OPRACOWANIE WYNIKÓW POMIARÓW ANALITYCZNYCH sem.vii Dr hab. inż. Piotr Konieczka e-mail: piotr.konieczka@pg.gda.pl 2
3 4
5 6
7 8
9 10
Wprowadzenie Postępowanie analityczne - PROCEDURA ANALITYCZNA ETAPY PROCEDURY ANALITYCZNEJ: - pobieranie próbki, - przygotowanie próbki, - kalibracja, -oznaczenie końcowe, -... 11?!? sygnał 600 y = 110x + 1,2 500 400 300 200 100 0 0 2 4 6 stężenie 12
Jakość analityczna zgodność charakterystyki uzyskanej w wyniku analizy chemicznej z przyjętymi założeniami. Na jakość informacji składają się cztery składniki: jakość wyników, jakość procesu, jakość stosowanych przyrządów oraz jakość pracy i jej organizacji. 13 Jakość wyniku ogół cech charakterystycznych produktu lub usługi, warunkujący fakt, że spełnione są określone i oczekiwane wymagania. 14
Analityk odpowiada za każdy wynik który otrzymuje. Zawsze i niezależnie od warunków zewnętrznych. 15 System kontroli jakości Problem kontroli, oceny i zapewnienia jakości pomiarów analitycznych wiąże się ściśle ze stosowaniem odpowiednich narzędzi w trakcie postępowania analitycznego, do których należą: zapewnienie spójności pomiarowej uzyskiwanych wyników, oszacowanie wartości niepewności otrzymywanych wyników pomiarów, wykorzystywanie materiałów odniesienia, uczestniczenie w różnego rodzaju porównaniach międzylaboratoryjnych, walidacja stosowanych procedur analitycznych, Tylko stosowanie wszystkich z powyższych narzędzi pozwala na uzyskiwanie miarodajnych wyników pomiarów analitycznych. 16
System kontroli i zapewnienia jakości wyniku pomiaru analitycznego MIARODAJNY WYNIK ANALITYCZNY NIEPEWNOŚĆ SPÓJNOŚĆ WYMAGANIA WALIDACJA PROCEDURY ANALITYCZNEJ MATERIAŁY ODNIESIENIA BADANIA MIĘDZYLABO- RATORYJNE NARZĘDZIA 17 SPÓJNOŚĆ NIEPEWNOŚĆ WALIDACJA SYSTEM QA/QC MATERIAŁY ODNIESIENIA BADANIA MIĘDZY- LABORATORYJNE 18
Miarodajny wynik analityczny NIEPEWNOŚĆ X ± U SI SPÓJNOŚĆ 19 Spójność pomiarowa (ang. traceability) własność wyniku pomiaru na podstawie, której jego wartość może być odniesiona do odpowiedniego wzorca, np.: międzynarodowego czy narodowego standardu. Określana jest także jako zdolność do śledzenia historii, zastosowań lub lokalizacji jednostki dzięki wcześniejszemu zapisywaniu wyników oznaczeń. 20
Spójność pomiarowa Wyniki pomiarów analitycznych powinny być porównywalne - niezależnie od miejsca i czasu ich uzyskania. Spójność pomiarowa to najlepszy ze sposobów do spełnienia powyższego wymogu. 21 Spójność pomiarowa Jednostka SI ilość substancji wartość Wzorzec odniesienia wartość Wzorzec roboczy wartość Zawartość substancji X w próbce badanego roztworu Na podstawie Quality Assurance in Analytical Chemistry, Springer, 2003 22
Spójność pomiarowa SI 23 Spójność pomiarowa pomiar w laboratorium wzorzec n-go rzędu wzorzec 2-go rzędu wzorzec 1-go rzędu kopia wzorca narodowego wzorzec narodowy oficjalna kopia pomiar w laboratorium wzorzec n-go rzędu wzorzec 2-go rzędu wzorzec 1-go rzędu kopia wzorca narodowego wzorzec narodowy oficjalna kopia SI 24
Spójność pomiarowa Zapewnienie i wykazanie spójności pomiarowej wyniku wymaga przeprowadzenia każdorazowo porównania wartości mierzonej ze znaną wartością dla odpowiedniego wzorca. Stosowane wzorce robocze muszą być spójne z wzorcami wyższego rzędu. Wykorzystywanie tego typu wzorców, o najwyższej jakości metrologicznej, jest uznawane za najlepszą możliwość zapewnienia spójności pomiarowej biorąc pod uwagę określony problem analityczny. 25 Spójność pomiarowa Elementy zapewnienia spójności pomiarów chemicznych Element spójności Stwierdzenie Wyznaczenie Wykazanie Wykonanie to jest deklaracja to co należy zrobić oraz udokumentować 26
Spójność Trochę o 27 Barwa 28
Barwa Basic Color Hue Lovibond Units Yellow light 2.0-3.0 medium 3.0-4.5 deepstraw/gold 4.5-6.0 deep gold 6.0-7.5 Amber light 7.5-9.0 copper 9.0-11 red/brown 11-14 Brown light 14-17 medium 17-20 dark - light black 20-25 Black start of full black >25 29 Pianka 30
Smak, zapach 31 Smak, zapach 32
Smak, zapach Koło smaków to międzynarodowy, naukowy opis smaków piwa (w kształcie koła). W kole smaków znajdują się 122 smaki i zapachy, które w różnych piwach tworzą różne profile zapachowe. Zgodnie z nomenklaturą koła, piwo opisywane jest przez większość piwowarów na świecie. To pozwala im mówić o smaku w sposób spójny, używając tych samych określeń na poszczególne rodzaje zapachu. 33 Temperatura 34
Opakowanie 35 Goryczka Zawartość ekstraktu Zawartość alkoholu Nasycenie CO 2 Klarowność.. 36
37 38
39 40
BARDZO DOBRE DOBRE 41 42
43 BARDZO DOBRE DOBRE 44
45 W Polsce obowiązuje 100 punktowy system oceny piwa, opracowany przez Instytut Przemysłu Fermentacyjnego. Przy ocenie piwa bierze się pod uwagę jego: pienistość (2-10 pkt), klarowność (2-10 pkt), nasycenie CO 2 (2-10 pkt), kolor (1-5 pkt), goryczkę (5-25 pkt) oraz smak i zapach (8-40 pkt) 46
Wszystkie punkty sumuje się i dzieli przez liczbę degustatorów, uzyskując uśredniony wynik. Aby piwo zasłużyło na ocenę bardzo dobrą, powinno uzyskać, co najmniej 90 pkt Piwa, które otrzymają 81-89 pkt, uważane są za dobre, 70-79 pkt - za dostateczne. O piwach ocenianych na mniej niż 70 pkt nie warto wspominać. 47 Pienistość Piwo jasne przelane z butelki do kufla powinno tworzyć białą pianę utrzymującą się w piwach specjalnych i markowych przez co najmniej 4 minuty Ocena: 1-5 punktów współczynnik 2 48
Klarowność Klarowne, bez zawiesin i osadu Ocena: 1-5 punktów współczynnik 2 49 Nasycenie CO 2 Piwo przelane z butelki do szklanki powinno się wydzielać równomiernie drobne pęcherzyki gazu. Ośrodki wydzielania gazu zlokalizowane w jednym punkcie, kwalifikują nasycenie jako nierównomierne, a raptowne pojawianie się wielkich pęcherzyków świadczy o nieprawidłowym dobijaniu piwa gazem Ocena: 1-5 punktów współczynnik 2 50
Barwa Pożądany jest kolor złocisty, z tzw. połyskiem. Generalnie, w grupie piw jasnych pełnych, preferowany jest odcień jaśniejszy Ocena: 1-5 punktów 51 Goryczka Łagodna, przyjemna, zharmonizowana Ocena: 1-5 punktów współczynnik 5 52
Smak i zapach Smak swoisty, lekko gorzki, zharmonizowany, zapach swoisty, lekko chmielowy Ocena: 1-5 punktów współczynnik 8 53 Spójność pomiarowa Hierarchia wzorców jednostek miar Status wzorca Wzorzec międzynarodowy Wzorzec państwowy Wzorzec odniesienia Wzorce robocze Przyrządy pomiarowe BIPM Instytucja realizująca jednostkę Krajowy Instytut Metrologiczny (GUM) Akredytowane laboratorium wzorcujące Wzorcowania i sprawdzania w laboratorium badawczym Użytkownicy w laboratorium badawczym 54
Spójność pomiarowa Zapewnienie spójności pomiarowej, a co za tym idzie zapewnienie miarodajności wyników pomiarów jest tym elementem chemii analitycznej, na który obecnie kładzie się szczególnie duży nacisk. Pojęcie spójność pomiarowa i nierozerwalnie z nią związane pojęcie niepewność mają kluczowe znaczenie dla współczesnej metrologii w dziedzinie chemii analitycznej. 55 Niepewność pomiaru (uncertainty) parametr związany z wynikiem pomiaru, który określa przedział wokół wartości średniej, w którym może (na założonym poziomie istotności) znaleźć się wartość oczekiwana 56
Niepewność pomiaru 57 Niepewność pomiaru 58
Niepewność pomiaru 59 Niepewność pomiaru błąd x x śr n i e p e w n o ś ć 60
Walidacja Walidacja metody (ang. method validation) proces oceny metody (lub procedury) analitycznej prowadzony w celu zapewnienia zgodności ze stawianymi tej metodzie wymogami, definiujący tę metodę oraz pozwalający określić jej przydatność. Można więc mówić o: Ocenie metody Zgodności metody ze stawianymi jej wymogami Definicji metody Przydatności metody 61 Walidacja Proces walidacji powinien być przeprowadzony gdy: opracowywana jest nowa procedura analityczna, prowadzone są próby rozszerzenia zakresu stosowalności znanej procedury analitycznej np. do oznaczania danego analitu ale w innej matrycy, przeprowadzona kontrola jakości daje podstawę do wniosku, że występuje zmienność parametrów walidacyjnych w czasie, 62
Walidacja Proces walidacji powinien być przeprowadzony gdy: dana procedura analityczna ma być wykorzystywana w innym laboratorium, zostanie wykorzystana inna aparatura kontrolno-pomiarowa, badania będą przeprowadzone przez innego analityka, przeprowadza się porównanie nowej procedury analitycznej ze znaną procedurą standardową, 63 Walidacja Oprócz wyznaczenia parametrów walidacyjnych, przed przystąpieniem do samego procesu walidacji należy określić takie podstawowe cechy procedury analitycznej jak: rodzaj oznaczanego składnika, poziom stężeń, zakres stężeń analitu, rodzaj matrycy, obecność substancji przeszkadzających (interferentów) wraz z określeniem konieczności ich oznaczenia, 64
Walidacja Oprócz wyznaczenia parametrów walidacyjnych, przed przystąpieniem do samego procesu walidacji należy określić takie podstawowe cechy procedury analitycznej jak: istnienie odgórnych regulacji i wymogów, którym powinna sprostać procedura analityczna, rodzaj oczekiwanej informacji ilościowa czy jakościowa, wymagana wartość granicy wykrywalności i oznaczalności, oczekiwana i wymagana dokładność (precyzja i poprawność) procedury, 65 Walidacja Oprócz wyznaczenia parametrów walidacyjnych, przed przystąpieniem do samego procesu walidacji należy określić takie podstawowe cechy procedury analitycznej jak: wymagana wrażliwość (odporność) procedury, wymagana aparatura czy oznaczenia z wykorzystaniem danej procedury mają być przeprowadzone w oparciu a ściśle zdefiniowany instrument, czy też może być przeprowadzana w oparciu o aparaturę tego samego typu, możliwość zastosowania walidowanej procedury w innym laboratorium, 66
Walidacja Zestawienie parametrów procedury analitycznej podlegających procesowi walidacji zalecanych przez ICH i USP Parametr ICH USP - powtarzalność + + Precyzja - precyzja pośrednia + - odtwarzalność + Dokładność/Poprawność + + Granica wykrywalności + + Granica oznaczalności + + Specyficzność/selektywność + + Liniowość + + Zakres pomiarowy + + Odporność (ang.robustness) + Elastyczność/tolerancyjność (ang.ruggedness) + ICH The International Conference on Harmonization USP The United States Pharmacopoeia 67 Walidacja Im większa jest liczba parametrów walidacyjnych, tym więcej czasu potrzeba na przeprowadzenie procesu walidacji. Im bardziej restrykcyjny charakter mają przyjęte wartości graniczne (oczekiwane), tym częściej należy sprawdzać, kalibrować, czy wręcz rewalidować daną procedurę analityczną. Nie zawsze istnieje konieczność walidacji procedury analitycznej. przeprowadzania całego procesu Należy wówczas określić, który z parametrów powinien być włączony do procesu walidacji. 68
Walidacja Proces walidacji procedury analitycznej może być przeprowadzony właściwie w dowolnej kolejności (biorąc pod uwagę kolejność określania badanych parametrów), jednak najbardziej logicznym wydaje się jej przeprowadzenie zgodnie ze schematem: określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY 69 Walidacja W procesie walidacji można wykorzystać następujące narzędzia : ślepe próbki (w tym także tzw. ślepe odczynnikowe), roztwory wzorcowe (roztwory kalibracyjne, próbki testowe), próbki ze znaną ilością dodanego analitu (wzbogacone w analit), (certyfikowane) materiały odniesienia, powtórzenia, analiza statystyczna zbiorów wyników pomiarów. 70
Walidacja Procedura może zostać poddana procesowi walidacji jedynie wówczas, gdy wcześniej została zoptymalizowana. Najpierw optymalizacja procedury Dopiero potem jej walidacja 71 Walidacja Proces walidacji procedury analitycznej powinien być poprzez sporządzenie raportu końcowego zawierającego: uwieńczony przedmiot i przeznaczenie procedury analitycznej (zakres jej stosowalności, rodzaj), podstawy metrologiczne, rodzaj analitu(ów) i skład matrycy, spis wszystkich wykorzystywanych odczynników, wzorców, materiałów odniesienia wraz z ich dokładną specyfikacją (czystość, jakość, producent, w przypadku syntezy w laboratorium dokładny opis tej syntezy), opis procedur służących do sprawdzania czystości stosowanych substancji i jakości wykorzystywanych wzorców, 72
Walidacja Proces walidacji procedury analitycznej powinien być poprzez sporządzenie raportu końcowego zawierającego: uwieńczony konieczne środki ostrożności, plan opisujący sposób przeniesienia procedury z warunków laboratoryjnych do pomiarów rutynowych, parametry procedury analitycznej, spis parametrów krytycznych tzn. tych, których niewielkie wahania mogą w sposób znaczący wpływać na wynik końcowy oznaczenia parametry wynikające z określenia odporności procedury analitycznej, wykaz wszelkiego rodzaju sprzętu laboratoryjnego wraz z ich cechami charakterystycznymi (wymiary, klasa dokładności itp.), schematy blokowe w przypadku skomplikowanych zestawów aparaturowych, 73 Walidacja Proces walidacji procedury analitycznej powinien być poprzez sporządzenie raportu końcowego zawierającego: uwieńczony szczegółowy opis warunków przeprowadzenia pomiarów z wykorzystaniem danej procedury analitycznej, opis procedury statystycznej (na etapie obróbki zbiorów wyników) wraz z wykazem równań i przeprowadzonych obliczeń, opis procedury kontroli jakości wyników (w przypadku analiz rutynowych), odpowiednie rysunki i wykresy np. chromatogramy, krzywe kalibracyjne, zgodność wyznaczonych parametrów procedury z założonymi wartościami granicznymi, 74
Walidacja Proces walidacji procedury analitycznej powinien być poprzez sporządzenie raportu końcowego zawierającego: uwieńczony wartość niepewności pomiaru analitycznego, kryteria, które należy spełnić w procesie rewalidacji, dane osoby, przeprowadzającej proces walidacji, spis wykorzystywanej literatury, podsumowanie i wnioski, potwierdzenie i podpis osoby odpowiedzialnej za sprawdzenie i zatwierdzenie procesu walidacji. 75 Walidacja Opracowano metodę oznaczania zawartości kadmu w próbkach kapusty. Próbki kapusty przygotowywano w następujący sposób: 1.Liofilizacja 2.Mineralizacja wspomagana promieniowaniem mikrofalowym z wykorzystaniem stężonego kwasu azotowego V 3.Otrzymany mineralizat rozcieńczano do objętości końcowej 25 cm 3 76
Walidacja Oznaczenie końcowe przeprowadzono z wykorzystaniem techniki GF-AAS, stosując aparat SavantAA Z firmy GBC. 77 PARAMETRY WALIDACYJNE - Precyzja -powtarzalność - precyzja pośrednia -odtwarzalność -Dokładność i poprawność - Granica wykrywalności i oznaczalności - Selektywność -Liniowość i zakres pomiarowy - Tolerancyjność i odporność -Niepewność 78
określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego Selektywny pomiar absorbancji przy charakterystycznej długości fali 228,8 nm i z zastosowaniem korekcji tła - wzdłużny efektu Zeemana określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY 79 określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego Cd, ppb absorbancja 0,4 0,132 0,4 0,127 0,4 0,141 0,8 0,268 0,8 0,271 0,8 0,258 1,2 0,403 1,2 0,411 1,2 0,408 1,6 0,521 1,6 0,542 1,6 0,538 2,0 0,678 2,0 0,689 2,0 0,692 określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY 80
określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY 81 Cd, ppb absorbancja 0,4 0,132 0,4 0,127 0,4 0,141 0,8 0,268 0,8 0,271 0,8 0,258 1,2 0,403 1,2 0,411 1,2 0,408 1,6 0,521 1,6 0,542 1,6 0,538 2,0 0,678 2,0 0,689 2,0 0,692 s = 0,0071 (sygnał!!!) s LOD 3, 3 b y = 0,3435x - 0,0069 LOD = 0,068 ppb LOQ 3 LOD LOQ = 0,20 ppb określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY zakres pomiarowy: 0,20 2,0 ppb 82
Cd, ppb absorbancja 0,4 0,132 0,4 0,127 0,4 0,141 0,8 0,268 0,8 0,271 0,8 0,258 1,2 0,403 1,2 0,411 1,2 0,408 1,6 0,521 1,6 0,542 1,6 0,538 2,0 0,678 2,0 0,689 2,0 0,692 s=0,0071, CV= 1,8% s=0,0068, CV= 0,85% s=0,0040, CV= 0,34% s=0,011, CV= 0,70% s=0,0074, CV= 0,37% określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY k 1 2 CV CV i CV = 0,96% k i 1 83 określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) Cd, mg/kg 1,84 1,81 1,75 1,60 1,66 średnia: 1,73 mg/kg s: 0,10 mg/kg u: 0,045 mg/kg s u n RAPORT WALIDACYJNY 84
określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) cert: 1,66 ± 0,07 mg/kg ozn: 1,73 ± 0,090 mg/kg określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY 85 R = 104,2% R x x ozn CRM 100% określenie selektywności (analiza próbek roztworów wzorcowych) wyznaczenie liniowości, LOD, LOQ, zakresu pomiarowego określenie powtarzalności U = 6,7% U k u 2 ( x x ozn ozn ) u x 2 2 ( x CRM CRM ) wyznaczenie precyzji pośredniej określenie selektywności (analiza próbek rzeczywistych) wyznaczenie dokładności (analiza próbek materiałów odniesienia) Poprawność = R U określenie odporności (np. porównania międzylaboratoryjne) RAPORT WALIDACYJNY Poprawność: = 104,2 ± 6,7% 86
Oznaczenia dla próbki rzeczywistej Cd, mg/kg 3,176 3,274 3,076 średnia = 3,175 mg/kg; s=0,099 mg/kg, CV= 3,1% masa próbki 0,50 g objętość mineralizatu 25 cm 3 rozcieńczenie: 1 5 (odpowiednie ph) autorozcieńczenie przyrząd 0,067 wynik odczytany z krzywej 0,846 ppb 87 Niepewność U k u 2 kal u 2 powt u 2 popr u kal = 2,0 % u powt = 1,8 % u popr = 3,2 % k = 2 U = 8,4 % u s u powt n popr U popr R / k Poprawność: = 104,2 ± 6,7% WYNIK = 3,18 ± 0,27 [mg/kg] 88
Raport.. 89