WOJSKOWY INSTYTUT MEDYCZNY Agnieszka WALCZYK Analiza porównawcza wpływu aktywującej mutacji p.v600e w genie BRAF na przebieg kliniczny raka brodawkowatego tarczycy o różnym stopniu zaawansowania choroby Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor: płk prof. dr hab. n. med. Grzegorz KAMIŃSKI Kierownik Kliniki Endokrynologii i Terapii Izotopowej Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie Promotor pomocniczy: dr n.med. Aldona KOWALSKA Kierownik Kliniki Endokrynologii Świętokrzyskiego Centrum Onkologii w Kielcach Praca wykonana w Klinice Endokrynologii Świętokrzyskiego Centrum Onkologii w Kielcach W a r s z a w a 2 0 1 5
STRESZCZENIE Rak brodawkowaty tarczycy jest najczęstszym nowotworem złośliwym gruczołów wydzielania wewnętrznego. Większość chorych po przeprowadzeniu odpowiedniego leczenia osiąga trwałą remisję choroby, ale jest grupa chorych zagrożona niekorzystnym przebiegiem klinicznym raka. Trwają badania nad ustaleniem molekularnych czynników rokowniczych, które mogłyby poprawić stratyfikację ryzyka złej prognozy i wskazać chorych wymagających intensywnego leczenia adekwatnego do spodziewanego agresywnego przebiegu choroby. Aktywująca mutacja p.v600e w genie BRAF jest najczęściej identyfikowanym zaburzeniem genetycznym w komórkach raka brodawkowatego tarczycy i charakteryzuje się dużym potencjałem onkogenetycznym. Badania nad występowaniem tej mutacji w guzie pierwotnym i jej znaczeniem w powstawaniu raka brodawkowatego tarczycy oraz wpływem na przebieg kliniczny choroby prowadziły do niejednoznacznych wniosków. W doniesieniach wykazywano różnice w częstości występowania mutacji w komórkach tego typu raka tarczycy. W części badań stwierdzano związek pomiędzy obecnością mutacji p.v600e w genie BRAF w ognisku pierwotnym nowotworu a agresywnymi cechami raka i śmiertelnością chorych, w innych nie potwierdzano takiej zależności. Optymalizacja postępowania terapeutycznego dla chorych na raka brodawkowatego tarczycy, zarówno wysokiego, jak i niskiego ryzyka niekorzystnej prognozy, szacowanego dotychczas na podstawie uznanych kliniczno-patologicznych czynników rokowniczych, jest również przedmiotem dyskusji. Stąd zainteresowanie analizą wpływu czynnika molekularnego aktywującej mutacji p.v600e w genie BRAF na przebieg choroby rozpoznanej na etapie istotnie odmiennego zaawansowania nowotworu. Celem pracy było porównanie częstości występowania mutacji p.v600e w genie BRAF w pierwotnym ognisku rozpoznanym w stopniu T3N0-x-1M0-1 oraz T1aN0-xM0 zgodnie z klasyfikacją TNM UICC z 2010 roku. Oceniano częstość występowania mutacji w zależności od płci, wieku i typu histologicznego guza w całej badanej grupie. Analizowano występowanie niekorzystnych czynników rokowniczych w chwili rozpoznania choroby oraz cech świadczących o gorszym przebiegu klinicznym w trakcie obserwacji 2
w zależności od obecności lub braku mutacji p.v600e w genie BRAF w obu grupach chorych. Badaniem objęto 454 chorych na raka brodawkowatego tarczycy zdiagnozowanego w latach 2000-2013: 196 z guzem rozpoznanym w stopniu T3 oraz 258 w stopniu T1aN0-xM0. Genotypowanie BRAF w tkance guza przeprowadzono metodami bezpośredniego sekwencjonowania DNA oraz allelo-specyficznej amplifikacji DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (allele-specific amplification polymerase chain reaction, ASA-PCR), a w części przypadków, również metodą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym real-time PCR (real-time polymerase chain reaction). Analizą retrospektywną objęto przebieg choroby od rozpoznania do dnia 31.08.2014r. Badano cechy raka rokowniczo niekorzystne w chwili diagnozy średnicę i typ histologiczny guza pierwotnego, inwazję pozatarczycową, wieloogniskowość, przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych i odległe, zaawansowanie choroby, czyli staging (III i IV stopień według TNM UICC z 2010 roku). W trakcie obserwacji analizowano cechy świadczące o gorszym przebiegu klinicznym: przetrwanie lub nawrót choroby, wystąpienie przerzutów odległych, konieczność powtarzania leczenia jodem radioaktywnym, progresja choroby wymagająca zmiany stopnia TNM (re-staging), zgon z powodu raka tarczycy. Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, że mutacja p.v600e w genie BRAF występowała w 76,5% raków brodawkowatych tarczycy rozpoznanych w stopniu T3 istotnie statystycznie częściej (p<0,037) w porównaniu z rakami T1aN0-xM0, gdzie mutację wykryto w 65,1%. Nie stwierdzono różnic w występowaniu mutacji w zależności od płci, wieku, typu histologicznego guza. W obu podgrupach nie wykazano zależności pomiędzy mutacją a występowaniem czynników niekorzystnych rokowniczo. Chorzy na raka brodawkowatego tarczycy w stopniu zaawansowania T3 i obecnością mutacji byli w chwili rozpoznania istotnie starsi od chorych na raka T3 bez mutacji. Natomiast średnica ogniska pierwotnego w grupie chorych na raka zdiagnozowanego w stopniu T3 była istotnie większa (p<0,02) w guzach bez mutacji. W obu podgrupach nie stwierdzono również zależności pomiędzy mutacją a cechami świadczącymi o gorszym przebiegu klinicznym 3
raka oraz wpływu mutacji na przetrwanie lub nawrót choroby nowotworowej. Stwierdzenie obecności mutacji p.v600e w genie BRAF u około 2/3 chorych na raka brodawkowatego tarczycy o minimalnym stopniu zaawansowania (T1aN0-xM0) z bardzo dobrym rokowaniem poddaje w wątpliwość znaczenie tej mutacji jako negatywnego czynnika predykcyjnego, mogącego wpływać na podejmowanie decyzji o intensywnym leczeniu raka tarczycy. 4
SUMMARY Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common endocrine malignancy. The vast majority of patients diagnosed of PTC are cured by the appropriate therapy alone, but a small number of patients are at risk of unfavourable clinical course. Researches are being carried out to identify molecular prognostic factors to improve risk stratification and select patients with poor prognosis to plan an intensive therapeutic approach for them. Activating mutation in the gene BRAF V600E is the most frequent genetic alteration identifying in PTC cells and is characterized by significant oncogenic potency. Many works analyzing the occurrence of this mutation in primary PTC tumour, its oncogenic function and its clinicopathological role have resulted in discordant conclusions. Researches have proved different frequencies of BRAF V600E in tumours tissues. The relationship between this mutation and aggressive features of the cancer and PTC-related mortality is still under debate. The determination of the optimal therapeutic approach for both high- and low-risk PTCs estimated on the well known clinicopathological factors is also debatable. Hence, the interest of the study analysing the impact of posibble molecular factor, activating mutation in the gene BRAF V600E, on the behaviour of the cancer diagnosed with significantly different stage of primary tumour. The aim of this study was to evaluate and compare the frequency of the activating mutation BRAF V600E in two groups of differently advanced PTCs. Firstly, those diagnosed with stage T3 disease according to UICC TNM staging system 2010 and secondly, those with stage T1a disease with no nodal or distant metastases (microcarcinoma papillare). The relationship between this mutation and gender, age at presentation and histological type were also analyzed. Clinicopatological features of poor prognosis at diagnosis and aggressive behaviour during entire follow-up were compared according to presence or absence of BRAF V600E mutation in patients with locally advanced tumour and microcarcinoma, respectively. 5
The study evaluated 454 patients with PTC diagnosed from 2000 to 2013. 196 were T3 at presentation and 258 T1aN0-xM0. Genotyping BRAF was performed on DNA extracted from primary tumour tissue using direct capillary sequencing and allele-specific amplification PCR and, in some of the samples, real-time PCR. Retrospective analysis of the clinical course of PTC from the diagnosis to the end of August 2014 was performed. The clinical features of poor prognosis at presentation were studied (tumour size, histological type, multifocality, lymph node and distant metastases, extrathyroidal invasion, higher TNM stage: III or IV). Several features of aggressive course of PTCs were analyzed such as persistent or recurrent disease, presence of distant metastases, more than ablative 131 I therapy, progression of the disease resulting in re-staging and PTC-related death. This study showed that the BRAF V600E mutation was detected in 76,5% of tumours diagnosed with T3 disease and was significantly more frequent (p<0,037) compared with those diagnosed with T1aN0-xM0 disease, where mutation was present in 65,1% cases. There was no significant difference in the occurrence of the mutation depending on gender, age at presentation and histological type of PTC. In both groups the mutation was not related to clinical risk factors. Patients with PTC diagnosed with T3 disease and BRAFpositive tumour, were significantly older at presentation than patients with BRAF-negative tumours. In this group the tumour size was significantly greater (p<0,02) in BRAF-negative cases. In both groups the BRAF V600E mutation did not relate to features of aggressive behaviour of PTC and did not affect persistent or recurrent disease, as well. However, the high prevalence of the BRAF V600E for almost two thirds of minimal invasive microcarcinomas with excellent prognosis is rather confusing. The value of the mutation as a negative predictive factor with therapeutic consequences seems to be unclear. 6