Klonowanie i transgeneza dr n.med. Katarzyna Wicher
Klonowanie proces tworzenia idealnej kopii z oryginału oznacza powstawanie lub otrzymywanie genetycznie identycznych: cząsteczek DNA komórek organizmów
Klonowanie DNA Wektory do klonowania Krótkie cząsteczki DNA, które mają zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek, zapewniają powielenie wprowadzonego fragmentu DNA, a w wielu przypadkach także wydajną ekspresję zawartych w nim genów.
Podstawowe właściwości wektorów: niewielka cząsteczka DNA wydajna replikacja w genomie gospodarza (np. miejsce Ori) możliwe do izolacji niezależnie od genomu gospodarza zawierają miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne: polilinker (MCS - multiple cloning site miejsce wielokrotnego klonowania) zawierają markery pozwalające na identyfikację zrekombinowanych cząsteczek
Markery wektorowe: geny oporności na antybiotyki histochemiczne nadające komórce rozróżnialną barwę pokarmowe umożliwiające transformowanej komórce wzrost bez niezbędnego składnika odżywczego
Rodzaje wektorów plazmidy bakteryjne pochodne faga Pochodne faga M13 Kosmidy PAC BAC YAC 15kpz 25kpz 25kpz 45kpz 150kpz 500kpz 1000kpz
Etapy klonowania molekularnego 1. Przygotowanie sekwencji do klonowania (wstawki): - trawienie enzymem restrykcyjnym lub losowe rozerwanie DNA poprzez sonikację - oczyszczenie i przygotowanie produktów PCR
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) przecinają cząsteczkę w obrębie specyficznych sekwencji, zwykle 4-8 pz, najczęściej rozpoznają sekwencje palindromowe (symetryczne) identyczne na obu niciach w kierunku 5-3, SmaI 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' trzy typy: I, II, II; tylko typ II przecina cząsteczkę zawsze w tym samym miejscu.
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) Sposoby cięcia: -tępe końce -lepkie końce Nazwy enzymów: 1 litera-rodzaj bakterii 2,3 litera- gatunek bakterii Dodatkowe litery, cyfryserotyp, lub szczep bakteryjny
Etapy klonowania DNA c.d. 2. Przygotowanie wektora do klonowania przeprowadzenie wektora z formy kolistej (plazmid) w formę liniową trawienie enzymem restrykcyjnym 3. Ligacja - łączenie fragmentów DNA (wstawki) z wektorem poprzez zastosowanie ligazy DNA, katalizującej formowanie wiązań fosfodiestrowych między końcem hydroksylowym 3, a końcem fosforanowym 5 DNA. Najczęściej stosowana ligazą jest ligaza T4.
4. Wprowadzenie zrekombinowanej cząsteczki do gospodarza: - bakterie transformacja - rośliny transfekcja (chemiczna, bakteryjna) - zwierzęta i człowiek transdukcja wirusowa
5. Namnożenie zrekombinowanych cząsteczek w komórce biorcy 6. Identyfikacja zrekombinowanych genów: - wykorzystanie markerów selekcyjnych (np.bgalaktozydaza X-Gal) - hybrydyzacja z sondą w przypadku braku ekspresji genu 7. Analiza sklonowanych sekwencji lub dalsza manipulacja
Zastosowanie klonowania DNA: tworzenie bibliotek genomowych i genowych (ginące gatunki!) izolowanie genów i innych sekwencji DNA w celu dalszej analizy uzyskanych fragmentów (hybrydyzacji z sondą molekularną, sekwencjonowanie) tworzenie zmodyfikowanych wersji genów do ponownego wprowadzania do organizmu w celu badania ekspresji genu i jej regulacji, przenoszenie genów do innego organizmu, w celu otrzymania dużej ilości białka kodowanego przez ten gen.
TRANSGENEZA transgen - egzogenny gen wprowadzony do komórki Terapia genowa (genoterapia) Sposób leczenia wrodzonych błędów genetycznych przez wprowadzenie z zewnątrz prawidłowego genu do komórek chorego w taki sposób, aby gen ten przejął funkcje nieprawidłowego (zmutowanego lub brakującego) genu.
Warunki, które muszą być spełnione aby rozważać terapię genową: gen musi być sklonowany, zsekwencjonowany, a jego prawidłowa forma powinna być łatwo dostępna musi istnieć możliwość wprowadzenia genu bezpiecznie i efektywnie do odpowiednich komórek docelowych musi dojść do ekspresji genu w miejscu przeznaczenia
Typy terapii genowej: terapia genowa komórek linii zarodkowej (linii płciowej albo generatywnej) terapia germinalna modyfikacje dotyczą gamet, zygoty i wczesnych embrionów trwały, dziedziczony efekt trudno przewidzieć wszystkie konsekwencje zabroniona w większości krajów terapia genowa komórek somatycznych terapia somatyczna
Strategie terapii genowej metoda ex vivo terapeutyczny gen wprowadzany jest do komórek pobranych wcześniej od chorego i hodowanych poza organizmem (in vitro). Po udanej transfekcji komórki zostają z powrotem wszczepione do organizmu chorego. metoda in vivo terapeutyczny gen wprowadza się bezpośrednio do organizmu chorego za pośrednictwem odpowiedniego wektora. Do transfekcji dochodzi w komórkach wewnątrz organizmu.
Metody wprowadzania genów do komórek bezpośredni transfer DNA do komórki przy użyciu metod fizykochemicznych -fuzja DNA z liposomami -transfekcja precypitatu DNA z fosforanem wapnia -elektroporacja -mikroiniekcja dojądrowa wprowadzanie DNA lub RNA do komórek przy użyciu metod biologicznych - za pomocą specjalnie skonstruowanych nośników tzw. wektorów (wirusy DNA, wirusy RNA, plazmidy)
Retrowirusy Wirusy RNA Najczęściej stosowane w terapii genowej! dzięki odwrotnej transkryptazie mogą przepisywać swój genom z RNA na cdna i trwale integrować się z genomem mogą infekować tylko dzielące się komórki (ograniczenie ukierunkowania) ryzyko mutacji insercyjnej bardzo wydajne jako wektory (~100%) Lentiwirusy wyspecjalizowane retrowirusy infekują niedzielące się komórki (aktywny transport przez pory otoczki jądrowej) integracja z genomem przypadkowa długotrwała ekspresja
Adenowirusy infekują zarówno komórki dzielące się, jak i niedzielące się dwuniciowe DNA wirusa nie integruje z genomem gospodarza (powstaje nietrwały episom) bezpieczny Wirusy DNA krótkotrwała ekspresja
Czynniki ryzyka związane ze stowaniem wektorów wirusowych: mutageneza insercyjna możliwość wywołania mutacji w DNA gospodarza powikłania infekcyjne rekombinacja DNA unieczynnionego wektora wirusowego z DNA wirusa dzikiego pobudzona odpowiedź immunologiczna i zapalna
Ashanti De Silva, 4- letnia dziewczynka z ciężkim złożonym niedoborem odporności SCID (ang. severe combined immunodeficiency) była pierwszą pacjentką poddaną terapii genowej (1990). Wprowadzenie genu deaminazy adenozyny do limfocytów T pacjentki.
Negatywne skutki terapii genowej 1999 Jesse Gelsinger pierwsza udokumentowana ofiara - zmarł po zastosowaniu terapii genowej, która miała wyleczyć go z dziedzicznej choroby wątroby - przyczyną śmierci była agresywna odpowiedź układu immunologicznego 2002-11 pacjentów z X-SCID poddano terapii genowej, aby umożliwić im powrót do normalnego życia - 2 pacjentów zmarło z powodu białaczki nastąpiła insercja wirusa w locus onkogenu LMO2
Rodzaje terapii genowej: wprowadzenie prawidłowej kopii genu komplementacja defektu genetycznego wymiana nieprawidłowego genu - somatyczna rekombinacja homologiczna wprowadzanie genów samobójczych - molekularna chemoterapia nowotworów, apoptoza komórek wybiórcze hamowanie ekspresji - eliminowanie funkcji nieprawidłowych genów poprzez wyciszanie lub usuwanie nadmiernie aktywnych, nieprawidłowo działających genów (hamowanie transkrypcji lub unieczynnianie RNA)
Rodzaje terapii genowej aktywacja odpowiedzi immunologicznej przez transfekcję komórek odpornościowych organizmu, takich jak limfocyty lub makrofagi wybiórcze niszczenie komórek - dostarczanie zakażonej komórce białek wiążących i unieczynniających białka wirusa konieczne do jego namnażania (np. AIDS)
System CRISPR-CAS9 nożyce molekularne przełomowa metoda manipulacji DNA
Klonowanie terapeutyczne Klonowanie terapeutyczne przewiduje hodowanie komórek, tkanek, a nawet całych organów w celu ich zastosowania u ludzi
Komórki macierzyste Komórki mające zdolność regeneracji, a w określonych warunkach różnicujące się w inne populacje komórek totipotencjalne zygota pluripotencjalne - różnicują się w komórki listków zarodkowych multipotencjalne - różnicują się w komórki jednego listka zarodkowego unipotencjalne - mogą wytworzyć tylko jeden typ komórek
Komórki macierzyste Ze względu na pochodzenie wyróżnia się komórki macierzyste: embrionalne, płodowe i dorosłe. ES embryonic stem cells embrionalne komórki macierzyste można wyizolować z blastocysty (wczesne stadium rozwojowe, około etapu zagnieżdżania się zapłodnionego jaja) i hodować in vitro
TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH -wiele utrudnień -nie udało się pozyskać komórek macierzystych -potrzeba wielu komórek jajowych -ASPEKTY ETYCZNE: wykorzystanie ludzkich zarodków?
TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH 1. Komórki jajowe skłania się, żeby dojrzewały w warunkach laboratoryjnych. Każda ma ciałko kierunkowe, a do ich powierzchni przylegają komórki pęcherzykowe.
2. Komórkę jajowa przytrzymuje się pipetą, a igłą przekłuwa osłonkę przejrzystą, usuwając czopek.
3. Po wyrzuceniu czopka igłę ponownie wprowadza się do komórki jajowej przez zrobiony wcześniej otwór, by usunąć z niej ciałko kierunkowe i materiał genetyczny.
4. Do igły pobiera się materiał genetyczny pochodzący z komórki somatycznej. Jądro komórki somatycznej
5. Jądro komórki somatycznej wstrzykuje się głęboko do komórki jajowej pozbawionej własnego materiału genetycznego. Istnieją także metody nieinwazyjne owca Dolly.
6. Po wstrzyknięciu, działa się na komórkę różnymi związkami chemicznymi, m.in. czynnikami wzrostowymi, które pobudzają ja do podziałów.
7. Po około 24 godzinach komórka zaczyna się dzielić. Komórki potomne zawierają materiał genetyczny pochodzący tylko ze wstrzykniętej uprzednio komórki somatycznej.
8. Czwartego lub piątego dnia powstaje blastocysta - pusta kula złożona z około 100 komórek. Zawiera ich skupienie zwane wewnętrzną masą komórkową, w której znajdują się komórki macierzyste.
9. Rozrywa się blastocystę, a wewnętrzna masę komórek hoduje w warunkach laboratoryjnych, aby uzyskać komórki macierzyste (ang. stem cells)
10. Komórki macierzyste skłania się do różnicowania w rozmaite komórki, które kiedyś można będzie wstrzyknąć pacjentom.
TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH -wiele utrudnień -nie udało się pozyskać komórek macierzystych -potrzeba wielu komórek jajowych -ASPEKTY ETYCZNE: wykorzystanie ludzkich zarodków?
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (IPS)
Dziękuję za uwagę!