Wrocław, 4.12.15 Bioreaktor membranowy Biodegradacja serwatki 1. Wstęp Reaktor membranowy jest rodzajem reaktora działającego w trybie ciągłym, który ma na celu immobilizację objętościową katalizatora. W bioreaktorze membranowym za sprawą filtra membranowego miejsce ma zatrzymanie komórek, a więc ich recyrkulacja. W procesach okresowych komórki rozmnażają się do momentu wystąpienia: 1) Krytycznego stężenia czynnika ograniczającego; zwykle zużycia C lub rozpuszczonego O 2 2) Krytycznego stężenia hamującego wzrost (np. stężenia etanolu w fermentacji alkoholowej lub kwasu mlekowego w fermentacji mlekowej) Komórki są głównym źródłem przemian biochemicznych, dlatego szybkość procesu fermentacji uzależniona jest od koncentracji komórek (maks. 50 80 g. s.m./l). Ograniczenie koncentracji biomasy w bioreaktorze zmniejsza szybkość fermentacji. Stan ten spowodował podjęcie próby przełamania tych barier przez wprowadzenie tzw. kultur o wysokiej koncentracji komórek oraz unieruchomienie komórek na różnego rodzaju nośnikach. Osiągnięcie bardzo wysokich stężeń komórek (wielokrotnie przewyższających ich naturalne stężenie) pozawala na znaczne przyspieszenie procesów fermentacyjnych i zmniejszenie pojemności bioreaktorów, częściowe oczyszczenie metabolitów na membranie lub z innej strony pozyskiwanie z nich produktów. Bioreaktory połączone z zewnętrznym filtrem membranowym nazywane są bioreaktorami membranowymi. Separacja membranowa ma wiele zalet: niskie koszty inwestycyjne i eksploatacyjne, wysoką selektywność rozdziału, łagodne oddziaływanie mechaniczne na komórki, neutralność chemiczna względem pożywek i możliwość pracy ciągłej.
Filtr membranowy o przepływie stycznym do przegrody filtracyjnej zatrzymuje cząstki zawiesiny o rozmiarach 0.02 do 10 μ, a więc o wielkości typowych komórek. Przepływ z dużą prędkością styczną do powierzchni membrany zapobiega zjawisku jej polaryzacji i osadzaniu się na jej powierzchni komórek. Najczęściej stosowane membrany zbudowane są z octanu celulozy, polimerów syntetycznych (polisulfonu, polipropylenu) oraz ceramiczne. Te ostatnie wykazują największą wytrzymałość mechaniczną oraz możliwość wielokrotnej sterylizacji. W procesach biotechnologicznych związek między koncentracją biomasy komórkowej i ilością produkowanych przez nią metabolitów może przedstawić się następująco: 1) Metabolity tworzone są w czasie wzrostu biomasy a i ich ilość jest proporcjonalna do stężenia biomasy (matabolity I rzędowe) 2) Metabolity tworzone są równolegle ze wzrostem komórek oraz po zatrzymaniu ich wzrostu w fazie stacjonarnej (metabolizm mieszany) 3) Metabolity tworzone są tylko w fazie stacjonarnej (metabolity II rzędowe). W przemysłach fermentacyjnych metabolity są zwykle wytwarzane równolegle ze wzrostem komórek, przy czym ich wytwarzanie jest wytwarzane przez komórki w fazie stacjonarnej. Ważnym czynnikiem jest czas trwania hodowli i wynikające stąd konsekwencje, objawiające się śmiercią komórek zamkniętych w pętli fermentacyjnej. W rzeczywistości w pożywce mamy mieszaną populację komórek żywych i martwych, co zmniejsza efektywność bioreaktora, utrudniając jednocześnie ciągłą separację komórek. Stan ten wymusza stosowanie częściowego odbioru biomasy komórkowej (ang. bleeding), aby stworzyć miejsce dla nowych komórek. Odbioru dokonuje się pomiędzy bioreaktorem a modułem membranowych. Wielkość strumienia odbioru wynosi zwykle około 2 10% w stosunku do objętości świeżej pożywki wprowadzonej do bioreaktora. Problem związanym ze szybkim przepływem komórek przez układ aparaturowy są mechaniczne oddziaływania, mogące uszkodzić ściany komórkowe mikroorganizmów i w konsekwencji spowodować ich lizę i uwalnianie substancji wewnątrzkomórkowych. Mechaniczne oddziaływania, nazywane siłami ścinającymi, występują tam, gdzie stosuje się intensywne mieszanie lub przetłaczanie cieczy w rurach i innych elementach aparatury. Głównym źródłem takich uszkodzeń są mieszadła mechaniczne (łopatkowe), szczeliny
zaworów, elementy pomp, a także wysokie wartości sił ścinających na membranie. Mamy więc do czynienia z konfliktem interesów, gdyż dążenie do dużych wartości strumienia wzdłuż membrany skutkuje ograniczeniem negatywnego zjawiska osadzania się komórek na membranie i jednocześnie powoduje ich niszczenie. Ulokowanie membrany na wylocie z bioreaktora ma głownie na celu zatrzymanie aktywnej biomasy. Do tego celu stosuje się membrany mikrofiltracyjne. Jeśli natomiast, mamy na celu zatrzymanie jeszcze nieprzereagowanego substratu musimy zastosować membranę o mniejszej porowatości, np. ultra- lub nanofiltracyjną. By jednak ograniczyć fouling separacja powinna być dwustopniowa: 1) Separacja mikroorganizmów mikrofiltracja 2) Separacja permeatu uzyskanego z mikrofiltracji w celu odzyskania substratu nanofiltracja Prowadzenia hodowli w reaktorach membranowych może mieć na celu: 1) Obniżenie zawartości pewnych składników (biodegradacja), a więc interesuje nas stężenie strumienia wylotowego z reaktora (permeatu) względem wlotowego generalnie powinno być niższe 2) Produkcja pewnych składników przez mikroorganizmy, a więc interesuje nas obecność i stężenie produktu w permeacie. Reaktor membranowy jest rodzajem reaktora pracującego w systemie ciągłym, a więc w celu jego opracowania należy wcześniej rozpoznać proces podstawowy jakim jest reaktor ciągły. Wydajność takiego procesu jest zazwyczaj wyższa niż hodowli okresowej, a nawet może być korzystny proces półciągły, w którym unika się wysokich częstotliwości mutacji mikrobiologicznych. W procesach półciągłych można również uniknąć trudności związanych z utrzymaniem jałowości procesu. Istota hodowli ciągłej polega na tym, że po wstępnym okresie namnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli strumieniem świeżego podłoża, połączone z ciągłym odbiorem, przy zachowaniu stałej objętości. Postępowanie takie umożliwia przedłużenie na stosunkowo długi czas logarytmicznej fazy rozwoju drobnoustrojów. Bioreaktory przeznaczone do hodowli drobnoustrojów metodą ciągłą pracują na zasadzie turbidostatu utrzymywania stałego zmętnienia pożywki lub gęstości optycznej bakterii, albo chemostatu, tj. utrzymywania stałego stężenia określonego
substratu na stałym poziomie. W hodowli ciągłej ustala się równowaga pomiędzy szybkością zużywania substratu S na syntezę biomasy X a szybkością jej dostarczania: dx Y dt ds dt gdzie: Y współczynnik wydajności ze zużytego substratu Najprostszy model kinetyki zaproponował Monod: max K M C S C S gdzie: μ max maksymalna właściwa szybkość wzrostu w warunkach nielimitowanych, K S stała Monoda, C S stężenie substratu limitującego w równowadze. W przypadku reaktora działającego w trybie ciągłym operuje się pojęciem czasu przebywania czyli: V V gdzie: V objętość reaktora, V - strumień pożywki (=strumień płynu pohodowlanego) Reaktor membranowy jest modyfikacją reaktora ciągłego i polega ona na umieszczeniu membrany na strumieniu wylotowym, by zwiększyć stężenie komórek i tym samym wydajność procesu. 2. Wykonanie eksperymentu Hodowla ciągła Przeprowadzenie biodegradacji serwatki w bioreaktorze membranowym jest skomplikowanym i wieloetapowym procesem. W pierwszej kolejności należy opracować kinetykę dobranego szczepu biodegradującego. W tym celu należy prowadzić hodowle w reaktorze działającym w trybie ciągłym (stały odbiór płynu pohodowlanego przy jednoczesnym dozowaniu pożywki, jaką jest roztwór
laktozy) dla różnych stężeń równowagowych laktozy w podłożu (nie dozowaniu!), ponieważ w stanie ustalonym i dla odpowiednio dobranego czasu przebywania, stężenie laktozy w strumieniu wylotowym powinno być stałe. Z racji braku możliwości przeprowadzenia hodowli dla różnych stężeń (różnych wartości τ), podczas laboratorium ograniczymy się do jednego czasu wynoszącego 8h i określimy czy jest wystarczający by zredukować zawartość laktozy w ścieku. Do tego celu należy podłączyć do reaktora (Rys.1) zbiornik (Z1) z rozcieńczoną (wysterylizowaną wodą) serwatką (stężenie zostanie podane w czasie zajęć) i ustawić obroty pompy P1, tak by strumień był odpowiedni dla czasu przebywania wynoszącego 8h (objętość reaktora 1L). W reaktorze znajduje się hodowla szczepu Bacillus licheniformis na podłożu serwatkowym. Odbiór nadmiaru płynu pohodowlanego ma miejsce po osiągnięciu wysokości h1, który jest wysokością przelewu. Rys. 1. Schemat reaktora ciągłego Każda z grup monitoruje stężenie laktozy (DNS), białka (Lowry) oraz biomasy w strumieniu wylotowym z reaktora. Stężenia laktozy oraz białka obliczamy z krzywych standardowych zamieszczonych w instrukcji na temat ultrafiltracji, natomiast stężenie biomasy należy obliczyć na podstawie krzywej standardowej, wykonanej na podstawie oznaczenia zawartości suchej masy: C biomasy [g L -1 ]=0.389 A 550nm Przyjmując, że stan ustalony następuje po 3 wymianach objętości reaktora, grupa realizująca zadanie laboratoryjne w piątek uzyska taki stan. Wszystkie spośród grup powinny wymienić się wynikami, ponieważ każda posiada inne dane:
1) Grupa czwartkowa 8 15 czas procesu od 0 do 4h w trakcie pierwszej wymiany objętości 2) Grupa czwartkowa 13 15 czas procesu od 5 od 9h koniec pierwszej i początek drugiej wymiany objętości uczestnicy pod koniec zajęć muszą podłączyć do reaktora zbiornik pożywki, który musi zasilać reaktor przez noc 3) Grupa piątkowa 8 15 czas procesu 25 29 początek czwartej wymiany objętości stan ustalony Hodowle okresowe W celu porównania szybkości biodegradowania serwatki z innym szczepem bakteryjnym i rozpoznaniu procesu w fazie startowej należy przeprowadzić monitoring stężenia biomasy, laktozy i białka w kolbach Elrenmayera, w których znajduje się podłoże serwatkowe o stężeniu laktozy podanym przez prowadzącego. Kolby zostaną zaszczepione wspomnianym Bacillus licheniformis oraz dla porównania szczepem z rodzaju Pseudomonas fluorescens. W odstępach 0.5h należy mierzyć wspomniane parametry w kolbach. Reaktor membranowy (realizowany w kolejnym tygodniu zajęciowym 7-8.01.16) Kolejnym etapem biodegradacji serwatki jest prowadzenie go w reaktorze membranowym. Za reaktorem działającym w sposób ciągły umieszcza się membranę mikrofiltracyjną (o średnicy porów 0.14μm), która w sposób ciągły zatrzymuje populację komórkową w reaktorze. Retentat z biomasą zawracany jest do bioreaktora, natomiast permeat, to płyn o zredukowanej zawartości szkodliwej dla środowiska laktozy. Podłączenie membrany do reaktora ma miejsce, gdy reaktor (ciągły) pracuje w stanie ustalonym. Warunki ulegną zmianie i ponownie należy poczekać, aż stan procesu się ustabilizuje, w związku z tym monitorujemy zawartość laktozy i białka w permeacie, mierząc te stężenia co 0.5h. Strumień dozowanej serwatki musi być identyczny, jak odbieranego permeatu. Jego wartość musi zostać ustawiona przy pomocy pompy nr (I).
Rys. 1. Schemat reaktora membranowego W czasie eksperymentu nie odbieramy nadmiaru biomasy, więc mierzymy jej stężenie w bioreaktorze, pobierając próbkę zawartości reaktora przez specjalnie przygotowaną do tego rurkę, zapewniającą sterylność układu. Szczep B.liecheniformis jest szczep zaliczanym do grupy LAB (lactic acid bacteria), a więc posiada zdolność produkowania kwasu mlekowego z obecnej w serwatce laktozy. Zastosowania systemu membranowego, ma więc podwójne znaczenie zatrzymanie bakterii w strefie reakcji i biodegradację szkodliwej dla środowiska laktozy oraz oddzielenie od płynu pohodowlanego produktu jakim jest kwas mlekowy, jeśli ten aspekt biotechnologiczny byłby w zakresie naszych zainteresowań. Należy więc, sprawdzić, czy faktycznie dobrany szczep produkuje kwas mlekowy i czy jest on obecny w permeacie. W tym celu należy wykonać test Uffelman a: Odmierzamy w probówce 2 ml 2-procentowego roztworu fenolu Do powyższej probówki dodajemy 1M roztworu FeCl 3 aż do momentu uzyskania ciemno-fioletowego koloru. Do tak przygotowanego roztworu kroplami dodajemy płyn pohodowlany uzyskiwany po inkubacji szczepu B.lichenifromis na podłożu serwatkowym W obecności kwasu mlekowego odczynnik zmienia barwę na żółtą
3. Wykonanie sprawozdania a) Obliczyć szybkość biodegradowania (dc/dt) dla każdego ze szczepów w fazie logarytmicznego wzrostu bakterii B.lichenifomis oraz P.fluorescense w hodowlach okresowych porównać uzyskane wyniki b) Obliczyć właściwą szybkość wzrostu biomasy dla danej hodowli okresowej dla obu szczepów c) Wykreślić zależność stężenia laktozy, białka oraz biomasy w zależności od czasu dla hodowli okresowych d) Obliczyć współczynnik wydajności biomasy dla obu szczepów (hodowle okresowe) e) Wykreślić zależność stężenia laktozy, białka oraz biomasy w zależności od czasu dla reaktora ciągłego dążącego do stanu ustalonego f) Obliczyć szybkość biodegradowania laktozy i wzrostu biomasy dla czasu przebywania wynoszącego 8h dla szczepu B.licheniformis g) Obliczyć współczynnik wydajności biomasy dla hodowli ciągłej i porównać jego wartość z uzyskaną z wyników dla hodowli okresowej (dla B.licheniformis) h) Wykreślić zależność stężenia laktozy, białka w strumieniu wylotowym w reaktorze membranowym w zależności od czasu i) Wykreślić zależność stężenia biomasy w reaktorze membranowym od czasu j) Określić, czy w płynie pohodowlanym znajduje się kwas mlekowy Opracowała: Dr inż. Magdalena Lech