Thyrotropin-releasing hormone (TRH): the biosynthesis, distribution, receptors and metabolism

/ REVIEWS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 5/2004 ISSN 0423-104X Thyrotropin-releasing hormone (TRH): the biosynthesis, distribution, receptors and metabolism Joanna Ciosek Department of Pathophysiology, Medical University of Lodz Summary Thyrotropin-releasing hormone (TRH) is the hypothalamic neurohormone engaged in the thyrotropin as well as others hormones secretion from the adenohypophysis. The present review shows the information concerning TRH biosynthesis, the neuroendocrine regulation of this process, localization of TRH and TRH receptors in the central nervous system and peripheral tissues as well as the degradation stages of TRH molecule. (Pol J Endocrinol 2004; 5(55): 608-615) Key words: thyrotropin-releasing hormone, biosynthesis, receptors, localization, metabolism Tyreoliberyna (TRH): biosynteza, występowanie, receptory, metabolizm Joanna Ciosek Zakład Patofizjologii Katedry Patofizjologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Tyreoliberyna (TRH) jest neurohormonem podwzgórzowym zaangażowanym w procesach wydzielania hormonu tyreotropowego, a także innych hormonów z części gruczołowej przysadki. Niniejsze opracowanie przedstawia informacje dotyczące biosyntezy TRH, regulacji neuroendokrynnej tego procesu, występowania TRH oraz receptorów TRH w ośrodkowym układzie nerwowym i w tkankach obwodowych, a także etapów degradacji cząsteczki TRH. Dr hab. n. med. Joanna Ciosek Zakład Patofizjologii Katedry Patofizjologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi ul. Narutowicza 60 90-136 Łódź Tel. +42 630-61-87 Fax. +42 631-97-23 (Endokrynol Pol 2004; 5(55): 608-615) Słowa kluczowe: tyreoliberyna, biosynteza, receptory, występowanie, metabolizm 608

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) Wstęp Tripeptyd amid pyro-glutamylo-histydyloproliny nazwany został tyreoliberyną (TRH) z powodu zdolności do pobudzania sekrecji hormonu tyreotropowego (TSH) z części przedniej przysadki; jest więc istotnym czynnikiem regulacyjnym układu podwzgórze-przysadka-tarczyca. Tyreoliberyna jest zaangażowana także w mechanizmach syntezy i uwalniania prolaktyny, hormonu wzrostu, wazopresyny, insuliny a także neuroprzekaźników ośrodkowego układu nerwowego (OUN) noradrenaliny i adrenaliny [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. Neuropeptyd ten, syntetyzowany głównie w jądrze przykomorowym (PVN) podwzgórza, drogą krążenia wrotnego dociera do części przedniej przysadki, gdzie moduluje czynność odpowiednich komórek tropowych. Z uwagi na szerokie występowanie w OUN oraz wielokierunkowość działań biologicznych przypisuje się TRH rolę neurotransmitera lub/i neuromodulatora zaangażowanego w różnych procesach o charakterze regulacyjnym [2, 8, 9]. TRH cdna TRH mrna pro TRH L-Gln-L-His-L-Pro-L-Gly L-Gln-L-His-L-Pro-NH 2 L-pGlu-L-His-L-Pro-NH 2 Transkrypcja Translacja PC1 i PC2 Karboksypeptydaza Peptydylo-Glicylo- -Monooksygenaza Cyklaza glutaminowa Biosynteza tyreoliberyny Biosynteza TRH jest procesem pięcioetapowym [10, 11]. Pierwszym etapem jest transkrypcja mrna dla TRH wewnątrz jądra komórkowego. Następnie zachodzi proces translacji prowadzący do powstania prepro-hormonu prepro-tyreoliberyny (prepro-trh). Wykazano, że u szczura jest to białko złożone z 255 aminokwasów, zawierające 5 kopii sekwencji aminokwasowej TRH. Ludzka prepro-trh zawiera 6 takich kopii [12, 13]. Modyfikacja potranslacyjna cząsteczki prepro- TRH obejmuje wstępne rozcięcie łańcucha prohormonu przez konwertazę 1 i 2 (PC1 i PC2) [14], a następnie odcięcie skrajnych peptydów przy udziale karboksypeptydazy, amidację proliny pod wpływem peptydylo-glicylo-monooksygenazy oraz w etapie końcowym cyklizację N-końcowej glutaminy za pomocą cyklazy glutaminowej [15]. Procesy te przedstawione są na schemacie I. Gen kodujący cząsteczkę prepro-trh składa się u szczura z trzech kodujących eksonów (1, 2 i 3) oraz dwóch sekwencji nie kodujących (intron 1 pomiędzy eksonami 1 i 2; intron 2 pomiędzy eksonami 2 i 3) [16]. Ekson 1 odpowiada sekwencji nukleotydowej na końcu 5 łańcucha mrna (nie ulegającej translacji), ekson 2 obejmuje kod dla peptydu sygnalnego oraz części łańcucha pro-trh nie będącej właściwym peptydem; ekson 3 zawiera sekwencję nukleotydową dla pięciu kopii cząsteczki TRH oraz dla sekwencji na końcu 3 łańcucha mrna (nie podlegającej translacji). W budowie cząsteczki prepro-trh wyróżniono następujące kolejne elementy: N-końcowy peptyd sygnalny (pozycje od 1 do 24), tzw. sekwencja non-trh (poz. 25-50), para aminokwasów Arg- Arg (51-53), ponownie sekwencja non-trh (53- Schemat I. Etapy biosyntezy cząsteczki TRH 74), pozycje 75-255 odpowiadające pięciu kopiom cząsteczki TRH przedzielonym sekwencjami non- TRH oraz parami aminokwasów Lys-Arg lub Arg-Arg, stanowiącymi miejsca przyszłego rozszczepienia prepro-trh [17]. Poza cząsteczką TRH, z rozszczepienia pro-trh mogą także powstać inne peptydy pochodne wywierające określone działania biologiczne: prepro-trh 160-169, prepro-trh 178-199, prepro-trh 178-185, prepro-trh 186-199, prepro-trh 53-74, prepro-trh 83-106, prepro-trh 208-255 [9]. Proces modyfikacji potranslacyjnej pro-trh zachodzi prawdopodobnie tylko w perikarionie komórki nerwowej, nie wykazano bowiem obecności immunoreaktywnego mrna pro-trh w aksonach lub zakończeniach neuronów TRHergicznych na poziomie wyniosłości pośrodkowej lub rdzenia kręgowego [17]. Regulacja biosyntezy tyreoliberyny Biosynteza TRH w jądrze przykomorowym podwzgórza przebiega na poziomie optymalnym dla zapewnienia funkcjonalnej integralności układu: podwzgórze- przysadka-tarczyca. TRH pobudza procesy syntezy i wydzielania TSH z tyreotropów przysadkowych, co prowadzi do wzmożonego uwalniania hormonów tarczycy (T 3 i T 4 ) do krwi. Z kolei, TSH i hormony tarczycy regulują na drodze ujemnego sprzężenia zwrotnego proces transkrypcji, a także translacji TRH w części drobnokomórkowej PVN [17, 18]. Zawartość pro-trh mrna w PVN podwzgórza szczurów znacząco wzrasta w warunkach doświadczalnej hipotyreozy, a obniża się w stanie hipertyreozy [19]. 609

Tyreoliberyna w ośrodkowym układzie nerwowym Ciosek J. Regulacja czynności neuronów TRH-ergicznych w PVN podwzgórza zachodzić może przy udziale licznych neuromediatorów i/lub neuromodulatorów. Neurony zawierające TRH zlokalizowane są w rejonie PVN, który jest modulowany przez liczne czynniki neuroendokrynne, między innymi, przez noradrenalinę (NA), adrenalinę (A), dopaminę (DA), neuropeptyd Y (NPY), peptydy opiatowe, galaninę (GAL), glikokortykosteroidy, leptynę, somatostatynę (SRIF), neurotensynę (NT), jelitowy peptyd wazoaktywny (VIP), czy też kwas γ-aminomasłowy (GABA) [9, 20, 21]. Neurony TRH-ergiczne otrzymują bogatą aferentację noradrenergiczną z międzymózgowia, kresomózgowia, pnia mózgu oraz rdzenia kręgowego i mostu [22, 23]; nasilone przewodzenie neuronami katecholaminergicznymi pobudza sekrecję TRH [20]. Dokomorowe iniekcje NA, A oraz agonistów receptorów α 2 -adrenergicznych nasilają podstawową sekrecję TSH [24, 25]; w warunkach in vitro NA zwiększa wydzielanie TRH z tkanki podwzgórzowej [26]. Pobudzenie neuronów TRH-ergicznych w PVN pod wpływem NA lub A prowadzi do wzrostu wydzielania TSH w odpowiedzi na obniżoną temperaturę otoczenia lub hipowolemię [27, 28, 29]. Hormony tarczycy lub TSH mogą wpływać na procesy biosyntezy i/lub uwalniania TRH przy udziale mechanizmów katecholaminergicznych [17]. Do neuronów PVN dociera także aferentacja dopaminergiczna z obszaru tylnego, bocznego i przedniego podwzgórza oraz ze śródmózgowia [20]. Przeciwnie do układu NA/A, dopamina hamuje sekrecję TRH, głównie na poziomie wyniosłości pośrodkowej [30]. Nasilenie przewodzenia w neuronach DA-ergicznych hamuje zarówno podstawowe, jaki i indukowane zimnem uwalnianie TSH, podczas gdy antagoniści DA wywierają efekt przeciwny. Ponadto, uwalnianie TRH może być hamowane przez sekrecję SRIF indukowaną dopaminą [31]. W warunkach in vitro, DA pobudza uwalnianie TRH z izolowanych fragmentów podwzgórza [26, 31]. Wykazano, że hormony tarczycy modulują zawartość DA w wyniosłości pośrodkowej, natomiast TSH zwiększa zdolność DA do hamowania wydzielania TRH [32]. Ciała komórek nerwowych zawierających neuropeptyd Y zlokalizowane są głównie w rdzeniu, często współwystępując z NA i A [33] oraz w jądrze łukowatym podwzgórza. Jądro łukowate jest głównym źródłem neuronów zawierających NPY i unerwiających neurony TRH-ergiczne w PVN [34, 35]; pewne neurony z NPY kierują się też do wyniosłości pośrodkowej. Ponieważ neurony zawierające NPY także unerwiają neurony z SRIF w PVN, mogłoby to przemawiać za możliwością pośredniej regulacji biosyntezy i uwalniania TRH [20]. Mikroiniekcje ośrodkowe NPY ograniczają uwalnianie TSH, a także metabolizm NA w PVN, co wskazuje na jego działania hamujące. NPY podwyższa zawartość DA podwzgórzowej, jak również przemianę DA w wyniosłości pośrodkowej; wypadkowa tych działań sprzyja redukcji uwalniania TRH [36]. Neurony zawierające opiaty endogenne, tworzące bogatą aferentację neuronalną PVN, mają swój początek w jądrze łukowatym i ciałach migdałowatych [37]. Z jąder szwu projektują aksony z serotoniną i enkefaliną (ENK), z ciał suteczkowatych tylnego podwzgórza wysyłane są aksony zawierające GABA, histaminę i ENK. Wyniosłość pośrodkowa zawiera liczne synapsy neuronów zawierających ENK, dynorfinę i endorfinę (END), wychodzących z PVN i jądra łukowatego. Zarówno END, jak i ENK, hamują sekrecję TRH z podwzgórza, a ENK i morfina hamują sekrecję tego peptydu z wyniosłości pośrodkowej [38]. Istnieją dowody, że ENK pośrednio hamuje neurony TRH-ergiczne, przebiegające w lejku, poprzez uwalnianie DA [39]. Galanina i peptyd galaninopodobny (GALP) są peptydami zaangażowanymi w kontroli przemian metabolicznych. Aksony neuronów GAL-ergicznych gęsto unerwiają wszystkie neurony TRHergiczne w obszarze drobnokomórkowym PVN i tworzą synapsy na ciałach komórkowych tych neuronów [40]. Ponieważ kontakty te wywierają działanie hamujące na uwalnianie TRH, przyjmuje się, że GAL może być pośrednio zaangażowana w ośrodkowej regulacji drogi podwzgórzowoprzysadkowo-tarczycowej. GALP nie wywiera podobnych efektów. W doświadczeniach in vitro, glikokortykosteroidy nasilają ekspresję genu dla TRH w neuronach podwzgórza i części przedniej przysadki, aktywując procesy transkrypcji [41] oraz translacji i modyfikacji potranslacyjnej cząsteczki pro-trh [42]. Glikokortykosteroidy nadnerczowe, stosowane in vivo, działają w sposób bardziej zróżnicowany. Hamują one ekspresję prepro-trh mrna w PVN, nie wykazują natomiast takiego wpływu na neurony TRH-ergiczne zlokalizowane poza PVN [43]. Przyjmuje się, że w mechanizmie działania glikokortykosteroidów na neurony TRH-ergiczne może pośredniczyć hipokamp i jądro migdałowate [44]. Pozbawienie zwierząt czy ludzi pożywienia powoduje zaburzenia endokrynne i metaboliczne, wśród których obserwuje się między innymi obniżenie poziomu TSH, hormonów tarczycy, insuliny, hormonu wzrostu, hormonów płciowych i gonadotropin. U zwierząt głodzonych wykazano także znaczące zmniejszenie ekspresji prepro- TRH mrna w PVN. Potwierdza to koncepcję, że hipotyreoza obserwowana w głodzeniu jest pochodzenia podwzgórzowego [45]. Leptyna, hormon syntetyzowany przez tkankę tłuszczową, hamujący czynność drogi podwzgórzowo-przysadkowo-nadnerczowej, może odgrywać także 610

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) ważną rolę w regulacji neuroendokrynnej układu podwzgórze-przysadka-tarczyca. Wykazano, że leptyna po przejściu przez barierę krew-mózg może oddziaływać bezpośrednio na neurony TRHergiczne lub pośrednio poprzez wzrost biosyntezy -MSH w neuronach POMC w jądrze łukowatym [46]; -MSH prawdopodobnie bezpośrednio reguluje ekspresję TRH w podwzgórzu [47]. Leptyna podnosi zawartość TRH w podwzgórzu wskutek nasilenia mechanizmów potranslacyjnych związanych ze wzrostem aktywności PC1 i PC2 [48]. Obniżony poziom leptyny we krwi w czasie głodzenia zmienia set-point sprzężenia zwrotnego pomiędzy hormonami tarczycy a biosyntezą prepro-trh mrna w PVN [49]. Występowanie tyreoliberyny w ośrodkowym układzie nerwowym oraz w tkankach obwodowych Obecność tyreoliberyny oraz pro-trh w OUN i w tkankach obwodowych szczura badano przy udziale metod immunocytochemicznych. W neuronach TRH-ergicznych układu podwzgórzowo-przysadkowego pro-trh występuje przede wszystkim w ciele komórki nerwowej w sąsiedztwie jądra i w błonach układu Golgiego [50]. W neuronach TRH-ergicznych innych obszarów mózgu pro- TRH jest rozłożona bardziej równomiernie w całej przestrzeni cytoplazmatycznej neuronu, również w dendrytach I lub II rzędu. Na poziomie podwzgórza liczne neurony zawierające TRH obecne są w części drobnokomórkowej jąder przykomorowych. Ich aksony kierują się ku splotowi naczyniowemu w warstwie zewnętrznej wyniosłości pośrodkowej, gdzie TRH jest wydzielana do krwi krążenia wrotnego [51]. Część wielkokomórkowa PVN jest źródłem neuronów zawierających TRH oraz produkty rozpadu pro- TRH, których aksony kierują się do splotu naczyniowego wyniosłości pośrodkowej [52] oraz dalej do części nerwowej przysadki [20, 53]. Dla neuronów TRH-ergicznych w podwzgórzu charakterystyczny jest brak współwystępowania TRH z innymi neuroprzekaźnikami i/lub neuromodulatorami [54]. Mniejsze ilości TRH obecne są w neuronach wielkokomórkowych jąder nadwzrokowych [53]. W części przedniej przysadki wykryto gen dla TRH oraz peptydy powstałe po rozszczepieniu łańcucha pro-trh [55]. W części przedniej podwzgórza duże ilości pro-trh występują w jądrze nadskrzyżowaniowym, natomiast mniej pro-trh i TRH zawierają jądra: przedwzrokowe, grzbietowo-przyśrodkowe oraz łukowate [51]. W obszarze wzgórza i nadwzgórza liczne neurony zawierające pro-trh i TRH występują w jądrze bocznym grzbietowym i w jądrach uzdeczki. W kresomózgowiu neurony TRH-ergiczne wykryto w jądrze soczewkowatym, opuszce węchowej oraz w jądrze macierzystym prążka krańcowego. Duże ilości pro-trh obecne są w istocie czarnej oraz substancji szarej okołowodociągowej śródmózgowia. Liczne neurony zawierające TRH wykryto w jądrach mostu, jądrach szwu, jądrach ślimaka, jądrze klinowatym i bocznych jądrach siateczkowatych. TRH występuje także w pinealocytach szyszynki [56]. W tkankach obwodowych, obecność TRH, jej metabolitów oraz receptorów wiążących TRH wykazano w licznych odcinkach przewodu pokarmowego, a zwłaszcza w komórkach beta trzustki wielu gatunków zwierząt [57, 58]. Niektórzy autorzy [59] postulują istnienie dwóch głównych układów TRH: podwzgórzowego i trzustkowego. Tyreoliberyna syntetyzowana w obu układach jest kodowana przez ten sam gen [60]; hormony tarczycy regulują, na drodze ujemnego sprzężenia zwrotnego, proces biosyntezy TRH zarówno na poziomie podwzgórza, jak i w trzustce. Poziom TRH mrna i TRH w podwzgórzu wzrasta po urodzeniu i utrzymuje się na wysokim poziomie przez całe życie [61]. Przeciwnie, w trzustce zawartość TRH mrna i TRH jest najwyższa w okresie rozwoju płodowego; po urodzeniu wartości te obniżają się i pozostają na niskim poziomie [60, 62]. Prawdopodobnie, TRH jest jednym z modulatorów okresu rozwojowego tego narządu. Receptory tyreoliberyny w ośrodkowym układzie nerwowym Receptory wiążące TRH należą do klasy receptorów związanych z białkiem G. Scharakteryzowano u myszy, szczura i człowieka dwa rodzaje miejsc receptorowych dla TRH: TRH-R1 oraz TRH-R2 [63, 64, 65, 66, 67]. W ich strukturze występuje siedem śródbłonowych domen z wystającym na zewnątrz N-końcem podlegającym procesom glikozylacji [63]. Budowa obu receptorów TRH jest identyczna w około 50% [68]. Gęstość receptorów wiążących TRH regulowana jest poziomem samej tyreoliberyny, jej analogów oraz hormonów tarczycy na zasadzie mechanizmu down regulation, tj. przy nadmiernym stężeniu TRH spada liczba receptorów wiążących się z tym neuropeptydem [69]. Związanie tyreoliberyny z jej receptorem błonowym prowadzi do aktywacji białek G typu G q i G 11 oraz enzymu fosfatydyloinozytolowej fosfolipazy C [17]. Konsekwencją nasilonego wówczas metabolizmu fosfatydyloinozytolu jest jego hydroliza do trifosforanu inozytolu i 1,2- diacylglicerolu. Prowadzi to do wzrostu uwalniania wapnia z depozytów wewnątrzkomórkowych oraz aktywacji kinazy proteinowej C, a także kinazy białkowej zależnej od Ca 2+ /kalmoduliny [70, 71]. Następuje pobudzenie procesu egzocytozy, będącego podstawą np. wzmożonej sekrecji hormonalnej, oraz fosforylacja protein wewnątrzkomórkowych zaangażowanych w tym procesie. 611

Tyreoliberyna w ośrodkowym układzie nerwowym Ciosek J. Zastosowanie metod autoradiograficznych pozwoliło na określenie lokalizacji obu receptorów wiążących TRH w mózgu ssaków [72, 73, 74, 75]. Receptory swoiste dla TRH występują na błonach perikarionów, dendrytów i aksonów komórek nerwowych [73, 76]. Największą gęstość receptorów TRH wykryto w OUN szczura w ciałach migdałowatych, hipokampie i przegrodzie; nieco niższą zawartość stwierdzono w pniu mózgu, rdzeniu kręgowym oraz podwzgórzu (jądrach okołokomorowych, jądrach przykomorowych, jądrze łukowatym, grzbietowo-przyśrodkowym, brzuszno-środkowym oraz nadskrzyżowaniowym). Receptory TRH wykryto także w przedniej części przysadki (na powierzchni komórek tyreotropowych i laktotropowych), w tkance glejowej oraz w siatkówce oka [76, 78, 79]. Ekspresja TRH-R2 różni się od występowania TRH-R1. TRH-R2 zlokalizowany jest przede wszystkim w mózgu (nie występuje w tkankach obwodowych), a największą zawartość TRH-R2 mrna wykryto u szczura w korze mózgu, moście, wzgórzu, podwzgórzu, drodze rdzeniowo-wzgórzowej, rogach grzbietowych rdzenia kręgowego, jądrach mostu i móżdżku [80, 81]. Receptor TRH-R2 przejawia wyższą aktywność w wiązaniu się z TRH i podlega szybszej internalizacji niż TRH-R1 [82]. Metabolizm tyreoliberyny Tyreoliberyna podlega szybkiemu enzymatycznemu rozkładowi w wielu narządach i tkankach (mózg, przysadka, rdzeń kręgowy, wątroba, nerka, trzustka, nadnercza) oraz płynach ciała (krew) [84]. Obecność w tych narządach odpowiednich enzymów, a więc możliwość miejscowej inaktywacji TRH, moduluje tkankową zawartość peptydu, a także natężenie obwodowych efektów hormonu. Badania in vitro pozwoliły na identyfikację czterech enzymów rozkładających cząsteczkę TRH, tj. aminopeptydazy pyroglutamylowej I (PAP I) i II (PAP II), tyroliberynazy (określanej także jako histydylo-prolino-diketopiperazyna lub His-Pro- DKP) oraz endopeptydazy prolinowej [2, 9, 84, 85]. Degradacja cząsteczki TRH przebiega jak na schemacie II. Występowanie w ustroju enzymów wymienionych na schemacie II jest dość powszechne. W OUN, głównymi enzymami działającymi na metabolizm TRH są rozpuszczalna PAP I, endopeptydaza prolinowa oraz związana z błoną PAP II [86]. Degradacja TRH w osoczu krwi i wielu tkankach obwodowych zachodzi głównie przy udziale osoczowej tyroliberynazy [87]. PAP I jest rozpuszczalną proteazą cysteinową, która odszczepia N-końcowy fragment pyroglu od cząsteczki TRH [86]. Posiada także zdolność rozkładu takich peptydów jak luliberyna (LHRH), neurotensyna (NT), bombezyna. PAP II jest metaloenzymem podobnie odszczepiającym pyroglu od Glu - His - ProNH 2 1, 3 2 3 pglu + His-Pro-NH 2 pglu-his-prooh cyklo (His-Pro) pglu-hisoh + ProNH 2 Glu + His 1 aminopeptydaza pyroglutamylowa (PAP I, PAP II) 2 endopeptydaza prolinowa 3 tyroliberynaza Schemat II. Degradacja cząsteczki TRH TRH. Jest enzymem związanym z błoną komórkową i wykazuje większą specyficzność substratową. W OUN PAP II występuje we frakcjach synaptosomalnych kory mózgu, hipokampa a także części przedniej przysadki. TRH może modulować aktywność PAP II poprzez regulację napływu jonów wapniowych do komórki oraz udział kinazy proteinowej zależnej od Ca 2+ /kalmoduliny [88]. Endopeptydaza prolinowa jest rozpuszczalną proteazą serynową, która odcina C-końcową prolinę od TRH dając formę TRH-OH. Działa także na inne neuropeptydy, jak LHRH, NT, substancja P. Tyroliberynaza osoczowa, podobnie do PAP II, przejawia większą specyficzność substratową niż PAP I lub endopedydaza prolinowa [89, 90]. Czasokres półtrwania TRH we krwi szczura lub człowieka wynosi od 2 minut w stanie hipertyreozy do 6 minut w hipotyreozie [87], natomiast czas półtrwania TRH w tkankach mózgu określono na 9-11 minut [91]. Stężenie TRH w płynach ustrojowych jest wypadkową stopnia sekrecji tego hormonu oraz tempa degradacji enzymatycznej. Inaktywację enzymatyczną TRH w osoczu krwi szczura regulują hormony tarczycy, które mogą wpływać na aktywność tyroliberynazy: metabolizm TRH nasila się w warunkach hipertyreozy a obniża w stanie hipotyreozy [87]. Podsumowanie Tyreoliberyna i receptory wiążące się z tym neuropeptydem charakteryzują się szerokim zasięgiem występowania w ośrodkowym układzie nerwowym. Procesy biosyntezy i uwalniania TRH na poziomie podwzgórzowym pozostają w zależności przede wszystkim od aktualnego stanu czynnościowego tarczycy. Wieloneuronalna aferentacja podwzgórzowych neuronów TRH-ergicznych umożliwia wpływ wielu 612

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) neuromediatorów i/lub neuromodulatorów na mechanizmy biosyntezy i sekrecji TRH, modulując na tej drodze czynność układu: podwzgórzeprzysadka-tarczyca. Z tego względu oraz z uwagi na wielokierunkowość działań TRH w ośrodkowym układzie nerwowym (co będzie przedmiotem odrębnego opracowania) peptyd ten pozostaje nadal w sferze zainteresowań wielu ośrodków badawczych. Piśmiennictwo 1. Jackson IMD. Thyrotropin releasing hormone. N Engl J Med 1982; 306: 145-158. 2. Griffiths EC. Thyrotropin releasing hormone: endocrine and central effect. Psychoneuroendocrinology 1985; 10: 225-235. 3. Ciosek J, Orłowska-Majdak M. Thyrotropin-releasing hormone (TRH) inhibits the release of vasopressin but not that of oxytocin from the hypothalamo-neurohypophysial system in haemorrhaged rats. Endocr Regul 1995; 29: 47-55. 4. Ciosek J, Stempniak B. Thyrotropin-releasing hormone (TRH) inhibits vasopressin and oxytocin release from rat hypothalamo-neurohypophysial explants in vitro. Acta Neurobiol Exp 1996; 56: 35-40. 5. Ciosek J, Guzek JW, Stempniak B. Thyrotropin-releasing hormone affects the oxytocin, vasopressin and prolactin release in female rats during midlactation: relation to suckling. J. Physiol Pharmacol 1998; 49: 135-150. 6. Ciosek J, Stempniak B. Thyroliberin and the daily rhythm of vasopressin and oxytocin release from the hypothalamoneurohypophysial system. Pathophysiology 1998; 5:131-139. 7. Ciosek J. Vasopressin and oxytocin release as influenced by thyrotropin-releasing hormone in euhydrated and dehydrated rats. J Physiol Pharmacol 2002; 53: 423-437. 8. Raggenbass M, Vozzi C, Tribollet E et al. Thyrotropinreleasing hormone causes direct excitation of dorsal vagal and solitary tract neurones in rat brain stem slices. Brain Res 1990; 530: 85-90. 9. Nillni EA, Sevarino KA. The biology of pro-thyrotropinreleasing hormone-derived peptides. Endocr Rev 1999; 20: 599-648. 10. Mason GA, Garbutt JC, Prange AJ Jr. Thyrotropinreleasing hormone. Focus on basic neurobiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generations of Progress. (Bloom FL, Kupfer DJ, eds). Raven Press, New York, 1995: 493-503. 11. Nillni EA. Neuroregulation of ProTRH biosynthesis and processing. Endocrine 1999; 10: 185-199. 12. Yamada M, Rudovick S, Wondisford FE et al. Cloning and structure of human genomic DNA and hypothalamic cdna encoding human preprothyrotropin-releasing hormone. Mol Endocr 1990; 4: 551-556. 13. Matre V, Hovring PI, Orstavik S et al. Structural and functional organization of gene encoding the human thyrotropin-releasing hormone receptor. J Neurochem 1999; 72: 40-50. 14. Schaner P, Todd RB, Seidah NG, Nillni EA. Processing of prothyrotropin releasing hormone by the family of prohormone convertases. J Biol Chem 1997; 272: 19958-19968. 15. Mason GA, Garbutt JC, Prange AJ Jr. Thyrotropinreleasing hormone. Focus on basic neurobiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. (Bloom FL, Kupfer DJ, eds). Raven Press, New York, 1995: 493-503. 16. Lee SL, Stewart K, Goodman RH. Structure of the gene encoding rat thyrotropin releasing hormone. J Biol Chem 1988; 263: 16604-16609. 17. Lechan RM, Segerson TP. Pro-TRH gene expression and precursor peptides in rat brain: observations by hybridization analysis and immunocytochemistry. Ann NY Acad Sci 1989; 553: 29-59. 18. Fragner P, Ladram A, Aratan de Leon S. Triiodothyronine down-regulates thyrotropin-releasing hormone (TRH) synthesis and decreases ptrh-(160-169) and insulin releases from fetal rat islets in culture. Endocrinology 1999; 140: 4113-4119. 19. Ceccatelli S, Giardino L, Calzá L. Response of hypothalamic peptide mrnas to thyroidectomy. Neuroendocrinology 1992; 56: 694-703. 20. Toni R, Lechan RM. Neuroendocrine regulation of thyrotropinreleasing hormone (TRH) in the tuberoinfundibular system. J Endocrinol Invest 1993; 16: 715-753. 21. Fekete C, Wittman G, Liposits Z, Lechan RM. GABA-ergic innervation of thyrotropin-releasing hormone-synthesizing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus of the rat. Brain Res 2002; 957: 251-258. 22. Sawchenko PE, Swanson LW. The organization of noradrenergic pathways from the brainstem to the paraventricular and supraoptic nuclei in the rat. Brain Res Rev 1982; 257: 275-325. 23. Sawchenko PE, Swanson LW. The organization of forebrain afferents to the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat. J Comp Neurol 1983; 218: 121-144. 24. Krulich L. Neurotransmitter control of thyrotropin secretion. Neuroendocrinology 1982; 35: 139-147. 25. Terry LC. Regulation of thyrotropin secretion by the central epinephrine system. Studies in the chronically cannulated rat. Neuroendocrinology 1986; 42: 102-108. 26. Grimm Y, Reichlin S. Thyrotropin-releasing hormone (TRH): neurotransmitter regulation of secretion by mouse hypothalamic tissue in vitro. Endocrinology 1973; 93: 626-631. 27. Tapia-Arancibia L, Arancibia S, Astier H. Evidence for alpha1-adrenergic stimulatory control of in vitro release of immunoreactive thyrotropin-releasing hormone from rat median eminence: in vivo corroboration. Endocrinology 1985; 116: 2314-2319. 28. Schettini G, Quattrone A, Di Renzo G et al. Effect of 6- hydroxydopamine on TSH secretion in basal and coldstimulated conditions in the rat. Eur J Pharmacol 1979; 56: 153-157. 29. Arancibia S, Tapia-Arancibia L, Astier H, Assenmacher I. Physiological evidence for alpha1-adrenergic facilitatory control of the cold-induced TRH release in the rat, obtained by push-pull cannulation of the median eminence. Neurosci Lett 1989; 100: 169-174. 30. Price J, Grossman A, Besser GM, Rees LH. Dopaminergic control of the rat thyrotroph. Neuroendocrinology 1983; 36: 125-129. 31. Maeda K, Frohman LA. Release of somatostatin and thyrotropin-releasing hormone from rat hypothalamic fragments in vitro. Endocrinology 1980; 106: 1837-1842. 32. Andersson K, Eneroth P, Roos P. Effects of TRH and a rat TSH preparation on discrete hypothalamic and forebrain catecholamine nerve terminal networks in the hypophysectomized male rat. Eur J Pharmacol 1985; 111: 295-307. 33. Everitt BJ, Hokfelt T, Terenius L et al. Differential coexistence of neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity with catecholamines in the central nervous system of the rat. Neuroscience 1984; 11: 443-462. 34. Legradi G, Lechan RM. The arcuate nucleus is the major source for neuropeptide Y innervation of thyrotropinreleasing hormone neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus. Endocrinology 1998; 139: 3262-3270. 35. Michály E, Fekete C, Tatro JB et al. Hypophysiotropic thyrotropin-releasing hormone-synthesizing neurons in the human hypothalamus are innervated by neuropeptide Y, agouti-related protein, and α-melanocyte-stimulating hormone. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 2596-2603. 36. Heilig M, Vecsei L, Wahlestedt C et al. Effects of centrally administered neuropeptide Y (NPY) and NPY13-36 on the brain monoaminergic system of the rat. J Neural Transm Gen Sect 1990; 79: 193-208. 613

Tyreoliberyna w ośrodkowym układzie nerwowym Ciosek J. 37. Kharchaturian H, Lewis ME, Tsou K, Watson SJ. Betaendorphin, alpha-msh, ACTH, and related peptides. In: Handbook of Chemical Neuroanatomy. GABA and neuropeptides. (Bjorklund A, Hokfelt T, eds). Elsevier, Amsterdam, 1985; vol 4: 273. 38. Arancibia S, Tapia-Arancibia L, Rousssel JP et al. Effect of morphine on cold-induced TRH release from the median eminence of unanaesthetized rats. Life Sci 1986; 38: 59-66. 39. Sharp B, Morley JE, Carlson HE et al. The role of opiates and endogenous opioid peptides in the regulation of rat TSH secretion. Brain Res 1981; 219: 335-344. 40. Wittman G, Sarkar S, Hrabovszky E et al. Galanin- but not galanin-like peptide-containing axon terminals innervate hypophysiotropic TRH synthesizing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus. Brain Res 2004; 1002: 43-50. 41. Luo LG, Bruhn T, Jackson IMD. Glucocorticoids stimulate thyrotropin-releasing hormone gene expression in cultured hypothalamic neurons. Endocrinology 1995; 136: 4945-4950. 42. Bruhn TO, Huang SS, Vaslet C, Nillni EA. Glucocorticoids modulate the biosynthesis and processing of prothyrotropin releasing-hormone (protrh). Endocrine 1998; 9: 143-152. 43. Kakucska I, Qi Y, Lechan RM. Changes in adrenal status affect hypothalamic thyrotropin-releasing hormone gene expression in parallel with corticotrophin-releasing hormone. Endocrinology 1995; 136: 2795-2802. 44. Kovacs KJ, Mezey E. Dexamethasone inhibits corticotrophinreleasing factor gene expression in rat paraventricular nucleus. Neuroendocrinology 1987; 46: 365-368. 45. Blake NG, Eckland DJ, Foster OJ, Lightman SL. Inhibition of hypothalamic thyrotropin-releasing hormone messenger ribonucleic acid during food deprivation. Endocrinology 1991; 129: 2714-2718. 46. Harris M, Aschkenasi C, Elias CF et al. Transcriptional regulation of the thyrotropin-releasing hormone gene by leptin and melanocortin signaling. J Clin Invest 2001; 107: 111-120. 47. Mizuno TM, Kleopoulos SP, Bergen HT et al. Hypothalamic pro-opiomelanocortin mrna is reduced by fasting and in ob/ob and db/db mice, but is stimulated by leptin. Diabetes 1998; 47: 294-297. 48. Sanchez VC, Goldstei J, Stuart RC et al. Regulation of hypothalamic prohormoneconvertases 1 and 2 and effects on processing of prothyrotropin-release hormone. J Clin Invest 2004; 114: 357-369. 49. Legradi G, Emerson CH, Ahima RS et al. Leptin prevents fasting-induced suppression of prothyrotropin-releasing hormone messenger ribonucleic acid in neurons of the hypothalamic paraventricular nucleus. Endocrinology 1997; 138: 2569-2576. 50. Jackson IMD, Wu P, Lechan RM. Immunohistochemical localization of the precursor for thyrotropin-releasing hormone (PRO-TRH) in the rat brain. Science 1985; 229: 1097-1099. 51. Lechan RM, Toni. Thyrotropin-relasing hormone neuronal systems in the central nervous system. In: Neuroendocrinology (Nemeroff CB, ed). CRC Press, Boca Raton, FL, 1992: 279-329. 52. Ishikawa K, Taniguchi Y, Inoue K et al. Immunohistochemical delineation of thyrotropic area: origin of thyrotropin-releasing hormone in the median eminence. Neuroendocrinology 1988; 47: 384-388. 53. Tsuruo Y, Ceccatelli S, Villar MJ et al. Coexistence of TRH with other neuroactive substances in the rat central nervous system. J Chem Neuroanat 1988; 1: 235-253. 54. Ceccatelli S, Eriksson M, Hokfelt T. Distribution and coexistence of corticotrophin-releasing factor, neurotensin-, enkephalin-, cholecystokinin-, galanin- and vasoactive intestinal poplypeptide/peptide histidine isoleucine-like peptides in the parvocellular part of the paraventricular nucleus. Neuroendocrinology 1989; 49: 309-323. 55. Croissandeau G, Schussler N, Grouselle D et al. Evidence of thyrotropin-releasing hormone (TRH) gene expression in rat anterior pituitaries and modulation by estrogen of TRH-like immunoreactivity and TRH-elongated peptide contents. J Endocrinol 1996; 151: 87-96. 56. Lew GM. An immunocytochemical study of thyrotropin releasing hormone in the porcine, ovine and rodent pineal gland. Histochemistry 1989; 91: 43-46. 57. Wolf B, Aratan-Spire S, Czernichow P. Hypothyroidism increases pancreatic thyrotropin-releasing hormone concentration in adult rats. Endocrinology 1984; 114: 1334-1337. 58. Giraud P, Maltese JY, Dutour A et al. Thyrotropin releasing hormone in neonatal rat pancreas. Regulation of biosynthesis and secretion. In: Progress in Neuropeptide Research, (Kohler KD, Pawlikowski M, eds). Birkhauser Verlag, Basel, 1984: 143-153. 59. Štrbák V, Benický J, Nikodémová M. Comparison of pancreatic and hypophysiotropic TRH systems. Physiol Res 2000; 49: S71-S78. 60. Dutour A, Giraud P, Kowalski C et al. Ontogenesis of TRH mrna in the rat pancreas. Biochem Biophys Res Commun 1987; 146: 354-360. 61. Covarrubias L, Uribe RM, Mendez M et al. Neuronal TRH synthesis: developmental and circadian TRH mrna levels. Biochem Biophys Res Commun 1988; 151: 615-622. 62. Lamberton RP, Lechan RM, Jackson IMD. Ontogeny of thyrotropin releasing hormone and histydyl proline diketopiperazine in the rat central nervous system and pancreas. Endocrinology 1984; 115: 2400-2405. 63. Straub R, French G, Joho R, Gershengorn M. Expression cloning of a cdna encoding the mouse pituitary thyrotropinreleasing hormone receptor. Proc Natl Acad Sci 1990; 87: 9514-9518. 64. De La Pena P, Delgado L, Del Camino D, Barros F. Cloning and expression of the thyrotropin-releasing hormone receptor from GH3 rat anterior pituitary cells. Biochem J 1992; 284: 891-899. 65. Matre V, Karlsen HE, Wright MS et al. Molecular cloning of a functional human thyrotropin-releasing hormone receptor. Biochem Biophys Res Commun 1993; 195: 179-185. 66. Cao J, O Donnell D, Vu H et al. Cloning and characterization of a cdna encoding a novel subtype of rat thyrotropinreleasing hormone receptor. J Biol Chem 1998; 273: 32281-32287. 67. Itadani H, Nakamura T, Itoh J et al. Cloning and characterization sof a new subtype of thyrotropin-releasing hormone receptors. Biochem Biophys Res Commun 1998; 250: 68-71. 68. Sato N, Wang X, Greer NIA. An acute release of Ca2+ from sequestered intracellular pools is not the primary transduction mechanism causing the initial burst of PRL and TSH secretion induced by TRH in normal rat pituitary cells. Cell Calcium 1992; 13: 173-182. 69. Shimoda K, Mason GA, Walker CH et al. Administration of chlordiazepoxide affects [3H] [3-metyl histydyl2] thyrotropin-releasing hormone binding in rat brain. Peptides 1991; 12: 199-202. 70. Kiley S, Parker P, Fabbro D, Jaken S. Differential regulation of protein kinase C isozymes by thyrotropin-releasing hormone in GH4C1 cells. J Biol Chem 1991; 266: 23761-23768. 71. Cui Z, Gorelick J, Dannies P. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase-ii activation in rat pituitary cells in the presence of thyrotropin-releasing hormone and dopamine. Endocrinology 1994; 134: 2245-2250. 72. Manaker S, Eichen A, Winokur A et al. Autoradiographic localizations of thyrotropin-releasing hormone receptors in human brain. Neurology 1986; 36: 641-646. 73. Sharif NA. Quantitative autoradiography of TRH receptor in discrete brain regions of different mammalian species. W: Thyrotropin-releasing hormone. Biomedical significance. Ann NY Acad Sci 1989; 553: 147-175. 74. Najimi M, Chigr F, Champier J et al. Autoradiographic distribution of TRH binding sites in the human hypothalamus. Brain Res 1991; 563: 66-76. 75. Eymin C, Champier J, Duvernoy HM et al. Distribution of thyrotropin-releasing hormone binding sites: 614

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) autoradiographic study in infant and adult human hippocampal formation. Brain Res 1993; 605: 139-146. 76. Mitsuma T, Rhue N, Sobue G et al. Distribution of thyrotropinreleasing hormone receptor in rats: an immunohistochemical study. Endocr Regul 1995; 29: 129-134. 77. Fernandez-Agullo T. Thyrotropin-releasing hormone and its receptor in glia. Glia 2001; 33: 267-276. 78. Kanaka S, Yamada M, Satoh T et al. Expression of thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptor mrna in somatotrophs in the rat anterior pituitary. Endocrinology 1997; 138: 827-830. 79. Yu R, Ashworth R, Hinkle PM. Receptors for thyrotropinreleasing hormone on rat lactotropes and thyrotropes. Thyroid 1998; 8: 887-894. 80. O Dowd B, Lee DK, Huang W et al. TRH-R2 exhibits similar binding and acute signaling but distinct regulation and anatomic distribution compared with TRH-R1. Mol Endocrinol 2000; 14: 183-193. 81. Heuer H, Schafer MK, O Donnell D et al. Expression of thyrotropin-releasing hormone receptor 2 (TRH-R2) in the central nervous system of rats. J Comp Neurol 2000; 428: 319-336. 82. Sun Y, Gershengorn MC. Thyrotropin-releasing hormone receptors: similarities and differences. J Mol Endocrinol 2003; 30: 87-97. 83. Griffiths EC, McDermott JR. Enzymic inactivation of hypothalamic regulatory hormones. Mol Cell Endocrinol 1983; 33: 1-25. 84. O Cuinn G, O Conner B, Elmore M. Degradation of thyrotropin-releasing hormone and luteinizing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem 1990; 54: 1-13. 85. Griffiths EC, Kelly JA, Asheroft A et al. Comparative metabolism and conformation of TRH and its analogues. Ann NY Acad Sci 1989; 553: 217-231. 86. Kelly JA. Thyrotropin-releasing hormone: basis and potential for its therapeutic use. Essays Biochem 1995; 30: 133-149. 87. Scanlon MF, Toft AD. Regulation of thyrotropin secretion. In: Werner and Ingbar s The Thyroid: A Fundamental and Clinical Text. (Braverman LE, Utiger RD, eds). Lippincott- Raven Publishers, Philadelphia, 1996; ed 7: 220-240. 88. Vargas MA, Cisneros M, Joseph-Bravo P, Charli JL. Thyrotropin-releasing hormone-induced down-regulation of pyroglutamyl aminopeptidase II activity involves L-type calcium channels and cam kinase activities in cultures of adenohypophyseal cells. J Neuroendocrinol 2002; 14: 184-193. 89. Bauer K, Novak P, Kleinkauf H. Specifity of a serum peptidase hydrolyzing thyroliberin at pyroglutamyl-histidine base. Eur J Biochem 1981; 118: 173-183. 90. O Connor B, O Cuinn G. Purification of and kinetic studies on a narrow specifity synaptosomal membrane pyroglutamate aminopeptidase from guinea pig brain. Eur J Biochem 1985; 150: 47-56. 91. Brewster D. Species variations in TRH inactivation: advantages of stable analogues. In: Thyrotropin-Releasing Hormone, (Griffiths EC, Bennett GW, eds). Raven Press, New York, 1983: 109-118. 615

/ REVIEWS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 5/2004 ISSN 0423-104X Dysregulation of erbb family genes and ErbB (HER) receptors in human thyroid cancers Krzysztof Sworczak 1, Anna Żaczek 2,3, Artur Antolak 4, Piotr Wiśniewski 1, Bogdan Falkiewicz 2, Krzysztof P. Bielawski 2 1 Department of Internal Medicine, Endocrinology and Hemostatic Disorders, Medical University of Gdansk, Poland. 2 Molecular Diagnostics Division, Department of Biotechnology, Intercollegiate Faculty of Biotechnology, University of Gdańsk and Medical University of Gdansk, Poland. 3 Postgraduate School of Molecular Medicine, Warsaw, Poland. 4 Department of Pathology, Saint Wojciech-Adalbertus Hospital, Gdansk, Poland. Summary The paper reviews current knowledge on mutations and expression abnormalities of the ErbB (HER) family receptor tyrosine kinases in human thyroid carcinomas. Genes of erbb family encode four tyrosine kinases (ErbB- 1 or EGFR, ErbB-2, ErbB-3, and ErbB-4), which undergo expression on the surface of various cells, mainly from epidermal and mesenchymal tissues. Genes of erbb family and products of their expression are involved in the growth and proliferation, apoptosis, protein secretion, differentiation and motility of cells, morphogenesis of organs and regeneration of diverse tissues, and they play a significant role in numerous carcinogenic processes. During the development of neoplasm they frequently undergo gene amplification, point mutations and deletions, or gene expression alterations, probably leading to oncogenic activation. However, their role in the development of neuroendocrine tumors is relatively weakly known. Until now only few reports concerning this problem have been published and their results are diverse. In most of the studies immunohistochemical technique was used to analyze ErbB receptors in neoplastic tissue. Relationship between expression of ErbB receptors and local invasion in papillary thyroid cancer and metastasis formation in papillary and follicular thyroid cancer has been described. However the results of some other studies do not support these observations. Mutations such as amplification and deletion in erbb family oncogenes are frequent phenomena. In our study we were found in over 65% cases in various histological forms of thyroid cancer using ddpcr technique. These results suggest that anomalies of erbb oncogenes may play an important role in thyroid cancer development in human. However, prospective evaluation of greater number of patients is required to prove hypothesis. (Pol J Endocrinol 2004; 5(55): 616-624) Key words: oncogenes, erbb genes, ErbB receptors, gene amplification, gene overexpresion, thyroid cancers 616

/ REVIEWS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 5/2004 ISSN 0423-104X Zaburzenia genów rodziny erbb i receptorów ErbB (HER) w rakach gruczołu tarczowego u ludzi Krzysztof Sworczak 1, Anna Żaczek 2,3, Artur Antolak 4, Piotr Wiśniewski 1, Bogdan Falkiewicz 2, Krzysztof P. Bielawski 2 1 Klinika Chorób Wewnętrznych, Endokrynologii i Zaburzeń Hemostazy AM w Gdańsku. 2 Pracownia Diagnostyki Molekularnej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Akademii Medycznej w Gdańsku. 3 Studium Medycyny Molekularnej, Warszawa. 4 Zakład Patologii Szpitala Specjalistycznego Św. Wojciecha Adalberta w Gdańsku. Streszczenie W artykule przedstawiono aktualny stan badań na temat mutacji i zaburzeń ekspresji receptorowych kinaz tyrozynowych rodziny ErbB (HER) w rakach tarczycy u ludzi. Geny rodziny erbb kodują cztery kinazy tyrozynowe (ErbB-1 lub EGFR, ErbB-2, ErbB-3 i ErbB-4), podlegające ekspresji na powierzchni licznych typów komórek, przede wszystkim linii nabłonkowej i mezynchymalnej. Geny rodziny erbb i produkty ich ekspresji są zaangażowane w procesy wzrostu, proliferacji, apoptozy, sekrecji białek, różnicowania oraz przemieszczania się komórek, morfogenezę organów, procesy odżywcze i regeneracyjne tkanek, odgrywają także istotną rolę w wielu procesach nowotworowych. W ich przebiegu ulegają one często amplifikacji, mutacjom punktowym i delecjom, wreszcie zaburzeniom ekspresji, prawdopodobnie wiodącym do onkogennej aktywacji. Rola tej rodziny genów w rozwoju guzów układu neuroendokrynnego jest dotychczas słabo poznana. W przypadku raków tarczycy u ludzi opublikowano zaledwie kilkanaście prac na ten temat, a uzyskane wyniki nie są jednoznaczne. Większość z tych publikacji opiera się na badaniach immunohistochemicznych receptorów ErbB w tkance nowotworowej. Wykazywano, między innymi, związek ich wykrywalnej ekspresji z miejscową inwazyjnością guza w przypadkach raków brodawkowatych oraz obecnością przerzutów odległych w grupie raków brodawkowatych i pęcherzykowych. Jednak nie wszystkie prace potwierdzają te wyniki. Mutacje w postaci amplifikacji lub delecji w obrębie onkogenów rodziny erbb w rakach tarczycy są bardzo częstym zjawiskiem. W badaniach własnych za pomocą ddpcr ich występowanie stwierdzono w ponad 65% przypadków w różnych grupach histologicznych raków tarczycy. Może to świadczyć, że anomalie onkogenów erbb mają istotne znaczenie w rozwoju raków tarczycy u ludzi, jednak by tego dowieść, konieczna jest prospektywna obserwacja liczniejszych grup chorych. (Endokrynol Pol 2004; 5(55): 616-624) Słowa kluczowe: onkogeny, geny erbb, receptory ErbB, amplifikacja genów, nadekspresja genów, raki tarczycy dr med. Krzysztof Sworczak Klinika Chorób Wewnętrznych, Endokrynologii i Zaburzeń Hemostazy Akademii Medycznej w Gdańsku ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk tel. (058) 349-28-40, fax (058) 349-28-41 e-mail: ksworczak@poczta.onet.pl 617

Rodzina receptorów ErbB w rakach tarczycy Sworczak K. 1. Molekularne aspekty raków gruczołu tarczowego Rak tarczycy należy do patologii stosunkowo rzadkich [1, 2]. Stanowi zaledwie 1% wszystkich guzów złośliwych, ale jest to ponad 90% wszystkich nowotworów gruczołów wewnętrznego wydzielania [3, 4, 5]. Częstość występowania raka tarczycy w różnych rejonach świata waha się od 0,6 do 18,2 przypadków na 100 000 osób na rok [1, 3, 4, 6], a na terenie Nowej Kaledonii nawet powyżej 20 [7]. W Polsce średnia zapadalność w 1999 roku wyniosła 3,86 przypadków na 100 000 osób. Daje to około 1500 raków tarczycy rozpoznawanych corocznie w kraju [4]. W USA rozpoznaje się rocznie 15 000 19 000 nowych przypadków z czego około 1100-1200 pacjentów umiera. Stanowi to 0,2% wszystkich zgonów z przyczyn onkologicznych i 63% śmierci z powodu nowotworów układu endokrynnego. Kobiety chorują częściej niż mężczyźni, a średni wiek w chwili rozpoznania to 4-5 dekada życia [2, 3, 5, 8]. Z uwagi na rozprzestrzenianie się schorzeń tarczycy wywołanych niedoborem jodu, rak gruczołu tarczowego stał się poważnym problemem diagnostycznym i klinicznym. Prawie miliard ludzi żyje na obszarach niedoboru jodu, a u około 10% populacji obserwuje się powiększenie tarczycy. Niska zawartość jodu w diecie jest czynnikiem goitrogennym i może prowadzić do rozwoju raka pęcherzykowego lub anaplastycznego, podczas gdy wysokie spożycie jodu zwiększa częstość raka brodawkowatego [2, 4]. Drugim czynnikiem, który spowodował, że epidemiologia raka tarczycy znalazła się w centrum zainteresowania nauki, jest udowodniony wpływ promieniowania jonizującego na powstawanie tego nowotworu, zwłaszcza w młodszych grupach wiekowych [2, 9, 10, 11, 12, 13]. Jednym z efektów narażenia medycznego lub narażenia na to promieniowanie w wyniku eksplozji nuklearnych czy też awarii elektrowni jądrowych, jest zwiększona częstość zachorowań na raka tarczycy [7, 14, 15]. Etiologia raków tarczycy nie jest do końca poznana. Do niedawna wyróżniano 4 główne czynniki biorące udział w powstawaniu tych nowotworów: predyspozycję genetyczną, długotrwałe nadmierne pobudzanie tarczycy przez TSH (Thyroid Stimulating Hormone) lub inne czynniki wzrostowe, niedobór jodu i działanie promieniowania jonizującego na tarczycę [3, 4, 6, 8, 16, 17]. Uwarunkowania dziedziczne odgrywają w rozwoju raka tarczycy szczególnie dużą rolę. Świadczy o tym m.in. bardzo wysoki współczynnik ryzyka drugiego zachorowania na ten nowotwór wśród krewnych pierwszego stopnia, którego wartość jest zawarta w przedziale 4,68-13,70 (średnio - 8,60) [8, 18]. Częstość występowania raków tarczycy zwiększa się w takich schorzeniach genetycznych jak zespół Gardnera (rodzinna polipowatość jelit z objawami pozajelitowymi) lub choroba Cowdena (zespół mnogich hamartoma). Z kolei u kobiet z rakiem brodawkowatym zwiększa się ryzyko wystąpienia raków piersi i nerek [2, 19]. Wprowadzenie nowoczesnych metod biologii molekularnej do badań nad patogenezą nowotworów tarczycy umożliwia stopniowe poznawanie podłoża molekularnego tych chorób. Obecnie wiadomo, że nowotwory tarczycy powstawać mogą w wyniku różnego typu mutacji (delecje, insercje, mutacje punktowe, translokacje, amplifikacje) w obrębie genów kontrolujących wzrost i/lub różnicowanie komórek [19]. Nowotwory złośliwe tarczycy pochodzenia nabłonkowego można podzielić na: 1/ wywodzące się z komórek pęcherzykowych tarczycy, do których zalicza się: rak brodawkowaty PTC (ang. Papillary Thyroid Carcinoma) (50-80% przypadków raka tarczycy), rak pęcherzykowy - FTC (ang. Follicular Thyroid Carcinoma) (15-25%), rak z komórek Hürtle a (1-2%) i rak anaplastyczny (5-15%) oraz 2/ wywodzący się z komórek C rak rdzeniasty MTC (ang. Medullary Thyroid Carcinoma), stanowiący ok. 3-10% wszystkich raków tarczycy [3, 6, 8]. W rozwoju części przypadków MTC związanego z zespołami MEN-2A i MEN-2B oraz w rodzinnej postaci MTC bierze udział onkogen RET kodujący białko receptorowe z aktywnością kinazy tyrozynowej, dla którego ligandem jest GDNF (ang. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor). Mutacje (punktowe) genu RET, zlokalizowane w różnych jego eksonach, są podłożem rodzinnych zachorowań na ten typ nowotworu [20, 21, 22]. Fuzje onkogenu RET z innymi genami w obrębie jednego chromosomu (chromosom 10.) lub w wyniku translokacji pomiędzy chromosomami 10. i 17., ale i 1., 7., 8., 14. czy 18. powstające w wyniku rearanżacji somatycznych i warunkujące konstytutywną aktywację onkogenu zidentyfikowano w znacznym odsetku przypadków PTC. Powstają w ten sposób chimeryczne formy onkogenu RET nazywane PTC (angielski akronim raka brodawkowatego tarczycy) [6, 7, 12 23]. Zidentyfikowano dotychczas jedenaście takich form chimerycznych, najczęściej RET/PTC 1, 2 i 3. RET/PTC wykazano w mniej niż 50% przypadków PTC niezwiązanych z napromieniowaniem [23, 24, 25, 26, 27]. W PTC występujących po napromieniowaniu tarczycy aktywacje RET/PTC (głównie RET/PTC 3) obserwowano w 60-80% przypadków, zarówno u pacjentów z zewnętrznym napromieniowaniem w dzieciństwie, jak i u dzieci z Białorusi po awarii w Czarnobylu [7, 12, 14]. W rakach spontanicznych dominował RET/PTC 1 [28]. W etiologii PTC bierze też udział protoonkogen TRK, kodujący receptor z aktywnością kinazy tyrozynowej dla czynnika wzrostu nerwów - NGF (ang. Nerve Growth Factor) [6, 27]. Zwiększoną 618

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) ekspresję onkogenów c-ras, c-myc, c-met, c-fos, c-cnd1 i c-bcl-2 obserwowano w różnego typu rakach tarczycy [19, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]. Wykazano amplifikację onkogenu c-met, kodującego receptor z aktywnością kinazy tyrozynowej dla czynnika wzrostu hepatocytów HGF (ang. Hepatocyte Growth Factor), w około 70% przypadków PTC oraz 25% FTC [36]. Mutacje punktowe w kodonach 12., 13. i 61. protoonkogenów H-ras, K-ras i N-ras spotyka się w 10-50% FTC i 60% raków anaplastycznych [37]. W patogenezie raków tarczycy udowodniono także udział genów supresorowych: p53, Rb (retinoblastoma), p16ink4a oraz nm23 [27, 29, 38, 39, 40, 41, 42, 43]. Ostatnio wzbudza także zainteresowanie wzmożona ekspresja genu telomerazy w różnego typu rakach tarczycy [44, 45, 46]. 2. Rodzina receptorów ErbB Geny receptorów dla czynników wzrostowych oraz geny enzymów typu kinaz (erbb-1, erbb-2, c-ret, c-met, c-src, c-raf, c-abl) należą do najlepiej zbadanych protoonkogenów. W nieprawidłowych warunkach zmutowane formy protoonkogenów onkogeny biorą udział w procesie rozwoju nowotworów. Aktywacja protoonkogenu może być wywołana mutacją zmieniającą strukturę kodowanego białka, może wiązać się z procesem translokacji protoonkogenu w miejsca, w których znajdują się sekwencje DNA wzmacniające transkrypcję genów; może zachodzić również poprzez amplifikację genu - zwielokrotnienie liczby kopii genu (zjawisko opisano dokładniej we wcześniejszym artykule [47]). W dwu ostatnich sytuacjach produkt genu może być prawidłowy, ale ilość białka może dramatycznie zwiększać się. Wydaje się, że sposób aktywacji protoonkogenów jest swoisty dla poszczególnych genów; niektóre geny aktywowane są głównie w wyniku mutacji punktowych, inne za pomocą translokacji lub fuzji, jeszcze inne poprzez amplifikację. Zasadniczą rolą większości receptorowych kinaz tyrozynowych jest rozpoznawanie i wiązanie czynników wzrostowych. Typowe receptorowe kinazy tyrozynowe są białkami błonowymi; ich domena zewnątrzkomórkowa zawiera miejsce wiążące ligand, którego przyłączenie indukuje homo- i heterodimeryzację receptorów [48, 49, 50], albo też tzw. dimeryzację wtórną (sekwencyjną) [51]. Receptorowe kinazy klasy I, zwane też receptorami epidermalnych czynników wzrostowych lub rodziną receptorów ErbB, są ważne w rozwoju prawidłowych tkanek pochodzenia epidermalnego, mezenchymalnego i neuronalnego, a także w rozwoju procesów nowotworowych [49, 50]. Geny rodziny erbb (erbb- 1, erbb-2, erbb-3 i erbb-4) i kodowane przez nie receptory ErbB są zaangażowane w procesy wzrostu, proliferacji, apoptozy, sekrecji białek, różnicowania i odróżnicowywania się oraz przemieszczania się komórek, morfogenezę organów, procesy odżywcze i naprawcze tkanek [49]. Jak dotąd opisano cztery rodzaje receptorów należących do tej grupy: ErbB-1 lub EGFR (receptor naskórkowego czynnika wzrostu, ang. Epidermal Growth Factor Receptor), ErbB-2, ErbB-3 i ErbB- 4; ludzkie receptory tego typu często nazywane są HER1, HER2 (lub inaczej HER2/neu), HER3 i HER4 [48, 49, 50]. Spośród nich, ErbB-1 i ErbB-2 są uznanymi onkoproteinami, natomiast ErbB-3 i ErbB-4 są białkami o prawdopodobnej funkcji onkogennej. Kinazy ErbB podlegają ekspresji na powierzchni licznych typów komórek, przede wszystkim linii nabłonkowej i mezynchymalnej [48, 49, 50]. Każdy z receptorów ErbB ma własny wzorzec aktywujących go ligandów, co różnicuje ich fizjologiczną rolę [48, 49, 50]. Transdukcja sygnałów zewnątrzkomórkowych do cytoplazmy poprzez receptory ErbB zależy nie tylko od wiązania specyficznych ligandów z receptorami i procesów przewodzenia sygnału, następujących potem, determinowana jest także stężeniem receptorów na powierzchni komórki, m.in. dlatego, że muszą one ulegać dimeryzacji w czasie przewodzenia sygnału [48, 49]. Oprócz potranslacyjnych mechanizmów kontroli stężenia receptorów ErbB na powierzchni komórek, istnieją przynajmniej dwie inne drogi regulacji ekspresji tych białek: zmiany liczby kopii kodujących je genów (amplifikacja/delecja) oraz regulacja ekspresji mrna powstającego w wyniku transkrypcji. Geny te w przebiegu powstawania wielu nowotworów ulegają amplifikacji (zwłaszcza egfr i erbb-2), znacznie rzadziej występują delecje (jedynie w przypadku erbb-1) czy wzrost stężenia ligandów i autokrynna aktywacja kinaz. Jak się wydaje, najczęstszym spośród mechanizmów aktywacji jest nadekspresja kinazy, u podłoża której może leżeć zjawisko amplifikacji (zwielokrotnienia) liczby kopii genu kinazy w komórce i/lub zjawisko nadmiernej aktywności procesów ekspresji kinazy przy obecności jednej (bez amplifikacji) lub większej (z amplifikacją) liczby kopii genu w komórce [47]. Ekspresję lub nadekspresję białek ErbB i/lub amplifikację ich genów stwierdzono w wysokim odsetku różnych nowotworów narządowych (Tab. I). Receptory ErbB są ściśle od siebie funkcjonalnie zależne poprzez proces dimeryzacji [48, 49]. Może istnieć dziesięć różnych homo - lub heterodimerów receptorów ErbB, a ich powstawanie i aktywność wykazują wyraźną hierarchię. Wszystkie heterodimery mają wyższą aktywność biologiczną od homodimerów [48]. Gradacja siły sygnałów mitogennych pochodzących od receptorów rodziny ErbB układa się od homodimerów ErbB-3-ErbB-3 pozbawionych aktywności fosfokinazowej i nie wysyłających sygnałów w ogóle, po heterodimer ErbB-2-ErbB-3 o największej sile sygnału pobudzającego proliferację. W dotych- 619

Rodzina receptorów ErbB w rakach tarczycy Sworczak K. czasowych publikacjach (opartych głównie na immunohistochemii), gdy celem było badanie więcej niż jednego receptora rodziny ErbB w tkance nowotworu, stwierdzano szereg korelacji pomiędzy poszczególnymi receptorami oraz ich koekspresją a niektórymi parametrami klinicznymi [52, 53, 54, 55]. Chow [56] w swoich badaniach nad ekspresją receptorów rodziny ErbB w raku pęcherza moczowego udowodnił, że kombinacje profili ekspresji EGFR, ErbB-2 i ErbB-3 są dokładniejszym wskaźnikiem prognostycznym niż ekspresja każdego receptora oddzielnie. Do podobnych wniosków można dojść obserwując prace grupy Brandta [np. 57], w których badano równocześnie amplifikacje/delecje więcej niż jednego onkogenu erbb. Budowa i funkcja oraz niektóre zaburzenia receptorów rodziny ErbB i metody ich badania zostały omówione dokładniej w poprzednich artykułach [47, 58]. Tab. I. Ekspresja i nadekspresja receptorów rodziny ErbB w niektórych nowotworach złośliwych u ludzi [50, 59 i inne]. Expression and overexpression of ErbB receptors in some human cancers [50, 59 and others]. Rodzaj nowotworu EGFR (%) ErbB-2 (%) ErbB-3 (%) ErbB-4 (%) Płuco 40-80 18-60 25-85 nie badano Pierś 14-91 9-39 22-90 12-82 Żołądek 33-74 8-40 35-100 nie badano Okrężnica 25-77 11-20 65-89 22 Przełyk 43-89 7-64 64 nie badano Wątroba 47-68 0-29 84 61 Trzustka 30-50 19-45 57-63 37-81 Prostata 40-80 40-80 22-96 nie badano Nerka 50-90 0-40 0 nie badano Pęcherz moczowy 35-86 9-50 30-56 30 Jajnik 35-70 8-32 85 93 Głowa i szyja 36-100 17-53 81 28-69 3. Raki tarczycy a rodzina receptorów ErbB Zaburzenia genetyczne onkogenów rodziny erbb w rakach gruczołu tarczowego są słabo poznane, jednak nawet te nieliczne dane z piśmiennictwa pozwalają przypuszczać, że mogą mieć one duże znaczenie. Naskórkowy czynnik wzrostu - EGF (ang. Epidermal Growth Factor) jest ważnym czynnikiem wzrostowym, zarówno w fizjologii, jak i w patologii gruczołu tarczowego [17, 60, 61]. Pobudza on proliferację, migrację i inwazję komórek nowotworowych w liniach komórkowych raka brodawkowatego (PTC-UC3) i pęcherzykowego (FTC 133, FTC 236 i FTC 238) [62]. Komórki raka tarczycy mają wyższą liczbę receptorów dla EGF niż prawidłowa tkanka gruczołu [63]. Immunohistochemicznie, obecność białka receptorowego dla EGF (ErbB-1, EGFR) stwierdzano w różnych guzach tarczycy [17]. W rakach tarczycy typu PTC białko ErbB-1 (EGFR) stwierdzano immunohistochemicznie w wysokim odsetku (78 96%) chorych [34, 35, 38, 64, 65, 66, 67, 68]. Znaleziono korelację pomiędzy immunohistochemiczną obecnością EGFR a miejscową inwazyjnością guza pierwotnego i skróceniem okresu przeżycia bez nawrotów [64] oraz obecnością przerzutów węzłowych, wielkością guza i stopniem zaawansowania klinicznego [38]. Zaobserwowano jednocześnie znamienną korelację pomiędzy nadekspresją EGFR i białka p53 [38]. Stwierdzono (także immunohistochemicznie) koekspresję EGFR i TGFα (ang. Transforming Growth Factor alfa), jednego z ligandów receptora EGFR w rakach typu PTC [35, 64, 68]. W dostępnym piśmiennictwie nie ma prac, w których badano by immunohistochemicznie białko EGFR w przypadku raków typu FTC i MTC. Nadmierna ekspresja danego onkogenu erbb w komórkach nowotworowych może być następstwem amplifikacji, czyli zwielokrotnienia liczby kopii tego genu [69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76]. Morfologicznie, nadmierna ekspresja danego onkogenu wyraża się pojawieniem w błonie komórkowej większej i w związku z tym wykrywalnej metodami immunohistochemicznymi ilości produktu tego genu (białka receptorowego). Dla przykładu ostatnio stwierdzono wysoką znamienną korelację pomiędzy ekspresją białka ErbB-2 w badaniu immunohistochemicznym a amplifikacją genu badanego metodą różnicowej łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. differential Polymerase Chain Reaction - dpcr) w 60 przypadkach raka piersi oraz pomiędzy badaniem immunohistochemicznym a amplifikacją erbb-2 ocenianej techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. Fluorescence In Situ Hybrydization - FISH) w 97 nabłonkowych nowotworach jamy ustnej [77, 78]. Opisywano jednak sytuacje, szczególnie w przypadku erbb-2, gdy w tkance nowotworowej wykrywano immunohistochemicznie znaczne ilości białka ErbB-2 przy braku współistnienia amplifikacji onkogenu erbb-2 [79, 80, 81, 82, 83]. Należy myśleć wtedy o nasilonej transkrypcji przy braku amplifikacji genu [84, 85]. Generalnie dochodzi do deregulacji transkrypcji, co prowadzi do wzrostu mrna niezależnie od amplifikacji genu, a wzrost transkrypcji koreluje z odkrytym niedawno czynnikiem transkrypcyjnym OB2-1 [86]. I odwrotnie, stwierdza się występowanie zjawiska amplifikacji bez równoczesnej nadekspresji amplifikowanego onkogenu [47]. 620

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) W rakach typu PTC obserwowano dwu-, trzykrotnie wyższe stężenia mrna dla onkoproteiny ErbB-1 w porównaniu do nienowotworowej tkanki tarczycowej [87, 88]. W piśmiennictwie znajdują się tylko 2 prace, w których badano amplifikację genu erbb-1 (egfr) w raku tarczycy. Zarówno Aasland [87], jak i Lemoine [89] nie stwierdzili amplifikacji erbb-1 metodą Southerna (ang. Southern blotting) w różnego rodzaju rakach gruczołu tarczowego. W badaniach własnych stwierdziliśmy odsetek amplifikacji erbb-1 odpowiednio: w PTC w 21,6% przypadków, w FTC 23,5% i w MTC 6,7% przypadków [59]. Stosowana przez nas podwójnie różnicowa technika PCR (ang. double differential PCR - ddpcr) jest lepsza pod względem czułości od techniki hybrydyzacji wg Southerna i jest wystarczająca do analizowania próbek tkanek nowotworowych z bardzo małych ilości materiału wyjściowego (np. biopsja aspiracyjna cienkoigłowa, mocno zdegradowany materiał archiwalny z bloczków parafinowych) [32, 57, 90]. Wśród całej rodziny receptorów ErbB, onkoproteina ErbB-2 i kodujący ją gen erbb-2 są najlepiej przebadane w wielu typach nowotworów złośliwych. Mało natomiast wiadomo o ich roli w przypadkach nowotworów układu endokrynnego. Immunohistochemicznie białko ErbB-2 (błonowe, jak i cytoplazmatyczne) stwierdzano u wysokiego odsetka (50 88%) chorych z PTC [29, 34, 35, 67, 88, 91, 92, 93, 94]. Jedynie Lemoine [89] nie potwierdził nadekspresji onkoproteiny ErbB-2 w żadnym z 24 badanych raków tarczycy typu PTC. Obserwowano także nadekspresję tego receptora na poziomie erbb-2 mrna w 14-30% przypadków [30, 32, 87, 88, 93]. Znaczenie kliniczne tych obserwacji nie do końca jest jasne. Sugg [30, 93] stwierdziła przy pomocy kompetycyjnej RT-PCR podwyższone stężenia erbb-2 mrna w 20-30% PTC (4/20 i 11/34) w porównaniu z prawidłową tkanką tarczycy, chociaż były one konsekwentnie niższe niż stężenia mrna w komórkach raka piersi linii SKBR-3, znanej z nadekspresji ErbB-2 z amplifikacją odpowiedniego genu (9-11 kopii). Wzrost stężenia mrna nie korelował z klinicznymi cechami agresywności guzów. Zaobserwowała ona także, że cytoplazmatyczna obecność ErbB-2 jest powiązana z lepszym rokowaniem [93]. Podobne wyniki uzyskał Akslen [34]. Autor ten badając immunohistochemicznie ekspresję ErbB-2 w 127 próbkach PTC stwierdził, że jest ona znamiennie wyższa (p = 0,026) u mlodych chorych, u których rokowanie PTC jest lepsze niż u chorych starszych wiekiem [6, 95]. Także obecność błonowego barwienia na ErbB-2 była znamiennie częstsza u pacjentów bez przerzutów węzłowych (69%) w porównaniu z grupą z węzłami przerzutowymi (33%) (p = 0,0003) oraz znamiennie korelowała z wyższym histologicznym stopniem złośliwości guza pierwotnego [34]. Zaobserwowano 62% pozytywnego barwienia na ErbB-2 w guzach o niskim stopniu złośliwości w porównaniu do 28% w grupie PTC z wysokim histologicznym stopniem złośliwości (obecność znacznej atypii jąder, martwicy guza i inwazji naczyń (p = 0,0006). Wreszcie w jednoczynnikowej analizie Akslen stwierdził, że brak cytoplazmatycznego barwienia na ErbB-2 był związany z redukcją czasu przeżycia chorych z PTC, szczególnie u kobiet (p = 0,0009) [34]. Przeciwnie, Utrilla [94], także obserwując błonowe i cytoplazmatyczne barwienie na ErbB-2, w 52% przypadków PTC (13/25) nie wykazał korelacji pomiędzy ekspresją tej onkoproteiny a obecnością lub nieobecnością przerzutów w węzłach chłonnych. Potwierdzają to wyniki naszych badań, w których nie obserwowaliśmy zależności pomiędzy średnią liczbą kopii genu (ang. Average Gene Copy Number AGCN) i liczbą amplifikacji erbb-2 a stanem węzłów chłonnych w 52 przypadkach PTC [59]. Ostatnio Kremser [96] w grupie 103 chorych z PTC i FTC stwierdził, że w obu typach nowotworu grupy bez przerzutów odległych wykazywały znamiennie słabsze cytoplazmatyczne barwienie ErbB-2, niż pacjenci z ich obecnością. Po raz pierwszy autorzy ci udowodnili istotną statystycznie korelację pomiędzy nadekspresją ErbB-2 a rokowaniem w dużej liczebnie grupie chorych z zróżnicowanym rakiem tarczycy. Wielu autorów nie stwierdziło immunohistochemicznie obecności białka ErB-2 zarówno w gruczolakach, jak i w FTC oraz rakach anaplastycznych [33, 88, 89, 94]. Przeciwnie, Kremser [96] stwierdził immunoreaktywność ErbB-2 we wszystkich badanych FTC, a Czyż [97] w 50% gruczolaków pęcherzykowych (10/20) i 36,7% FTC (11/30). Ten drugi autor za pomocą RT-PCR stwierdził ekspresję erbb-2 w 90% gruczolaków pęcherzykowych (18/20) i w żadnym z 30 przypadków FTC [97]. Ostatnio, Gumurdulu [91] stwierdził immunohistochemicznie obecność ErbB-2 w 58% (12/20) gruczolaków i 40% (8/20) raków pęcherzykowych tarczycy. Roncalli [98] nie obserwował immunohistochemicznej obecności Erbb-2 w 28 przypadkach MTC. Podobne obserwacje poczynił Haugen [88]. Przeciwnie, Utrilla [94] wykazał nadekspresję ErbB-2 (badaną immunohistochemicznie) we wszystkich (18/18) analizowanych przypadkach MTC. Potwierdza to praca Soaresa [92] i ostatnio Gumurdulu [91]. Podobnie Ensinger [99] stwierdził immunohistochemicznie ekspresję produktu genu erbb-2 (Her2/neu) we wszystkich 6 badanych MTC, a także z większą jeszcze intensywnością, w hiperplastycznych komórkach C obecnych w pozostałej zdrowej tkance tarczycy pobranej od tego samego pacjenta. W pracy tej wykazano wysoce znamienną korelację pomiędzy ekspresją erbb-2 a naciekaniem guza poza torebkę tarczycy (stopień pt4 w klasyfikacji TNM). W nielicznych dostępnych publikacjach nie obserwowano amplifikacji erbb-2 w przypadkach 621

Rodzina receptorów ErbB w rakach tarczycy Sworczak K. PTC i FTC badanych (mniej czułą niż ddpcr) metodą Southerna [87, 89, 92], jak również w PTC badanych metodą kompetycyjnej PCR [30, 93]. Bieche [32] w 2001 roku za pomocą RT-PCR opartej na technologii TaqMan nie stwierdził amplifikacji erbb-2 w 9 przypadkach PTC, 2 przypadkach FTC i 1 raku anaplastycznym. W innej pracy na 27 raków tarczycy amplifikację erbb-2 stwierdzono tylko w jednym przypadku [100]. Ostatnio Kremser [96] w 2003 roku metodą FISH wykazał amplifikację genu erbb-2 w 20% (2/10) przypadków PTC i FTC. W piśmiennictwie nie ma prac, które badałyby zjawisko amplifikacji/delecji onkogenu erbb-2 w rakach rdzeniastych tarczycy. W badaniach własnych w stosunkowo licznych grupach (52 PTC, 19 FTC i 15 MTC) stwierdziliśmy metodą ddpcr amplifikację erbb-2 odpowiednio w 32,4; 42,1 i 40,0% przypadków [59]. Gen kodujący receptor ErbB-3 został po raz pierwszy zidentyfikowany w 1989 roku [101]. Nie ma jak na razie pewnych dowodów na to, że gen erbb-3 jest również onkogenem i w przeciwieństwie do erbb-1 i erbb-2 niewiele wiadomo o mutacjach erbb-3 w przypadku różnego rodzaju nowotworów [58, 101, 102, 103]. W światowym piśmiennictwie dostępne są tylko pojedyncze publikacje dotyczące znaczenia onkoproteiny ErbB-3 w guzach złośliwych tarczycy [66, 67]. Haugen [67] stwierdził immunohistochemicznie nadekspresję ErbB-3 w większości przypadków PTC (53/56), FTC (4/6), MTC (7/8) i raków anaplastycznych (3/3), natomiast tylko słabą immunoreaktywność w 3 na 13 przypadków gruczolaka pęcherzykowego i jej brak w 11 przypadkach wola koloidowego oraz 23 próbkach prawidłowej tkanki tarczycy. W pracy Flugego, Haugena i współpracowników w tych samych próbkach wykazano korelację pomiędzy cytoplazmatyczną lub błonową ekspresją ErbB-3 i cytoplazmatyczną ekspresją hereguliny beta 3 (Hrg 3) [66]. Nie wykazano metodą Southerna amplifikacji onkogenu erbb-3 w żadnym z 17 badanych przypadków raka tarczycy (14 PTC i 3 FTC) [67]. W badaniach własnych w stosunkowo licznych grupach (52 PTC, 19 FTC i 15 MTC) stwierdziliśmy metodą ddpcr amplifikację erbb-3 odpowiednio w 23,1; 33,3 i 20,0% przypadków [59]. Ostatnim przedstawicielem rodziny receptorów ErbB jest najpóźniej odkryty, bo w 1993 roku, ErbB- 4 (HER4) [104]. Ekspresja genu erbb-4 jest częstym zjawiskiem w liniach komórkowych raka piersi. Istnieją dane z piśmiennictwa wskazujące na jej obecność w 70-80% przypadków tego nowotworu [50]. Jak na razie opublikowano niewiele badań o roli erbb-4 w onkogenezie, a w szczególności w guzach układu endokrynnego [105]. W jedynej dostępnej w piśmiennictwie pracy nie wykazano metodą Southerna amplifikacji onkogenu erbb-4 w żadnym z 17 badanych przypadków zróżnicowanego raka tarczycy (14 przypadków PTC i 3 FTC) [67]. Ten sam autor immunohistochemiczną nadekspresję ErbB-4 obserwował w 55 na 56 przypadków PTC, we wszystkich 6 badanych FTC oraz w 3 na 3 badane raki anaplastyczne. W badaniach własnych w stosunkowo licznych grupach (52 PTC, 19 FTC i 15 MTC) stwierdziliśmy metodą ddpcr amplifikację erbb-4 odpowiednio w 15,4; 21,1 i 13,3% przypadków [59]. Posumowując, zaburzenia ekspresji oraz mutacje onkogenów erbb w różnego typu rakach tarczycy są częstym zjawiskiem. Wysoka częstość występowania anomalii pozwala podejrzewać, że mogą one odgrywać znaczącą rolę w patogenezie tych nowotworów. Co więcej, ponieważ stan receptorów rodziny ErbB może być potencjalnie czynnikiem predykcyjnym, decydującym o wyborze metody leczenia (np. ErbB-2 w raku piersi), jak również celem terapeutycznym (jak EGFR czy ErbB-2, przeciwko którym w niektórych nowotworach już stosuje się specyficzne inhibitory lub przeciwciała), lepsze zbadanie zaburzeń tej grupy białek w rakach tarczycy może nam dać dużą wartość informacyjną i nowe środki terapeutyczne możliwe do wykorzystania u tej licznej grupy chorych. Jednak potwierdzenie tych sugestii wymaga dalszych, najlepiej prospektywnych badań z udziałem liczniejszych grup chorych. Piśmiennictwo 1. Monson JP. The epidemiology of endocrine tumours. Endocr Relat Cancer 2000; 7: 29-36. 2. Bi J, Lu B. Advances in the diagnosis and management of thyroid neoplasms. Curr Opin Oncol 2000; 12: 54-59. 3. Schmutzler C, Koehrle J. Innovative strategies for the treatment of thyroid cancer. Eur J Endocrinol 2000; 143: 15-24. 4. Szybiński Z, Huszno B, Rachtan J et al. Epidemiologia raka tarczycy w Polsce. Wiad Lek 2001; 54 supl. 1: 106-116. 5. Mazzaferri EL, Kloos RT. Current approaches to primary therapy for papillary and follicular thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 1447-1463. 6. Pacini F, DeGroot LJ. Thyroid neoplasia. In: Endocrinology, 4th Edition, Vol. 3. DeGroot LJ and Jameson JL (eds.) W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2001; 1541-1566. 7. Chua EL, Wu WM, Tran KT et al. Prevalence and distribution of ret/ptc 1, 2 and 3 in papillary thyroid carcinoma in New Caledonia and Australia. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 2733-2739. 8. Huang Y, Prasad M, Lemon WJ et al. Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals highly consistent profiles. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15044-15049. 9. Kazakov VS, Demidchik EP, Astakhova LN. Thyroid cancer after Chernobyl. Nature 1992; 359: 21-22. 10. Kerber RA, Till JE, Simon SL et al. A cohort study of thyroid disease in relation to fallout from nuclear weapons testing. JAMA 1993; 270: 2076-2082. 11. Szybiński Z, Olko P, Przybylik-Mazurek E, Burzyński M. Promieniowanie jonizujące jako czynnik ryzyka raka tarczycy w obszarze Krakowa i Nowego Sącza. Wiad Lek 2001; 54 supl. 1: 151-155. 12. Bounacer A, Wicker R, Caillou B et al. High prevelence of activating ret proto-oncogene rearrangements in thyroid tumors from patients who had received external radiation. Oncogene 1997; 15: 1263-1273. 13. Nikiforov YE, Nikiforova MN, Gnepp DR, Fagin JA. Prevalence of mutations of ras and p53 in benign and malignant thyroid 622

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 5 (55) tumors from children exposed to radiation after the Chernobyl nuclear accident. Oncogene 1996; 13: 687-693. 14. Thomas GA, Bunnell H, Cook HA et al. High prevalence of RET/PTC rearrangements in Ukrainian and Belarussian post- Chernobyl thyroid papillary carcinomas: A strong correlation between RET/PTC3 and the solid-follicular variant. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 4232-4238. 15. Nikiforov YE, Gnepp DR, Fagin JA. Thyroid lesions in children and aldoscents after the Chernobyl disaster: implications for the study of radiation tumorigenesis. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 9-14. 16. Kimura T, Van Keymeulen A, Golstein J et al. Regulation of thyroid cell proliferation by TSH and other factors: a critical evaluation of in vitro models. Endocr Reviews 2001; 22: 631-656. 17. Lewiński A, Gesing A. Czynniki wzrostowe gruczołu tarczowego i ich udział w patogenezie raka tarczycy. Endokrynol Pol, 1995; 46 Supl 2: 11-27. 18. Steffen J. Uwarunkowania dziedziczne w zachorowaniach na raka tarczycy. Endokrynol Pol 1995; 46 Supl 2: 9-10. 19. Łącka K. Podstawy molekularne nowotworów złośliwych tarczycy. Endokrynol Pol 1995; 46 Supl 2: 29-39. 20. Trupp M, Arenas E, Fainzilber M et al. Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret oncogene. Nature 1996; 381: 785-793. 21. Wiench M, Włoch J, Wygoda Z et al. Genetic diagnosis of Multiple Endocrine Neoplasia Type 2B. Pol J Endocrinol 2000; 51: 67-76. 22. Wiench M, Kwaśniewski M, Gubała E et al. Mutacje somatyczne protoonkogenu RET w raku rdzeniastym tarczycy. Wiad Lek 2001; 54 supl. 1: 415-421. 23. Wiench M, Włoch J, Oczko M et al. Rearanżacje genu RET w raku brodawkowatym tarczycy. Wiad Lek 2001; 54 supl. 1: 64-71. 24. Santoro M, Carlomagno F, Hay ID et al. Ret oncogene activation in human thyroid neoplasms is restricted to the papillary cancer subtype. J Clin Invest 1992; 89: 1517-1522. 25. Sugg SL, Ezzat S, Rosen IB et al. Distinct multiple RET/PTC gene rearrangements in multifocal papillary thyroid neoplasia. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 4116-4122. 26. Sugg SL, Zheng L, Rosen IB et al. ret/ptc-1, -2, and -3 oncogene rearrangements in human thyroid carcinomas: implications for metastatic potential? J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 3360-3365. 27. Lewiński A, Ferenc T, Sporny S, Jarząb B. Thyroid carcinoma: diagnostic and therapeutic approach: genetic background (review). Endocr Regul 2000; 34: 99-113. 28. Nikiforov YE, Rowland JM, Bove KE et al. Distinct pattern of ret oncogene rearrangements in morphological variants of radiation-induced and sporadic thyroid papillary carcinomas in children. Cancer Res 1997; 57: 1690-1695. 29. Soda G, Antonaci A, Bosco D et al. Expression of bcl-2, c-erbb-2, p53, and p21 (waf1-cip1) protein in thyroid carcinomas. J Exp Clin Cancer Res 1999; 18: 363-367. 30. Sugg SL, Ezzat S, Zheng L et al. Oncogene profile of papillary thyroid carcinoma. Surgery 1999; 125: 46-52. 31. Namba H, Rubin SA, Fagin JA. Point mutations of ras oncogenes are an early event in thyroid tumorogenesis. Mol Endocrinol 1990; 4: 1474-1479. 32. Bieche I, Franc B, Vidaud D et al. Analyses of MYC, ERBB2, and CCND1 genes in benign and malignant thyroid follicular cell tumors by real-time polymerase chain reaction. Thyroid 2001; 11: 147-152. 33. Auguste LJ, Masood S, Westerband A et al. Oncogene expression in follicular neoplasms of the thyroid. Am J Surg 1992; 164: 592-593. 34. Akslen LA, Varhaug JE. Oncoproteins and tumor progression in papillary thyroid carcinoma: presence of epidermal growth factor receptor, c-erbb-2 protein, estrogen receptor related protein, p21-ras protein, and proliferation indicators in relation to tumour recurrences and patient survival. Cancer 1995; 76: 1643-1654. 35. Haugen DR, Akslen LA, Varhaug JE, Lillehaug JR. Demonstration of a TGF-alpha-EGF-receptor autocrine loop and c-myc protein over-expression in papillary thyroid carcinomas. Int J Cancer 1993; 55: 37-43. 36. Di Renzo MF, Olivero M, Ferro S et al. Overexpression of the c-met/hgf receptor gene in human thyroid carcinomas. Oncogene 1992; 7: 2549-2553. 37. Lemoine NR, Mayall ES, Wyllie FS et al. High frequency of ras oncogene activation in all stages of human thyroid tumorigenesis. Oncogene 1989; 4: 159-164. 38. Chen BK, Ohtsuki Y, Furihata M et al. Co-overexpression of p53 protein and epidermal growth factor receptor in human papillary thyroid carcinomas correlated with lymph node metastasis, tumor size and clinicopathologic stage. Int J Oncol 1999; 15: 893-898. 39. Hosal SA, Apel RL, Freeman JL et al. Immunohistochemical localization of p53 in human thyroid neoplasms: correlation with biological behavior. Endocr Pathol 1997; 8: 21-28. 40. Zou M, Shi Y, Farid NR. p53 mutations in all stages of thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 1993; 77: 1054-1058. 41. Freeman J, Carroll C, Asa S, Ezzat S. Genetic events in the evolution of thyroid cancer. J Otolaryngol 2002; 31: 202-206. 42. Fogelfeld L, Bauer TK, Schneider AB et al. p53 gene mutation in radiation-induced thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 3039-3044. 43. Farid NR. P53 mutations in thyroid carcinoma: tidings from and old foe. J Endocrinol Invest 2001; 24: 536-545. 44. Brousset P, Chaouche N, Leprat F et al. Telomerase activity in human thyroid carcinomas originating from the follicular cells. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 4214-4216. 45. Hoang-Vu C, Boltze C, Gimm O et al. Expression of telomerase genes in thyroid carcinoma. Int J Oncol 2002; 21: 265-272. 46. Suzuki S, Fukushima T, Ami H et al. New attempt of preoperative differential diagnosis of thyroid neoplasms by telomerase activity measurement. Oncol Rep 2002; 9: 539-544. 47. Bielawski KP, Vogt U, Brandt B, Falkiewicz B. Zaburzenia funkcji receptorów ErbB (HER): mechanizmy i metody badania. Część I. Amplifikacja genów rodziny ErbB (HER). Współcz Onkol 2000; 4: 102-107. 48. Marmor MD, Skaria BK, Yarden Y. Signal transduction and oncogenesis by ErbB/HER receptors. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004; 58: 903-13. 49. Holbro T, Hynes NE. ErbB receptors: directing key signaling networks throughout life. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004; 44: 195-217. 50. Normanno N, Bianco C, De Luca A et al. Target-based agents against ErbB receptors and their ligands: a novel approach to cancer treatment. Endocr Relat Cancer 2003; 10: 1-21. 51. Gamett DC, Pearson G, Cerione RA, Friedberg I. Secondary dimerization between members of the Epidermal Growth Factor Receptor family. J Biol Chem 1997; 272: 12052 6. 52. Witton CJ, Reeves JR, Going JJ et al. Expression of the HER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer. J Pathol 2003; 200: 290-7. 53. Xia W, Lau YK, Zhang HZ et al. Combination of EGFR, HER- 2/neu, and HER-3 is a stronger predictor for the outcome of oral squamous cell carcinoma than any individual family members. Clin Cancer Res 1999; 5: 4164-74. 54. Suo Z, Risberg B, Kalsson MG et al. EGFR family expression in breast carcinomas. c-erbb-2 and c-erbb-4 receptors have different effects on survival. J Pathol 2002; 196: 17-25. 55. Hudelist G, Singer CF, Manavi M et al. Co-expression of ErbBfamily members in human breast cancer: Her-2/neu is the preferred dimerization candidate in nodal-positive tumors. Breast Cancer Res Treat 2003; 80: 353 61. 56. Chow NH, Chan SH, Tzai TS et al. Expression profiles of ErbB family receptors and prognosis in primary transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Clin Cancer Res 2001; 7: 1957-62. 57. Brandt B, Vogt U, Schlotter C.M et al. Prognostic relevance of aberrations in the erbb oncogenes from breast, ovarian, oral and lung cancers: double-differential polymerase chain reaction (ddpcr) for clinical diagnosis. Gene 1995; 159: 35-42. 58. Bielawski KP, Vogt U, Falkiewicz B. Budowa i funkcje receptorów ErbB (HER). Współcz Onkol 1999; 3: 241-243. 59. Sworczak K. Anomalie liczby kopii genów protoonkogenów rodziny erbb w rakach gruczołu tarczowego i w guzach chromochłonnych u ludzi. Rozprawa habilitacyjna. Annales Acad Med Gedan 2003; 33 supl. 5: 1-169. 60. Brzezinski J, Lewinski A. Increased plasma concentration of epidermal growth factor in female patients with non-toxic nodular goitre. Eur J Endocrinol 1998; 138: 388-393. 623

Rodzina receptorów ErbB w rakach tarczycy Sworczak K. 61. Mizukami Y, Nonomura A., Hashimoto T et al. Immunohistochemical demonstration of epidermal growth factor and c-myc oncogene product in normal, benign and malignant thyroid tissues. Histopathology 1991; 18: 11-18. 62. Hoelting T, Siperstein AE, Clark OH, Duh QY. Epidermal growth factor enhances proliferation, migration, and invasion of follicular and papillary thyroid cancer in vitro and in vivo. J Clin Endocrinol Metab 1994; 79: 401-408. 63. Duh QY, Gum ET, Gerend PL et al. Epidermal growth factor receptors in normal and neoplastic thyroid tissue. Surgery 1985; 98: 1000-1007. 64. Aasland R, Akslen LA, Varhaug JE, Lillehaug JR. Co-expression of the genes encoding transforming growth factor-alpha and its receptor in papillary carcinomas of the thyroid. Int J Cancer 1990; 46: 382-387. 65. Akslen LA, Myking AO, Salvesen H, Varhaug JE. Prognostic impact of EGF-receptor in papillary thyroid carcinoma. Br J Cancer 1993; 68: 808-812. 66. Fluge O, Akslen LA, Haugen DR et al. Expression of heregulins and associations with the ErbB family of tyrosine kinase receptors in papillary thyroid carcinomas. Int J Cancer 2000; 87: 763-770. 67. Haugen DR, Akslen LA, Varhaug JE, Lillehaug JR. Expression of c-erbb-3 and c-erbb-4 proteins in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res 1996; 56: 1184-1188. 68. Lemoine NR, Hughes CM, Gullick WJ et al. Abnormalities of the EGF receptor system in human thyroid neoplasia. Int J Cancer 1991; 49: 558-561. 69. Altimari A, Fiorentino M, Gabusi E et al. Investigation of ErbB1 and ErbB2 expression for therapeutic targeting in primary liver tumours. Dig Liver Dis 2003; 35: 332-338. 70. Bankfalvi A, Simon R, Brandt B et al. Comparative methodological analysis of erbb-2/her-2 gene dosage, chromosomal copy number and protein overexpression in breast carcinoma tissues for diagnostic use. Histopathology 2000; 37: 411-419. 71. Bankfalvi A, Giuffre G, Ofner D et al. Relationship between HER2 status and proliferation rate in breast cancer assessed by immunohistochemistry, fluorescence in situ hybridisation and standardised AgNOR analysis. Int J Oncol 2003; 23: 1285-1292. 72. Geddert H, Zeriouh M, Wolter M et al. Gene amplification and protein overexpression of c-erb-b2 in Barrett carcinoma and its precursor lesions. Am J Clin Pathol 2002; 118: 60-66. 73. Libermann TA, Nusbaum HR, Razon N et al. Amplification and overexpression of EGF receptor gene in primary human glioblastomas. J Cell Sci 1985; 3 (Suppl.): 161-172. 74. Malden LT, Novak U, Kaye AH, Burgess AW. Selective amplification of the cytoplasmic domain of the epidermal growth factor receptor gene in glioblastoma multiforme. Cancer Res 1988; 48: 2711-2714. 75. Schwechheimer K, Huang S, Cavenee WK. EGFR gene amplification-rearrangement in human glioblastomas. Int J Cancer 1995; 62: 145-148. 76. Sworczak K, Żaczek A, Lisowska U et al. Zaburzenia genów rodziny erbb i receptorów ErbB (HER) w pheochromocytoma. Współcz Onkol 2004; 8: 213-218. 77. Erdokan S, Ergin M, Tuncer I. Comparison of differential PCR and immunohistochemistry for the evaluation of c-erbb-2 in breast carcinoma and relationship to other prognostic factors. Neoplasma 2003; 50: 326-330. 78. Scheer M, Prange W, Petmecky K et al. Evaluation of her-2/neu amplification/overexpression in OSCC with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry. Mund Kiefer Gesichtschir 2003; 7: 138-145. 79. Barbashina V, Benevenia J, Aviv H et al. Oncoproteins and proliferation markers in synovial sarcomas: a clinicopathologic study of 19 cases. J Cancer Res Clin Oncol 2002; 128: 610-616. 80. Berger MS, Greenfield C, Gullick WJ et al. Evaluation of epidermal growth factors in bladder tumours. Br J Cancer 1987; 56: 533-537. 81. Berger MS, Locher G.W., Saurer S., Gullick W.J., Waterfield M.D., Groner B., Hynes N.E.: Correlation of c-erbb-2 gene amplification and protein expression in human breast carcinoma with nodal status and nuclear grading. Cancer Res., 1988, 48, 1238-1243. 82. Horvai AE, Li L, Xu Z et al. Malignant mesothelioma does not demonstrate overexpression or gene amplification despite cytoplasmatic immunohistochemical staining for c-erbb-2. Arch Pathol Lab Med 2003; 127: 465-469. 83. Skalova A, Starek I, Vanecek T et al. Amplification and overexpression of HER-2/neu in parotid gland duct carcinoma. Immunohistochemical study and fluorescence in situ hybridization. Cesk Patol 2002; 38 (Suppl.1): 27-34. 84. Yamanaka Y, Friess H, Kobrin MS et al. Overexpression of HER2/neu oncogene in human pancreatic carcinoma. Hum Pathol 1993; 24: 1127-1134. 85. Zadrożny M, Smolarz B, Romanowicz-Makowska H et al. Genetic analysis of HER-2/neu gene amplification in paraffin embedded tumour tissue in women with breast cancer. Pol J Pathol 2002; 53: 189-193. 86. Hollywood DP, Hurst HC. A novel transcription factor, OB2-1, is required for overexpression of the proto-oncogene c-erbb-2 in mammary tumour lines. EMBO J 1993; 12: 2369-2375. 87. Aasland R, Lillehaug JR, Male R et al. Expression of oncogenes in thyroid tumours: co-expression of c-erbb2/neu and c-erbb. Br J Cancer 1988; 57: 358-363. 88. Haugen DR, Akslen LA, Varhaug JE, Lillehaug JR. Expression of c-erbb-2 protein in papillary thyroid carcinomas. Br J Cancer 1992; 65: 832-837. 89. Lemoine NR, Wyllie FS, Lillehaug JR et al. Absence of abnormalities of the c-erbb-1 and c-erbb-2 proto-oncogenes in human thyroid neoplasia. Eur J Cancer 1990; 26: 777-779. 90. Brandt B, Vogt U, Griwatz C. Detection of amplified oncogenes by differential polymerase chain reaction. In: Rolfs A, Weber- Rolfs I, Finckh U, editors: Methods in DNA amplification. New York: Plenum Press, 1994; 55-64. 91. Gumurdulu D, Uguz A, Erdogan S et al. Expression of c- erbb-2 oncoprotein in different types of thyroid tumors: an immunohistochemical study. Endocr Res 2003; 29: 465-472. 92. Soares P, Sambade C, Sobrinho-Simoes MA. Expression of c- erbb-2 protein in papillary thyroid carcinomas. Int J Cancer 1994; 56: 459-461. 93. Sugg SL, Ezzat S, Zheng L et al. Cytoplasmic staining of erbb-2 but not mrna levels correlates with differentiation in human thyroid neoplasia. Clin Endocrinol (Oxf) 1998; 49: 629-637. 94. Utrilla JC, Martin-Lacave I, San Martin MV et al. Expression of c- erbb-2 oncoprotein in human thyroid tumours. Histopathology 1999; 34: 60-65. 95. Sporny S. Rak brodawkowaty tarczycy. W: Cytodiagnostyka chorob tarczycy. Studio Graficzne Sobiepański-Trocha s.c. Łódź 1999; 97-116. 96. Kremser R, Obrist P, Spizzo G et al. Her2/neu overexpression in differentiated thyroid carcinomas predicts metastatic disease. Virchows Arch 2003; 442: 322-328. 97. Czyż W, Balcerczak E, Rudowicz M et al. Expression of C-ERBB2 and P65 genes and their protein products in follicular neoplasms of thyroid gland. Folia Histochem Cytobiol 2003; 41: 91-95. 98. Roncalli M, Springall DR, Varndell IM et al. Oncoprotein immunoreactivity in human endocrine tumours. J Pathol 1991; 163: 117-127. 99. Ensinger C, Prommegger R, Kendler D et al. Her2/neu expression in C-cell hyperplasia and medullary thyroid carcinomas. Anticancer Res 2003; 23: 2241-2243. 100.Knyazev PG, Imyanitov EN, Chernitca OI et al. Amplification of ERBB-2 (HER-2/NEU) oncogene in different neoplasms of patients from USSR. Oncology 1992; 49: 162-165. 101.Kraus MH, Issing W, Miki T et al. Isolation and characterisation of ERBB3, a third member of the ERBB/epidermal growth factor receptor family; evidence of overexpression in a subset of human mammary tumours. Proc Natl Acad Sci 1989; 86: 9193-9197. 102.Lee JC, Wang ST, Chow NH, Yang HB. Investigation of the prognostic value of coexpressed erbb family members for the survival of colorectal cancer patients after curative surgery. Eur J Cancer 2002; 38: 1065-1071. 103.Vogt U, Bielawski K, Schlotter CM et al. Amplification of erbb-4 oncogene occurs less frequently than that of erbb-2 in primary human breast cancer. Gene 1998; 223: 375-380. 104.Plowman GD, Culouscou JM, Whitney GS et al. Ligandspecific activation of HER4/p180erbB4, a fourth member of the epidermal growth factor receptor family. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1746-1750. 105.Sworczak K, Żaczek A, Babińska A et al. Gene copy numbers of erbb oncogenes in human pheochromocytoma. Oncol Rep 2002; 9: 1373-1378. 624