+46) for antiviral drugs (acyclovir and cidofovir) in vitro. Swabs taken from different lesions were used for infection of Vero cells and cythopathic effect was observed. Viruses from cell cultures with positive CPE were later identified with in-house PCR and efficacy of acyclovir and cidofovir in HHV-l infected Vero cell monolayer cultures was tested by the yield reduction assay. Obtained data indicate, that aciclovir ID 50 average value for HHV-1 clinical isolates was 0,74 μg/ml the value about 10% greater then described in literature. Similarly in vitro analysis of sensitivity of viruses for cidofovir, shows that concentrating is over ten-fold higher in comparison for aciclovir. PIŚMIENNICTWO 1. Bacon TH, Levin MJ, Leary JJ i inni. Herpes simplex virus resistance to acyclovir and penciclovir after two decades of antiviral therapy. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 114-28. 2. Cassady KA, Whitley RJ. New therapeutic approaches to the alphaherpesvirus infections. J Antimicrob Chemother 1997; 39: 119-28.
168 B. Cieśluk i inni Nr 2 3. Chilukuri S, Rosen T. Management of acyclovir-resistant herpes simplex virus. Dermatol Clin 2003; 21: 311-20. 4. Davison A, EberleR, Hayward GS I inni. Herpesviruses. (w:) Faquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. Virus taxonomy classification and nomenclature of viruses. Eight report of ICTV. Elselvier Academic Press, San Diego 2005, 193-212. 5. De Clercq E, Field HJ. Antiviral prodrugs the development of successful prodrug strategies for antiviral chemotherapy. Br J Pharmacol 2006; 147: 1-11. 6. De Clercq E, Descamps J, Verhelst G i inni. Comparative efficacy of antiherpes drugs against different strains of herpes simplex virus. J Infect Dis 1980; 141: 563-74. 7. Dwyer DE, Cunningham AL: Herpes simplex and varicella-zoster virus infections. MJA; 2002; 177(5): 267-73. 8. Dzieciątkowski T, Majewska A, Krawczyk E i inni. Postacie kliniczne i diagnostyka herpeswirusowych zakażeń skóry. Przegl Derm 2007; 94: 195-200. 9. Field HJ. Herpes simplex virus antiviral drug resistance current trends and future prospects. J Clin Virol 2001; 21: 261-9. 10. Kimura H, Shibata M, Kuzushima K i inni. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol (Berl.) 1990; 179: 177-84. 11. Lee NY, Tang YW, Espy MJ i inni.. Role of genotypic analysis of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus for determination of neurovirulence and resistance to acyclovir. J Clin Microbiol 1998; 37: 3171-4. 12. Ljungman P. Prophylaxis against herpesvirus infections in transplant recipients. Drugs 2001; 61: 187-96. 13. Morfin F, Thouvenot D. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs. J Clin Vir 2003; 26: 29-37. 14. Rabella N, Otegul M, Labeaga R i inni. Antiviral susceptibility of herpes simplex viruses and its clinical correlates: a single center s experience. Clin Infect Dis 2002; 34: 1055-60. 15. Rebora A. Life-threatening cutaneous viral diseases. Clin Dermatol 2005; 23: 157-63. 16. Reed LJ, Muench MA: A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 1938; 27: 483-7. 17. Saint-Léger E, Fillet AM, Malvy D i inni. Efficacy of cidofovir in an HIV infected patient with an acyclovir and foskarnet resistant herpes simplex virus infections. Ann Dermatol Venereol; 2001; 128: 747-9. 18. Stránská R., Schuurman R., Nienhuis E i inni. Survey of acyclovir-resistant herpes simplex virus in the Netherlands: prevalence and characterization. J Clin Virol 2005; 32: 7-18. 19. Waugh SML, Pillay D, Carrington D i inni: Antiviral prophylaxis and treatment (excluding HIV therapy). J Clin Virol 2002; 25: 241-66. 20. Whitley RJ, Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet; 2001; 357: 1513-8. 21. Whitley RJ. New approaches to the therapy of HSV infections. Herpes; 2006; 13: 53-5. Otrzymano: 4 V 2007 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie e-mail: dzieciatkowski@wp.pl