Wykład XI Terapia genowa chorób monogenowych
Ponad 600 prób klinicznych terapii genowej na świecie, w tym 555 zarejestrowanych przez NIH (stan z XI.2003) 392 - terapia genowa nowotworów 57 choroby monogenowe, w tym 23 mukowiscydoza 46 - choroby układu krążenia 40 choroby zakaźne (w tym 37 AIDS) http://www4.od.nih.gov.oba/rac/clinicaltrial.htm
Ciężkie złożone niedobory odporności - niedobór X-SCID (SCID-X1) 1: 150 000 - niedobór deaminazy adenozynowej 1: 375 000
Deaminaza adenozyny ADA - deaminaza adenozyny oraz 2-deoksyadenozyny - ecto-ada - interkacja z CD26 obecnym na powierzchni limf. T - interakcja ta jest niezbędna do aktywacji limfocytów T -ectoada -związana z receptorem adenozyny na powierzchni komórek mięśni gładkich ściany naczynia - niezbędna do wiązania adenozyny do receptora
Niedobór deaminazy adenozyny (ADA) Deoxy-adenozyna Adenozyna Deoxy-inozyna Inozyna Niedobór ADA Upośledzenie układu odpornościowego
Konsekwencje niedoboru ADA rgtp, rctp, rttp Niedobór ADA damp datp dgtp, dctp, dttp
Terapia genowa niedoboru ADA ADA ADA - ADA + ADA +
Sukces terapii genowej Science 2000 Apr 28;288(5466):669-72 Comment in: Science. 2000 Apr 28;288(5466):627-9 Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P, Selz F, Hue C, Certain S, Casanova JL, Bousso P, Deist FL, Fischer A. INSERM Unit 429, Gene Therapy Laboratory, Cell Therapy Laboratory, Unite d'immunologie et d'hematologie Pediatriques, Hopital Necker, 75743 Paris Cedex 15, France. Severe combined immunodeficiency-x1 (SCID-X1) is an X-linked inherited disorder characterized by an early block in T and natural killer (NK) lymphocyte differentiation. This block is caused by mutations of the gene encoding the gamma-c cytokine receptor subunit of interleukin-2, -4, -7, -9, and -15 receptors, which participates in the delivery of growth, survival, and differentiation signals to early lymphoid progenitors. After preclinical studies, a gene therapy trial for SCID-X1 was initiated, based on the use of complementary DNA containing a defective gammac Moloney retrovirus-derived vector and ex vivo infection of CD34+ cells. After a 10-month follow-up period, gammac transgene-expressing T and NK cells were detected in two patients. T, B, and NK cell counts and function, including antigen-specific responses, were comparable to those of age-matched controls. Thus, gene therapy was able to provide full correction of disease phenotype and, hence, clinical benefit
Receptory cytokin D. Kohn et al., Nature Rev Cancer July 2003
Efekty uboczne terapii genowej X-SCID X U dwóch spośród 10 chłopców poddanych terapii genowej doszło do rozwoju białaczki
Disease targets for gene therapy Disease Cystic fibrosis SCID Gaucher disease Hemophilia A Hemofilia B Familial hypercholesterolemia Muscular dystrophy Ornithine transcarbamylase deficiency Gene(s) CFTR, α-1-anti-trypsin ADA glucocerebrosidase Factor VIII Factor IX LDL-R sarcoglycan, dystrophin, utrophin OTC
Niedobór karbamoilotransferazy ornitynowej Jesse Gelsinger 1999 Zmarł po podaniu dużej dawki wektora adenowirusowego z prawidłowym genem OTC
Terapia genowa hemofilii
Proces krzepnięcia krwi Uszkodzenie naczynia Czynnik XII Czynnik XIIa Czynnik XI Czynnik XIa Czynnik IX Czynnik IXa Czynnik X Czynnik VIIIa protrombina Czynnik Xa trombina Czynnik VIII fibrynogen fibryna
Hemofilia A and gene therapy 1. Factor VIII production is not regulated in response to bleeding 2. The broad therapeutic index of factor VIII minimises the risk of overdoses 3. Delivery of factor VIII into the bloodstream does not require expression of the gene by specific organ 4. Even low levels of the protein can be beneficial Size of the coding sequences of factor VIII and factor IX mrna - factor VIII - 8,8 kb factor IX - 1,8 kb
Próba kliniczna terapii genowej hemofilii A Steps in human factor VIII gene transfer procedure Roth DA et al., NEJM 2001; 344: 1735
Próba kliniczna terapii genowej hemofilii A Roth DA et al., NEJM 2001; 344: 1735
Bleeding Events and Use of Exogenous Factor VIII in Three of the Six Patients. Roth DA et al., NEJM 2001; 344: 1735
Opublikowane wyniki badań prób klinicznych terapii genowej hemofilii Hemofilia A -wektora plazmidowy transfer ex vivo, -Wektor retrowirusowy transfer in vivo (dożylny) sekwencja kodująca czynnik VIII pozbawiony domeny B (domena B nie jest konieczna do prawidłowego funkcjonowania czynnika VIII i jest wycinana potranslacyjnie) Hemofilia B -wektor AAV 2 a) domięśniowo b) do aorty wątrobowej
Mukowiscydoza, zwłóknienie torbielowate Cystic fibrosis - most common autosomal recessive disorder in Caucasians (1:2000-2500 live births; carrier rate in northern Europeans - 1:20-1:25) in Hawaiians - 1:90000 - after asthma, CF is the commonest cause of chronic respiratory distress in childhood; responsible for the majority of deaths -
Mukowiscydoza, zwłóknienie torbielowate Cystic fibrosis Płuca zdrowe Płuca osoby chorej na mukowiscydozę GeneMedicine Research Group
Mukowiscydoza Cystic fibrosis Complications - respiratory - chronic bacterial infections; respiratory and cardiac failure -gastrointestinal tract - more than 85% of children malabsorption due to exocrine pancreatic insufficiency - infertility - affects 85% males and to a lesser extent females Median survival remains about 30 years
CFTR gene Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator 168 kda protein; 1480 aa residues CFTR codes for a chloride ion channel over 600 mutations produce CF; deltaf508 (D508) is the most common (in exon 10, interferes with ATP binding)
Budowa i rozmieszczenie białka CFTR
Terapia genowa mukowiscydozy -najwięcej prób klinicznych spośród chorób monogenowych - próby kliniczne rozpoczęte w roku 1993 Strategie terapii genowej w CF: 1. Transfer genu CFTR - wykorzystuje się różne wektory, ostatnio najczęściej AAV - sposoby podawania: a) bronchoskopia b) zawiesina aerozolowa - problemy ze skutecznością transfekcji/transdukcji 2. Naprawa mutacji w genie CFTR; zastosowanie G418
Dystrofia mięśniowa
Duchenne muscular dystrophy Progressive muscle weakness, more proximal Onset between 2-4 years of age >95% in wheelchair by 12 years of age Death between 15-25 years of age Variable mental retardation Frequent cardiac involvement Orthopaedic deformities Calf hypertrophy High creatine phosphokinase concentrations Dystrophin deficiency in muscle Hereditary, X-linked disease Gene Xp21 mutations In 1861, Duchenne described his first case of the dystrophy that now bears his name, under the title, Paraplégie hypertrophique de l'enfance de cause cerébrale. Because of the intellectual impairment in the affected boys, Duchenne initially thought the condition was cerebral in origin.
Duchenne & Becker muscular dystrophy Duchenne dystrophy: 1:3000 newborn males X - linked; The largest gene described in humans (~1% of X chromosome), extending over 2300 kb and comprising 79 exons - in 65% patients the molecular abnormality involves exon deletions Becker dystrophy: 7-10 times less frequent that Duchenne
Terapia genowa dystrofii mięśniowej Duchenn a Zwiększenie ekspresji: transfer genu Naprawa mutacji Terapia komórkowa (transplantacja mioblastów) Dystrofiny Utrofiny
Naprawa mutacji chimeraplastyka James G Tidball & Melissa J Spencer Nature Medicine 9, 997-998 (2003)
Przyczyny niepowodzeń w terapii genowej chorób monogenowych 1. Poziom i czas trwania ekspresji 2. Bariery ograniczające transdukcje/transfekcję 3. Stopień zaawansowania choroby 4. Możliwe rozwiązania: a) skuteczniejsze wektory np. helper-dependent b) nowe strategie np.. Naprawa genu c) wykorzystanie komórek macierzystych np. zarodkowych komórek macierzystych uzyskanych drogą terapeutycznego transferu jądrowego (tzw. klonowanie terapeutyczne).