PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu DNA) Jest to reakcja powielania (replikacji) DNA w próbówce Częściowo uniezależnia nas od klonowania molekularnego
Metoda PCR naśladuje replikację DNA in vivo: replikacja in vivo cykliczne powielanie DNA w próbówce 1. powstają widełki replikacyjne (przy udziale białek następuje lokalne rozplecenie DNA) 2. polimeraza DNA wymaga wolnych końców 3, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5' 3 3. startery RNA wiążą się specyficznie na zasadzie komplementarności z określonymi miejscami na obydwu niciach 4. polimeraza DNA wydłuża końce starterów syntetyzując jedną nić w sposób ciągły, a drugą jako tzw. pasmo opóźnione 1. ssdna uzyskuje się ogrzewając DNA dwuniciowe (dsdna) matrycowe do temperatury ok. 94-100 C 2. polimeraza DNA wymaga wolnych końców 3, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5' 3, które są dostarczanie w postaci z syntetycznych oligonukleotydowych fragmentów DNA. Ponieważ są syntetyczne dobiera się je tak, aby otaczały odcinek DNA, który ma być powielony. To oznacza że musimy częściowo znać sekwencję (kolejność nt) w powielanym fragmencie DNA) 3. Startery przyłączają się do ss DNA na zasadzie komplementarności pod wpływem obniżenia temperatury. 4. Termostabilna polimeraza DNA wydłuża startery na końcach 3 w sposób ciągły
W każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA jest podwajana uzyskane kopie stanowią matrycę w kolejnych rundach amplifikacji. Efektem replikacji DNA techniką PCR jest więc amplifikacja (zwielokrotnienie) specyficznego obszaru DNA. Pierwsze zamierzone produkty amplifikacji powstają w trzecim cyklu reakcji
Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem powtarzanych cykli złożonych z następujących etapów: denaturacji DNA (30 sek.-5 min.; 94-96 C) przyłączania - hybrydyzacji (annealing) starterów (15 sek.-1 min.; 50-65 C) wydłużania (elongacji) starterów (syntezy DNA) (68-75 C) Temperatura ( C) 95 3-5 72 45 30 4 30 60 60 30 30 20-40x 30 5-7 Czas Reakcję przeprowadza się w specjalnym aparacie zwanym termocyklerem (ang. thermal cycler), w którym programuje się temperaturę i czas trwania poszczególnych etapów reakcji oraz liczbę cykli
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) czynniki fizyczne dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji dobór właściwych ilości składników mieszaniny reakcyjnej tj.: stężenia dntp, polimerazy, starterów, magnezu czynniki chemiczne
Warunki temperaturowe reakcji Denaturacja Temperatura i czas trwania etapu denaturacji zależy od rodzaju matrycowego DNA używanego do reakcji Dodatkowa denaturacja (wstępna czyli przed pierwszym cyklem reakcji PCR) - ogrzewanie DNA przez okres 3-5 min w temp. 94-96 C jest wystarczające do skutecznej denaturacji genomowego DNA
Temperatura etapu przyłączania - hybrydyzacji (annealingu) starterów jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na skuteczność i specyficzność reakcji PCR czas trwania tego etapu jest zależny od wielkości starterów, ale zwykle nie przekracza 1 min temperatura przyłączania starterów powinna być o 5 C niższa niż obliczona temperatura topnienia starterów (T m ). Zbyt niska temperatura powoduje, że startery przyłączają się w niespecyficznych miejscach (na zasadzie niepełnej komplementarności Istnieje wiele wzorów na obliczenie temperatury topnienia starterów. Do najprostszych, a zarazem najczęściej używanych należy wzór: T m = [4(G + C) + 2(A + T)] ( C)
Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji startera zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna temperatura wynosi 72-75 C (teoretyczna szybkość przyłączania nukleotydów syntezy DNA wynosi 100 nt/s) przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min.
Temperatura elongacji startera c. d. obniżenie temperatury elongacji wpływa znacznie na szybkość syntezy np. już przy 70 C ilość wstawianych nukleotydów wynosi ok. 60 nt/s. obniżenie temperatury elongacji kosztem wydłużenia czasu jej trwania jest korzystne np. wtedy, gdy wymagana jest większa dokładność w syntezie nowej nici np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania lub wówczas gdy amplifikowany fragment będzie klonowany do wektorów ekspresyjnych. W takich przypadkach stosowane są temperatury 60-68 C i wydłużamy czas elongacji. Przy wysokiej temperaturze przyłączania starterów możliwe jest ograniczenie etapów reakcji PCR do denaturacji i wspólnego etapu przyłączania i wydłużania starterów. Jest to tzw. dwustopniowy PCR
Ilość cykli w reakcji PCR wynosi od 20 do 50 i zależy głównie od początkowej ilości matrycowego DNA. Dla małej ilości docelowego DNA (ok. 50 cząsteczek) sugeruje się 40-50 cykli teoretyczna wydajność reakcji po n cyklach wynosi 2 n dwuniciowych, specyficznych cząsteczek DNA rzeczywista wydajność jest niższa (mniejsza wydajność reakcji np. przez spadek ilości dntp, zmniejszenie aktywności polimerazy).
Składniki reakcji PCR matrycowe DNA startery termostabilna polimeraza DNA odpowiedni bufor reakcyjny jony magnezu mieszanina czterech dezoksyrybonukleotydów (dntp)
Parametry dobrego startera powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji Przy amplifikacji z użyciem całkowitego DNA nietrudno sobie wyobrazić, że starter przyłączy się tylko do jednego miejsca. Prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch identycznych 20 nt starterów wynosi 4 20 czyli 1099511627776. Oznacza to, że sekwencja danego startera występuje raz na 10 12 nukleotydów. Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest występowanie dwóch takich starterów w genomie. obecność na 3 końcu startera nieunikalnych sekwencji o długości 6-7 nt objawia się występowaniem niespecyficznych produktów w reakcji PCR. Pracując z DNA ssaków trzeba zawsze sprawdzać czy projektowany starter nie wykazuje homologii z sekwencjami powtórzonymi typu Alu lub innymi sekwencjami repetetywnymi. Należy również unikać homooligomerów (jak AAAAAA-) i dwunukleotydowych powtórzeń typu np. ATATAT-.
Parametry dobrego startera długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad, a temp. ich topnienia, która zależy od rodzaju i ilości nukleotydów od 45-65 C opcjonalnie: jeśli amplifikowane produkty mają wielkość kilkuset pz startery mogą być nieco krótsze (16-18 nt), dla fragmentów rzędu kilku kpz startery powinny być dłuższe (24 i więcej nt) startery mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy, najczęstsze modyfikacje to: znakowanie fluorochromami, biotyną, digoksgeniną czy wbudowywanie tionukleotydów
Parametry dobrego startera starter powinien zawierać około 50% par GC. Ilość GC wpływa na temperaturę topnienia starterów, która nie może być większa niż optymalna temperatura działania polimerazy wymóg co do proporcji GC/AT nie jest bezwarunkowy, gdyż np. dla genomów o dużej zawartości par GC, czy miejsc bogatych w AT niemożliwe jest jego spełnienie przyjmuje się że startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub wyższą niż amplifikowana matryca nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów nie powinny zawierać w części 3 końcowej sekwencji komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera
Startery c. d. robocze stężenie każdego z primerów w mieszaninie reakcyjnej wynosi od 0,2-0,4 M i stanowi molowy nadmiar w stosunku do ilości moli matrycy! stężenie 1 M odpowiada ilości 1pmola startera w 1 l roztworu
Bufor reakcyjny bufor reakcji PCR jest specyficzny dla danej polimerazy i zwykle jest dostarczany razem z polimerazą stabilizuje ph mieszaniny reakcyjnej w buforze obecne są również jednowartościowe jony w postaci KCl, ich standardowe stężenie wynosi ok. 50mM i umożliwia amplifikację fragmentów o wielkości powyżej 500pz. Większe stężenie soli (70-100mM) poprawia amplifikację fragmentów poniżej 500pz
Jony dwuwartościowe wszystkie polimerazy wymagają do działania dwuwartościowych kationów, zwykle są to jony Mg +2, ale niektóre polimerazy działają również po dodaniu jonów Mn +2 ilość cząsteczek Mg +2 musi przewyższać ilość grup fosforanowych obecnych w mieszaninie reakcyjnej ponieważ zarówno wolne nukleotydy jak i startery wiążą jony Mg +2 końcowe stężenie Mg +2 wynosi zwykle od 0,5 do 5 mm
Deoksynukleotydy (dntp) stosowany mix dntp powinien zawierać równe ilości czterech nukleotydów datp, dttp, dctp i dgtp końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle od 200 do 250 M (w objętości 50 l jest to ilość dntp wystarczająca do syntezy ok. 6-6,5 g DNA) Wysokie stężenie dntp (>4 mm) hamuje reakcję PCR prawdopodobnie poprzez wiązanie jonów Mg +2. Przy amplifikacji krótkich fragmentów DNA (do 1 kpz) można używać mniejszych ilości nukleotydów (0,5 pm-20 M)
Polimerazy DNA Pierwszym enzymem używanym w reakcji PCR był fragment Klenowa DNA Polimerazy I E. coli. Nie jest to jednak enzym odporny na działanie wysokiej temperatury i w każdym cyklu reakcji zdenaturowane cząsteczki enzymu musiały być zastępowane nowymi.
Termostabilne Polimerazy DNA termostabilna polimeraza Taq wyizolowana z Thermus aquaticus (obecnie powszechenie dostępna jako rekombinowana) polimeraza Taq i jej pochodne nie posiadają aktywności egzonukleazy 3 5 (tzw. sprawdzającej) - ilość błędnie wstawianych nukleotydów jest dość wysoka (większa niż w procesie replikacji DNA) i wynosi 2 x 10-4 do 2 x 10-5. Produkty amplifikacji z użyciem polimerazy Taq mają charakterystyczne zakończenia
Polimeraza Pfu (Pyrococcus furiosus) charakteryzuje się bardzo niską częstość wstawiania błędnych nukleotydów (1.6x10-6 -7x10-7 ) ze względu na aktywność sprawdzającą wymaga ona dłuższego czasu działania (ok. 1.5-2 min/kpz). Optymalna temperatura działania to ok. 75 C. Polimeraza Pfu zachowuje 95% aktywności po godzinnej inkubacji w 98 C produkt PCR amplifikowany polimerazą Pfu posiada tępe końce
Polimeraza Tth (Thermus thermophilus) posiada zdolność odwrotnej transkrypcji tj. przepisywania cząsteczek RNA o długości do 1000 nukleotydów na DNA, w obecności jonów Mn +2. W obecności jonów Mg +2 jest polimerazą DNA i amplifikuje cząsteczki DNA w reakcji PCR. Aktywność odwrotnej transkryptazy (RT) w podwyższonej temperaturze jest bardzo pożyteczna, gdyż pozwala uniknąć problemów związanych ze skomplikowaną budową przestrzenną cząsteczek np. RNA Obecnie dostępna w postaci rtth (rekombinowanej) oraz rtth DNA Polymerase, XL [XL (extra Long) PCR], która może przepisywać DNA lub RNA długości powyżej 5 kpz
Polimeraza Deep Vent (Pyrococcus species GB-D) Deep Vent jest wyjątkowo stabilnym enzymem zarówno w wysokiej (480 min. w temp. 100 C) jak i niskiej temperaturze. Ma zdolność do amplifikowania długich fragmentów DNA (do 14 kpz) dużą procesywność Posiada aktywność sprawdzającą egzonukleazy. Amplifikacja fragmentów o długości powyżej 2 kpz wymaga zawsze większej ilości jonów magnezowych (powyżej 2mM).
Long PCR Enzyme Mix Mieszanki różnych polimeraz, np. Taq i Deep Vent, w różnych proporcjach, tak aby zoptymalizować amplifikację długich fragmentów (do 200 kpz!!!) 1-40 kb PCR fragment 2-35 kb PCR fragment 3-30 kb PCR fragment 4-25 kb PCR fragment 5-20 kb PCR fragment
Czułość reakcji PCR ilość matrycowego DNA potrzebna do PCR jest stosunkowo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA).
Unikanie zanieczyszczeń w reakcji PCR Główną zasadą jaka powinna być spełniona to fizyczne rozdzielenie etapów procedury przygotowania próbki i reakcji PCR Zestaw plastików (końcówki pipet, próbówki) pipety automatyczne powinny być używane tylko do określonego przeznaczenia (izolacja lub PCR)
Podstawowe zastosowania Biologia molekularna: uzyskiwanie dużych ilości DNA np. do klonowania znakowanie fragmentów DNA cykliczne sekwencjonowanie analizy ekspresji genów (transkryptomu komórki) Medycyna diagnostyka np. chorób, polimorfizmu Kryminalistyka i paleobiologia powielanie DNA ze śladowych ilości materiału będącego matrycą do badań ze identyfikacja organizmów genotypowanie Wiele innych...
Wybrane odmiany techniki PCR Hot Start PCR poprawia specyficzność amplifikacji fragmentu DNA w reakcji PCR tempreatura jest głównym czynnikiem warunkującym specyficzność reakcji. W reakcji HotStart PCR przynajmniej jeden z substratów (Polimeraza, Mg +2, lub dntp) jest nieobecny w mieszaninie reakcyjnej i dopiero po osiągnięciu wysokiej temperatury brak ten jest uzupełniany. Opóźnienie reakcji można osiągnąć różnymi drogami. np. przez dodanie polimerazy do reakcji pod koniec początkowej denaturacji inaktywacji polimerazy przez blokowanie jej centrum aktywnego przeciwciałami lub innymi ligandami. Ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w czasie wstępnej denaturacji powoduje denaturację termolabilnych substancji (przeciwciał, ligandów) i uwolnienie polimerazy.
Asymetryczny PCR w reakcji używany jest jeden starter lub dwa w nierównych stężeniach amplifikacji ulega tylko jedna nić Stosowany np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania DNA
Multipleksowy PCR Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w czasie jednej reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia kilku par starterów o podobnej temperaturze topnienia tak by można było użyć jeden profil temperaturowy reakcji. Multipleksowy PCR jest wykorzystywany np. do identyfikacji osobników, gatunków czy diagnostyki chorób genetycznych.
qpcr (ilościowy PCR, Real-Time PCR) Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym. Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego znacznika a zatem ilością powstającego produktu.
Direct PCR (bezpośredni PCR) matrycowe DNA pochodzi bezpośrednio z kolonii bakteryjnej (kolonijny PCR), tkanki, gleby, (bez etapu izolacji DNA)